A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Câncer epitelial de ovário (EOC) é a causa mais comum de morte por neoplasia ginecológica, com uma estimativa de 21,290 novos diagnósticos em os EUA em 2015 e uma estimativa de 14,180 mortes ^1. A grande maioria (> 75%) das mulheres são diagnosticadas com a doença de fase final (fase III ou IV), caracterizado por difuso metástases intra-peritoneal e mau prognóstico. A recorrência da doença na cavidade peritoneal na sequência da primeira linha de quimioterapia também é comum e representa uma das principais causas de mortalidade ^2,3. EOC metastasizes por um único mecanismo envolvendo tanto extensão directa do tumor primário para órgãos peritoneais vizinhas, assim como pela dissociação ou derramamento de células da superfície do tumor primário, como células individuais ou agregados multicelulares. As células são vertidos para dentro da cavidade peritoneal, em que eles resistir apoptose induzida por descolamento ^4. Acúmulo de ascite peritoneal é comum, como as células tumorais derramam bloquear a drenagem linfática peritoneal e tumors produzem fatores de crescimento que alteram a permeabilidade vascular. Uma porção de células tumorais vertente anexar à superfície de órgãos e estruturas peritoneais incluindo intestino, fígado, mesentério e omento, após o que ancorar e proliferam para produzir múltiplas lesões secundárias amplamente disseminadas ^3,5. metástase hematogênica é incomum. Assim, a gestão clínica comumente consiste em cirurgia cytoreductive incluindo "debulking óptima", definida como a ressecção de todo o tumor visível (não importa quão pequena). Citorredução completa está associada a um aumento significativo na sobrevivência global ^6,7 e está associada com o desafio da identificação e da remoção de lesões <0,5 cm.

modelos animais pequenos têm demonstrado utilidade na pesquisa do câncer de ovário em melhorar o nosso entendimento da progressão da doença, bem como em identificação de biomarcadores de prognóstico e ensaio de novas quimioterapias ou abordagens de terapia de combinação. À medida que o primáriolocal de incidência de câncer de ovário e metástase é a cavidade peritoneal, modelos ortotópicos de EOC metástase envolvem a análise e caracterização da doença intraperitoneal. Embora tenha havido recentes melhorias na capacidade de células tumorais imagem, mesmo ao nível de uma única célula, ainda existem dificuldades significativas na quantificação da carga de tumor metastático de EOC. Estes desafios surgem devido ao número, tamanho e localização anatômica das lesões metastáticas. Além disso, existe uma necessidade para células de cancro da etiqueta para distingui-las das células hospedeiras normais. Estudos anteriores utilizaram protocolos de rotulagem baseadas em anticorpos ou a transfecção de células de tumor com ^8,9 luciferase. A marcação directa fluorescente de células cancerosas foi relatada pela primeira vez por Chishima e colaboradores em 1997 ^10. Os marcadores fluorescentes não necessitam de adição de substrato exógeno e proporcionar especificidade de células tumorais requintado, proporcionando um meio mais eficaz para controlar metástases de cancro ^11,12

Aqui nós descrevemos um método de imagem óptico para análise quantitativa de doença metastática utilizando um modelo de xenoenxerto ortotópico singênico composta de proteína fluorescente vermelha (RFP) tagged ID8 células de câncer de ovário murino ¹³ e camundongos C57 / Bl6 imuno-competente. Nós demonstramos um método novo para a quantificação da carga tumoral em relação combinar imagens in vivo e ex vivo com a remoção de tecido auto-fluorescência. Esta abordagem tem uma utilidade potencial em estudos destinados a avaliar o efeito do específica genética, epigenética ou micro-ambientais modificações e / ou modalidades de tratamento específico nas metástases de órgãos de cancro do ovário.

Todos os estudos in vivo foram aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e usado feminino camundongos C57 / BL6J.

Cultura de Células 1. Murino cancro do ovário

1. Adicione o meio de cultura ID8 murino ovário de células de cancro da seguinte forma: 1 L de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 4% de Soro Bovino Fetal (FBS), 1% de Penicilina / Estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina e 5 ng / ml de selenito de sódio.
2. Transdução ID8 células de câncer de ovário murino ¹³ para expressar Red Fluorescent Protein (RFP), utilizando partículas lentivirais comercialmente adquiridos expressam RFP e um marcador de selecção (blasticidina gene). Note-se que a proteína fluorescente verde pode ser usado, mas fornece um sinal de fluorescência mais fraca.
   1. Imediatamente antes da transdução, as células de cultura a 50 - 70% de confluência e adicionar meio fresco (sem penicilina / estreptomicina) que inclui 1 ml de polibreno (5 ug / ml final,concentração).
   2. Suavemente pipeta RFP-lentivírus (20 mL) gota a gota para o prato e incubar a 37 ^° C durante 72 horas. Remova o meio e incubar com meio fresco durante 24 h. Comece a selecção de células transduzidas por adição de blasticidina para o meio de cultura (5 ug / ml) e monitor para células vermelhas através de microscopia de fluorescência (Figura 1).
3. Cultura das células marcadas com RFP em forma ID8 por sementeira de aproximadamente 10 ⁶ células num prato de cultura de tecidos e visualizando diariamente utilizando um microscópio de luz, até que a monocamada de células é confluente.
4. Quando confluentes, colher as células utilizando tripsina (0,25%, 3 min) e devolver o balão para a incubadora a 37 C até que ^o as células são separadas.
5. Neutraliza-se a tripsina com 6 mL de meio de cultura contendo soro de ID8. Pipeta cima e para baixo contra o fundo do prato, em seguida, transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar a 1200 rpm durante 2 min, em seguida, aspirar o meio utilizando uma glpipeta ass.
6. Lavam-se as células com tampão fosfato salino (PBS) por ressuspensão suave em 6 ml de PBS morno e centrifugação como em 1.5 acima. Re-suspender em PBS para uma concentração final de 5 x 10 ⁶ células / ml. Manter as células quentes (37 ^° C) até injeção.

2. intra-peritoneal injecção de células ID8 e in vivo de imagens

1. Injectar cada ratinho, com 2 ml de solução de ID8-PBS quente para um total de 10 milhões de células por via intra-peritoneal (ip). Permitir que as células tumorais a crescer in vivo, durante cerca de 10 semanas, com imagens ao vivo semanal.
2. Imediatamente após a injecção e cada semana depois disso, pesar os ratos e depois anestesiar cada rato usando isofluorano (taxa de fluxo de 2,5% em 0,5 L / min O ₂ de fluxo). Nota: Os ratinhos foram pesados, e não como uma medida quantitativa da carga tumoral, mas sim uma medida mais geral de ratinho individual progressão física ao longo do estudo. camundongos pesamts foram comparados com os seus próprios valores de peso anteriores.
   1. Anestesiar ratos, colocando em uma câmara de isoflurano. Manter a anestesia constantes durante a digitalização posicionando a cabeça de rato no nariz-cone para a exposição ao isoflurano caudal de 2,5% durante todo o procedimento.
3. Use creme depilatório para remover os pêlos do torso e do abdome de cada rato, como o cabelo preto fará com que a atenuação do sinal de fluorescência. Os ratinhos são banhadas com água morna, após a aplicação do creme depilatório e secou-se com toalhas de papel RT.
4. Enquanto anestesiados, digitalizar todo o corpo de cada rato usando um sistema de imagem óptico de pequenos animais. Verificar todos os ratos em uma coorte em cada ponto de tempo. Use o seguinte dois protocolo passo (Figura 2A):
   1. No Passo 1, para observar as células tumorais marcadas por fluorescência (RFP), executar aquisição multi-espectral para recolher um total de 5 imagens usando filtros de excitação de 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm e 540 nm e um filtro de emissão de 600 nm. Utilize os seguintes parâmetros de aquisição: a exposição padrão de 15 segundos, 2 x 2 binning, FOV de 160 mm e f _parada de 1,1.
   2. No Passo 2, para observar o animal inteiro, adquirir uma imagem de reflectância usando um filtro aberto de excitação (luz branca), um filtro de emissão aberta, uma exposição padrão de 0,2 seg com 2 x 2 e arrumação de um FOV de 16 cm. Nota: O tempo de imagem efectivo é de ~ 1 min.

3. Rato Dissecção e Aquisição de Imagem

1. Quando imagens ao vivo mostra a presença de doença intra-peritoneal ou animais acumulação extensiva exposição de ascite (como evidenciado pela distensão abdominal), perda ou ganho de peso corporal superior a 20%, letargia ou outros sinais de aflição, eutanásia cada rato usando CO ₂ anestesia seguida de deslocação cervical.
2. Cortar a pele anteriormente ao longo da linha média ventral do rato, usando dissectio pontasn tesoura, a partir da parte superior das coxas para a parte inferior da caixa torácica. Tome muito cuidado para cortar apenas a camada da pele (Figura 2BI). Delicadamente separar a pele do tecido peritoneal, tendo a certeza de não perfurar a parede peritoneal.
3. Com uma tesoura de dissecação, cortados pontiagudas tanto lateralmente ao longo da parte inferior da caixa torácica e na parte superior das coxas para criar duas abas de pele (Figura 2B II, III).
4. Coloque cada rato em seu lado ventral (cavidade peritoneal voltada para baixo) com as abas de pele abriu e digitalizar cada rato com seus órgãos in situ usando o pequeno sistema de imagem óptico do animal (Figura 3A, B).
   1. Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem, conforme descrito no 2.4.1.-2.4.2.
5. Continuar dissecando o rato através da extracção de órgãos peritoneais individuais, incluindo fígado, omento / pâncreas, estômago, diafragma, intestino delgado, intestino grosso, à esquerda e à direita do peritoneu, ovários, kidneys, mesentério e almofada de gordura.
   1. Observe, enumerar e registrar tumores visíveis em cada órgão. Use uma pinça para medir o diâmetro de cada tumor.
   2. Designar tumores inferior a 2 mm de diâmetro tão pequeno, de entre 2 e 5 mm como meio e superior a 5 mm, como grande.
6. Colocar os órgãos sobre o modelo de varrimento do órgão (Figura 4) que identifica um local pré-determinado para cada órgão. Use PBS para manter os órgãos úmido.
7. Digitalizar cada folha de órgãos que utilizam o pequeno sistema de imagem óptico do animal (Figura 3C, D).
   1. Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem como descrito no passo 2.4.
8. Após a digitalização, órgãos lugar em formol a 10% para permitir o processamento posterior para histologia.

4. Quantificação da carga tumoral em the fluorescência Imagens

1. A fim de reduzir a quantidade de auto-fluorescência em cada varrimento multi-espectral, primeiro unmix os ficheiros utilizando software disponível com o sistema de imagiologia de pequenos animais.
   1. Carregar pela primeira vez a RFP: No arquivo espectral Vivo, seguido pelo Autofluor: No arquivo Vivo Vermelho na janela de Unmixed Imagens e selecione Unmix.
2. Exportar os arquivos .bip como formato de 16 bit .tiff (sem escala).
3. Use software ImageJ (órgãos ex vivo e, em seguida, o corpo inteiro do rato com órgãos in situ).
   1. Use File> Open para abrir os arquivos .tiff 16 bits dos arquivos de modelo de digitalização órgão em ImageJ.
   2. Sob Image> Adjust> Brightness / Contrast, optar por definir o valor mínimo exibido para 0 e o valor máximo exibido para 35.353 e depois sobImagem> tabelas de pesquisa, selecione Red Hot. Nota: Vários modelos animais irá requerer diferentes níveis de brilho, mas é importante para manter o brilho consistente ao longo de um determinado estudo.
   3. Usando a ferramenta Freehand Selection, desenhe uma região de forma livre da seleção interesse (ROI) em torno de cada órgão e usar a ferramenta Measure (CTRL + M) para calcular a área de superfície de cada órgão; gravar a área de superfície de cada órgão em uma planilha.
   4. Com o ROI desenhada em torno de cada órgão, clique direito dentro do ROI e selecione Duplicar para incluir apenas o órgão.
   5. Enquanto olha para o órgão indivíduo, sob Image> Adjust> Threshold, optar por definir o limiar da imagem para um limiar menor nível de + 1200 e um limite de Nível Superior de + 1,700 para selecionar only regiões mais brilhantemente fluorescentes e verificar para seleccionar fundo escuro; selecione OK. Nota: As imagens podem exigir manipulação manual dos controles deslizantes de limiar em ImageJ para que as áreas anteriormente brilhantes são selecionados para a etapa de análise, como mostrado acima. Diferentes modelos de doença irá requerer diferentes constrangimentos de limiar, mas é importante para manter os níveis de limiar consistentes ao longo de um determinado estudo.
   6. Sob Analisar> Analisar Partículas, altere o Tamanho (pixels ^ 2) a 10 Infinito, optar por mostrar: esboços, verificar para selecionar apenas "Mostrar resultados" e clique em OK para medir ambas as áreas e densidades integrados matérias destas regiões brilhantes, tumores considerados.
   7. Grave os valores de área de superfície ea densidade Raw Integrado de cada seleção tumor exibido no
   8. Sob Analisar> Ferramentas> Calibragem Bar, adicionar uma barra de escala de calibração para as imagens dos órgãos. Nota: Neste exemplo, isso foi feito mudando o local para superior direito, a cor de preenchimento de preto, a cor do rótulo de White, o número de etiquetas a 5, as casas decimais para 0, o tamanho da fonte para 12 e o Zoom fator para 4,0 e permitindo texto em negrito.
   9. Em Arquivo> Salvar como ..., salvar a montagem como um .tiff e .jpeg.
   10. Use File> Open para abrir o arquivo .jpeg dos órgãos e, em seguida, em Inserir> Caixa de Texto
   11. Use File> Open para abrir cada uma das ficheiros.tiff 16 bits dos scans de corpo inteiro em ImageJ a ordem do número mouse.
   12. Sob Image> Adjust> Brightness / Contrast, optar por definir o valor mínimo exibido para 0 e o valor máximo exibido para + 35353 e depois em Imagem> tabelas de pesquisa, selecione Red Hot.
   13. Em Arquivo> Salvar como ..., salvar a montagem como um. Tiff e .jpeg.

Análise 5. Os dados

1. Adicionar as áreas de selecção de tumor e as densidades de matérias-integrados, respectivamente, para cada órgão de cada rato e registar a área total do tumor para cada ratinho de órgãos.
2. Normalizar a área gravada e integrat cruaOs valores de densidade ed para o tamanho de cada órgão pela divisão da área total da lesão e valores de densidade integrados matérias totais pela área de superfície do órgão correspondente (Tabela 1).
3. Calcular e representar graficamente a média de ambas as áreas de superfície do tumor normalizados e os valores de densidade em bruto integrados normalizadas (Figura 5A, B).
4. Comparar estes valores médios para as obtidas por contagem visual os tumores que eram visíveis a olho nu durante a inspecção de cada órgão de lesões metastáticas.

O mecanismo metastático do câncer de ovário é caracterizada por metástase intra-peritoneal altamente difuso composto por numerosas lesões de tamanhos variados, incluindo múltiplas (<2mm) pequenas lesões. Assim, a utilização de células tumorais marcadas com RFP (Figura 1) e imagiologia óptica fornece um método alternativo para a contagem manual e medição do tamanho da lesão. O desenvolvimento do peso do tumor ao longo do tempo pode ser determinada por pesagem semanal de ratos e medição da circunferência abdominal para medir potencial presença de ascite. In vivo imagiologia óptica proporciona uma abordagem complementar para avaliar a carga tumoral (Figura 2). O câncer de ovário metastasizes para vários sites na cavidade peritoneal e condutores moleculares de metástases site-specific são presentemente desconhecidos. Além disso a determinação da carga total de tumor, após o sacrifício cuidadosa dissecação pode ser realizado para avaliar e quantificar PA site-specifictterns de metástases. Assim, imageamento óptico de órgãos peritoneais in situ (Figura 3A, B), combinada com a avaliação ex vivo de órgãos individuais (Figura 3C, D) pode fornecer dados úteis sobre geral vs carga tumoral específico do órgão. Os exames apresentados na Figura 3 representam os resultados de digitalização das cavidades abdominal e órgãos individuais de ratos com vários graus de carga tumoral. Por exemplo, a Figura 3C mostra a carga de tumor mais no omento / pâncreas, ovários e mesentério de rato A. Quando comparado com os mesmos órgãos em B de ratinho, uma diferença significativa no sinal é visto (Figura 3D). A utilização do modelo de varrimento de órgãos (Figura 4) auxilia na identificação de carga tumoral específico do órgão. A observação da carga tumoral diferencial é confirmada quantitativamente tanto em termos de área de superfície do tumor e a intensidade de sinal do tumor (Tabela 1, Figura 5).

Figura 2 e 3 ilustram a vasta gama de carga de tumor que podem ser visualizados e quantificados utilizando este método. Os dados da Tabela 1 ilustra este grande gama de aplicabilidade na quantificação tanto a área de superfície do tumor e a intensidade de sinal do tumor. Por exemplo, quando se olha para o omento / pâncreas de rato A comparada à de B de ratinho, a área de superfície do tumor normalizada é 26 vezes maior do que no rato Um rato B. Além disso, a grande gama de intensidade de sinal é também exemplificado no omento / pâncreas de ratos A e B; a densidade em bruto normalizada integrada de Rato A é 56 vezes maior do que a do rato de B. Estes resultados demonstram a eficácia dos Comparing a carga tumoral de vários indivíduos de teste, em relação à outra, em termos de área de superfície do tumor e a intensidade de sinal do tumor, utilizando-se este método rápido, que não requer mais análise histológica.

Figura RFP expresso. (A) imagem 1. Células ID8 Murino do cancro do ovário Fase de células ID8. (B) imagem de fluorescência de células ID8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagem Óptico ao vivo de C56 / BL6 rato com a carga tumoral intra-peritoneal. (A) creme depilatório foi usado para remover hai r a partir da superfície ventral do rato antes da digitalização. (B) Diagrama mostrando linha média ventral inicial e incisões laterais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Endpoint Digitalização de Intra-peritoneal carga tumoral. (A, B) Os ratos são primeiro fotografada com os órgãos in situ (lado ventral para baixo) após a abertura da superfície ventral do mouse. (C, D) de imagens de órgãos individuais. Cada órgão é dissecado, carga tumoral Visual gravada, e colocado no molde de varrimento para a análise de órgãos.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Modelo de Digitalização Organ. órgãos dissecados são colocados sobre o modelo de varrimento órgão manter a identificação posicionai dos órgãos individuais durante a digitalização.

.. Foram analisados ​​Figura 5. Normalizada Dados Quantitativos para o Omento / Pâncreas, ovários e Mesentery dados, como descrito no protocolo e como mostra a Tabela 1 Rato Um refere-se ao rato digitalizada em 3A painel; rato B refere-se ao rato digitalizada no 3B do painel. (A) área de tumor normalizada. A análise da fluorescência do sinal quantificação destes três órgãos foi realizada e quantificada em termos de um ráciode área de superfície do tumor para a área de superfície do órgão inteiro para ambos os ratos. (B) Normalizado densidade integrada cru. Fluorescência análise quantificação do sinal destes três órgãos foi realizada e quantificada em termos de um rácio de densidade integrada em bruto para a área de superfície do órgão inteiro para ambos os ratinhos.

Tabela 1. Tumor Normalizada Area e normalizada RawValores de densidade integradas no omento / Pâncreas, ovários e Mesentery de ambos Rato A e B. mouse Pós dissecção e digitalização, cada órgão foi segmentada e sua fluorescência quantificada para determinar a proporção da área do tumor para a área de superfície total do órgão e as intensidades da fluorescência para essas áreas tumorais. Omento / pâncreas, ovários e mesentério foram selecionados como eles tinham os sinais de fluorescência mais fortes dentro de ambos os grupos de controlo positivos e negativos.

Este artigo é parte de uma edição especial on Imaging Multimodal pré-clínica, patrocinado pela Bruker Biospin.