Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

Resumo

Mostramos a preparação e abordamos a viabilidade de veículos celulares contendo nanobastões de ouro para a imagem fotoacústica do câncer.

Resumo

nanorods ouro são atraentes para uma variedade de aplicações biomédicas, tais como a ablação fototérmico e a imagiologia de cancro fotoacústica, graças à sua intensa absorvância óptica na janela de infravermelho próximo, de baixa toxicidade e potencial de repouso em tumores. No entanto, a sua entrega aos tumores continua a ser um problema. Uma abordagem inovadora consiste no aproveitamento do tropismo de macrófagos associados a tumores que podem ser carregados com ouro nanorods in vitro. Aqui, descrevemos a preparação ea inspeção fotoacústica de veículos celulares contendo nanobastões de ouro. nanorods ouro PEGilados são modificados com compostos quaternários de amónio, a fim de alcançar um perfil catiónico. Em contacto com macrófagos murinos em pratos de Petri normais, estas partículas encontram-se submeter a absorção maciça em vesículas endocíticas. Em seguida, estas células são incorporadas em hidrogéis biopolimêricos, que são usadas para verificar que a estabilidade da conversão fotoacústicadas partículas é retido na sua inclusão em veículos celulares. Estamos confiantes de que estes resultados podem fornecer uma nova inspiração para o desenvolvimento de novas estratégias para entregar partículas plasmonic a tumores.

Introdução

Durante a última década, várias partículas plasmonic como nanobastões de ouro, nanoshells e nanocages, têm recebido uma atenção considerável para aplicações em óptica biomédica ^{1, 2, 3, 4.} Em desacordo com nanoesferas de ouro padrão, estas partículas mais recentes ressoam na janela do infravermelho próximo (NIR), que prevê mais profunda penetração óptica através do corpo e maior contraste óptico mais componentes endógenos ^1. Este recurso tem despertado interesse para aplicações inovadoras, tais como a fotoacústica (PA) de imagem e a ablação fototérmica de câncer. No entanto, vários problemas restringir a penetração clínica destas partículas. Por exemplo, a sua activação óptico tende a induzir o seu sobreaquecimento e modificar suas formas funcionais para com perfis mais esféricas, que dirige um photoinstability ^{5, 6, 7, 8} sup>, ^9. Outra questão que domina o debate científico é a sua entrega sistémica em tumores. Em particular, nanobastões de ouro combinam tamanhos que são ideais para permear tumores que exibem permeabilidade aumentada e retenção e facilidade de conjugação com sondas específicas de marcadores malignas. Portanto, a sua preparação para uma injecção directa na corrente sanguínea é percebida como um sistema viável ^{10, 11, 12, 13.} No entanto, este procedimento continua a ser problemática, com a maioria das partículas tornar-se capturado pelo sistema de fagócitos mononucleares ^{10, 11, 12.} Além disso, outra preocupação é a estabilidade óptica e bioquímica das partículas após a circulação através do corpo ^14. Quando as partículas perdem sua estabilidade coloidal e agregados, as suas características plasmonic e dinâmicas de transferência de calor pode sofrer de acoplamento plasmonic ^{15, 16, 17} e cross-superaquecimento ^18.

Mais recentemente, a noção de explorar o tropismo de macrófagos associados a tumores emergiu como uma alternativa inteligente ^{19, 20, 21.} Estas células manter uma capacidade inata para detectar e permeiam tumores com alta especificidade. Portanto, uma das perspectivas pode ser a de isolar essas células de um paciente, carregá-los com nanobastões de ouro in vitro e depois injetá-las de volta para o paciente, com a intenção de usá-los como veículos celulares responsáveis ​​pela entrega. Outra vantagem seria a ganhar mais controle sobre a estabilidade óptica e bioquímica das partículas, por causa de sua interface biológica seria construída in vitro. Ainda assim, os desempenhos destes veículos celulares como agentes de contraste óptico precisa de uma análise crítica.

Neste trabalho, nós descrevemos a preparação e questões críticas de Cellulveículos AR contendo nanobastões de ouro para a imagem PA de câncer. Nanorods ouro PEGilados são modificados com compostos de amónio quaternário ^22, a fim de obter um perfil de catiónico que é esperado para promover as suas interacções com membranas plasmáticas ^{23, 24.} Estas partículas passam por absorção eficiente e inespecífica da maioria dos tipos celulares, esperançosamente sem interferir muito com as suas funções biológicas. macrófagos murinos são carregados com até um máximo de 200, 000 nanobastões de ouro catiônicos por célula, que se tornam situam no interior de vesículas de endocitose apertados. Esta configuração deve surgir preocupação, por causa da ameaça de acoplamento plasmonic e cross-sobreaquecimento dentro destas vesículas. Portanto, os macrófagos são incorporados em hidrogéis biopolimêricos que imitam tecidos biológicos, a fim de verificar que a maior parte da estabilidade do PA conversão das partículas é retido na transferência do meio de crescimento para as vesículas endocíticas. effectivcritérios de medição e são trabalhados, a fim de medir a estabilidade da conversão PA em condições de interesse imediato para a imagem latente PA. Um limiar remodelar está configurado bem no início da instabilidade óptica após um trem de 50 pulsos de laser com a taxa de repetição típico de 10 Hz.

Estamos confiantes de que estes resultados podem dar um impulso para o desenvolvimento de novas estratégias para entregar partículas plasmonic a tumores.

Protocolo

Nota: Todas as concentrações de ouro nanorods são expressos em termos de Au molaridades nominais. Para efeito de comparação com outras obras, note que 1 M Au corresponde aproximadamente a 20 um nanobastões de ouro, no nosso caso.

1. Preparação de Cationic ouro nanobastões

Nota: O método começa com a síntese de brometo de cetrimónio (CTAB) nanorods ouro -capped por a redução autocatalítico de HAuCl ₄ com ácido ascórbico, de acordo com o protocolo apresentado por Nikoobakht et al ²⁵ e adaptado de acordo com Ratto et al ^26... Em seguida, esses nanobastões de ouro são modificados, a fim de ganhar mais biocompatibilidade e afinidade para membranas plasmáticas, pela combinação de polietilenoglicol vertentes ^{10, 11, 27, 28} e compostos de amônio quaternário ^22.

1. Purificar 24 ml CTAB-tampado nanobastões de ouro em um ConcentraçãN de 450 uM Au por dois ciclos de centrifugação (12000 xg, 30 min) e decantação. Certifique-se de que a razão entre o volume morto para o volume inicial é de cerca de 1/200 ou inferior para todos os passos de centrifugação neste protocolo. Use CTAB 500 uM aquoso tal como uma solução de lavagem e, finalmente, transfere as partículas em tampão de acetato de 6 ml de 100 mM a pH 5, contendo 500 uM de CTAB e 0,005% (v / v) de polissorbato 20.
2. Adicionar 30 ul de 10 mM de solução aquosa de alfa-metoxi-omega-mercapto-poli (etilenoglicol) (PM ~ 5000) e deixar a reagir durante 30 min a 37 ° C.
3. Adicionar 30 ul de 100 mM de (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N-brometo de trimetilamónio em sulfóxido de dimetilo e deixar em repouso durante 24 h a 37 ° C.
4. Em seguida, adicionar 18 mL de 0,005% (v / v) de polissorbato 20 em água e purifica-se estas partículas por quatro ciclos de centrifugação (12000 xg, 30 min) e decantação. Use 0,005% (v / v) de polissorbato 20 em água como solução de lavagem e, finalmente, transfere as partículas em 2,4 ml de PBS estéril, a pH7.4. A concentração nominal final do ouro é de 4,5 mm.

2. Carregamento de Murino macrófagos com ouro nanobastões

1. Utilizar a linha de células de monócitos / macrofágica J774A.1 e DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1 mM, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina como meio de cultura. Placa de 5 x 10 ⁵ células em quatro placas de Petri de 60 mm de diâmetro e permitir-lhes crescer durante 24 h, de modo a ser subconfluentes no momento de desprendimento (ver passo 2.2).
   1. Durante todo o protocolo, manter as células em condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de _CO2, 95% de ar e 100% de humidade relativa). Use uma câmara de fluxo laminar e equipamentos de proteção pessoal adequado para manipular as células.
2. Após 24 h, carregar as células com nanobastões de ouro catiônicos e prepará-los para ser incorporado em filmes de quitosana:
   1. A fim de permitir que as partículas a ser absorvido pelas células, adiciona-se uma alíquota de 4,5Au mM nanorods ouro catiónico em PBS em cada caixa de Petri, de modo a atingir uma concentração final de 100 uM de Au. Deixar os pratos de Petri em incubação durante 24 horas.
   2. Em seguida, observe as células sob um microscópio óptico para confirmar as suas boas condições eo upload. As células devem exibir a sua morfologia normal e um número de vesículas intracelulares escuras. Separe as células por um raspador, fundir os de duas placas de Petri, a fim de alcançar uma quantidade adequada de células para os seguintes passos (pelo menos 2 x 10 ⁶ células), e centrifuga-se-lhes (120 xg, 6 min) para eliminar quaisquer excesso de ouro nanorods catiónicos. O pellet celular deve olhar quase preto.
   3. Suspende-se o sedimento em 2 ml de PBS e contar as células pela utilização de uma câmara de Burker. Centrifugar a suspensão contendo 2 x 10 ⁶ células (120 x g, 6 min) e fixar sua sedimento em 2 ml de 3,6% (w / v) de formaldeído em PBS, durante dez minutos à temperatura ambiente. Finalmente, lavar este sedimento três vezes por centrifugatde iões (120 xg, 6 min), a fim de remover o fixador. Use PBS como solução de lavagem.

3. incrustação de macrófagos em Películas de quitosano

Nota: As propriedades peculiares de quitosana ^{26, 27, 28, 29} são exploradas para produzir fantasmas biomiméticos que contêm macrófagos corados com nanobastões de ouro catiônicos. No que diz respeito a outros hidrogeles, tais como agarose, quitosano permite filmes que são muito mais forte e mais fino, que é crítico para microscopia PA ^6. A fabricação desses fantasmas é realizada de acordo com protocolos anteriores ^{29, 30, 31,} com algumas modificações, conforme prescrito no os seguintes ^30.

1. Prepara-se uma acidificada (pH 4,5, obtidos por adição de ácido acético) e viscoso 3% (w / v) de quitosano de baixo peso molecular (PM médio de 120 kDa) solução, misturá-lo completamente edeixá-lo homogeneizar durante 24 h a 40 ° C.
2. Em seguida, misturar macrófagos de murino contendo ouro nanorods catiónico (2 X 10 ⁶ células) com 500 ul de solução de quitosano.
3. De modo a obter ~ 50 um de espessura fantasmas, despeje 250 mg da mistura em moldes de 1,91 cm ² de poliestireno e deixá-los sob uma corrente de azoto durante 24 h. Posteriormente, o tratamento destas amostras com 500 uL de NaOH 1 M, de modo a induzir a reticulação, e lavá-los com 10 ml de água ultrapura.

4. Teste de Estabilidade Conversão de Fotoacústica

Nota: A estabilidade da conversão PA é investigada por meio de experimentos PA com a instalação de fabricação caseira que é descrito na ref 6.

1. Suspender um filme de quitosano contendo os macrófagos em água desionizada, por exemplo, pelo uso de um suporte de plástico imersas em uma placa de Petri, de modo a manter uma distância de aproximadamente 5 mm da parte inferior da placa. Coloque esta placa em um estágio XY micrométricaa fim de controlar a posição da amostra.
2. Concentre-se um feixe de laser com ~ 5 duração nseg pulso em ressonância com a banda plasmónico longitudinal dos nanorods ouro (por exemplo, a partir de um oscilador paramétrico óptico bombeado pela terceira harmónica de um laser de Nd comutação-Q: YAG com o comprimento de onda de 400 - 2500 nm e duração de impulso de 5 ns) perpendicular à superfície da película com um diâmetro do ponto ~ 300 uM.
   1. Coloque um atenuador em frente da saída do laser para ajustar a fluência do laser e utilizar um divisor de feixe para incidir parte do feixe de laser a um medidor de energia (por exemplo, um detector piroeléctrico) e monitorizar as flutuações de fluência. Manter a fluência óptica abaixo de ~ 1 mJ / ^cm2, por impulso durante o alinhamento. Utilize óculos de segurança a laser adequada sempre que o laser é ligado.
3. Mergulhar um transdutor de ultra-sons (gama de frequência de 1 - 20 MHz) para a placa de Petri ~ 2 milímetros fora da superfície da película e ajustar a sua posição utilizando as traduções micrométricase fases de rotação para maximizar o sinal PA emitida a partir do filme.
4. Determinar uma fluência sonda F _LO que não danificar a amostra ^6:
   1. Irradiar um ponto aleatório da amostra a uma fluência de cerca de 1 mJ / ^cm2, por impulso de pelo menos 500 pulsos. Para cada pulso, PA adquirir o sinal correspondente a partir do transdutor de ultra-sons e de fluência laser a partir do medidor de energia com um osciloscópio. Nomeie a fluência médio como ^teste F _LO.
   2. Calcular a intensidade do sinal de PA como a sua amplitude de pico-a-pico em função do número de impulsos. A fim de contrabalançar as flutuações de intensidade de laser, normalizar a amplitude de cada sinal de PA para o rácio do seu próprio fluência a ^julgamento F _LO. Analisar a tendência de a intensidade normalizada PA como uma função do número de impulsos e verificar a sua estabilidade ao longo do tempo.
   3. No caso de instabilidade, repita os passos 4.4.1 a 4.4.3 com um valor menor de F _LO ^{julgamento. No caso de estabilidade, repeti-los com um valor de ensaio F _LO superior em ~ 10%, até uma perda de estabilidade surge. Defina a sonda fluência F _LO como o segundo valor mais alto de julgamento F _LO, que garante estabilidade.}
5. Meça uma fluência limiar reformulação:
   1. Escolha outro ponto aleatório da amostra e sondar uma intensidade PA média (I _LO ^a) mais de 500 pulsos a F _LO.
   2. Definir uma fluência nominal superior a F _LO e entregar 50 pulsos. Nome sua influência média, como F _exc.
   3. Sondar uma intensidade média PA (I _LO ^b) mais de 500 pulsos a F _LO mais uma vez. Calcular a relação R = I _LO ^b / I _LO ^a. Um valor de R abaixo da unidade dá provas de uma alteração irreversível das propriedades ópticas da amostra.
   4. Utilizar a plataforma XY micrométrico para mover o filme e alterar o poinT da amostra ao acaso. Repita os passos 4.5.1 a 4.5.4 com diferentes valores de F _iva, de modo a levar alguns valores de R abaixo, em torno e acima da unidade. 15 pontos são razoáveis.
   5. Lote R como função de F _exc e identificar o limite de fluência F remodelação _th como valor que quando R começa a variar de um para além incerteza estatística. ⁶

Resultados

Aqui, a viabilidade de veículos celulares contendo nanobastões de ouro para a imagem PA de câncer é mostrado juntamente com resultados típicos de protocolo.

As imagens por MET da Figura 1 mostram o aspecto habitual das partículas após o passo 1 e os seus veículos celulares após o passo 2. A preparação das partículas e das células para imagiologia MET é descrita ^na literatura ^17. nanobastõ...

Discussão

A noção alvejar macrófagos associados a tumores está a emergir como um conceito poderoso para combater o câncer ^{34, 35, 36.} Aqui, em vez de sua destruição, essas células são recrutados como veículos celulares para trazer nanobastões de ouro em um tumor, pela exploração do seu tropismo. Esta perspectiva requer um design inteligente das partículas, a sua integração nas células e sua caracterização. Verificou-se que a fotoestabilidade de macrófagos murinos carregados c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Brometo de hexadeciltrimetilamônio	Sigma-Aldrich	H6269	Para sintetizar nanobastões de ouro
Cloreto de ouro (III) trihidratado	Sigma-Aldrich	520918	Para sintetizar nanobastões de
ouro Nitrato de prata	Sigma-Aldrich	S6506	Para sintetizar nanobastões de ouro
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A5960	Para sintetizar nanobastões de ouro
Borohidreto de sódio	Sigma-Aldrich		Para sintetizar nanosementes de ouro
MeO-PEG-SH	Iris Biotech	PEG1171	Para PEGylate nanobastões de ouro. Peso molecular de cerca de 5.000 Da.
Ácido acético	Sigma-Aldrich	320099	Para PEGilato nanobastões de ouro e solubilize quitosana
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S8750	Para PEGilato nanobastões
de ouro (11-Mercaptoundecil) -N, N, N< / em> brometo de trimetilamônio	Sigma-Aldrich	733305	Para modificar nanobastões de ouro com compostos de amônio quaternário
Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich		276855	Para solubilizar (11-mercaptoundecil) -N, N, N< / em>-trimetilamônio brometo
Polissorbato 20	Sigma-Aldrich	P2287	Para centrifugar nanobastões de ouro PEGulado
PBS	Lonza	BE17-516F	Para suspender nanobastões de ouro antes da incubação com células e para tratar pellets de células
J774a.1	ATCC	TIB-67	Linha celular murina de monócitos / macrófagos
DMEM	Lonza	BE12-707F	Meio de cultura celular
FBS	Lonza	DE14-801F	Para ser adicionado ao meio de cultura celular
L-glutamina	Lonza	BE17-605E	Para ser adicionado ao meio de cultura celular
Penicilina/estreptomicina	Lonza	DE17-602E	Para ser adicionado ao meio de cultura celular
Placa de Petri	NEST	705001	Cultura celular prato
Raspador de células	EuroClone	ES7018	Para separar células
Formaldeído	Fluka	47630	Para fixar células
Quitosana, baixo peso molecular	Sigma-Aldrich	448869	75-85% desacetilado. Peso molecular de cerca de 120.000 Da.
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	306576	Para insolubilizar a quitosana e gerar o hidrogel
Placas de cultura de células de poliestireno	NEST	702011	Usado como moldes para fabricar hidrogéis de quitosana
Oscilador paramétrico óptico bombeado pelo terceiro harmônico de um laser Q-switched Nd:YAG	Continuum, Santa Clara, EUA	Surelite OPO plus	Fonte de excitação óptica para testes fotoacústicos
Detector piroelétrico	Gentec, Quebec, Canadá	QE8SP	Para monitorar a fluência óptica para testes fotoacústicos
Hidrofone de agulha pré-amplificado	Precision Acoustic, Dorset, Reino Unido	Modelo com diâmetro de sensor de 1 mm e faixa de frequência de 1-20 MHz	Para medir sinais fotoacústicos