Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Resumo

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Resumo

A doença metastática é a propagação de células tumorais malignas do local do tumor primário para um órgão distante e é a principal causa de morte do cancro associado ^1. Os lugares mais comuns de propagação metastática incluem pulmão, linfonodo, cérebro e ossos ^2. Mecanismos que conduzem metástase são áreas de intensa pesquisa sobre o câncer. Consequentemente, os ensaios eficazes para medir a carga metastático em locais distantes de metástases são fundamentais para a investigação do cancro. Avaliação de metástases do pulmão em modelos de tumor mamário é geralmente realizada por observação qualitativa bruta de tecido de pulmão a seguir a dissecção. Métodos quantitativos de avaliação de metástase está actualmente limitado a ex vivo e em técnicas de imagem com base vivo que exigem parâmetros definidos pelo usuário. Muitas dessas técnicas são em todo o organismo, em vez de nível do nível celular ^3-6. Embora os métodos de imagem mais recentes utilizando microscopia multi-fotão somos capazes de avaliar MetasTasis a nível celular ^7, estes procedimentos altamente elegantes são mais adequados para avaliar os mecanismos de difusão em vez de uma avaliação quantitativa da carga metastática. Aqui, um método in vitro simples para avaliar quantitativamente a metástase é apresentado. Usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), o ARNm específico de células de tumor pode ser detectado no tecido do pulmão do rato.

Introdução

Análise de qRT-PCR, como é proposto um método para avaliar a metástase tumoral. Este método é proposto como uma alternativa para os usuários que estão interessados ​​em avaliar a metástase, mas não podem ter acesso ao equipamento específico, como in vivo equipamentos de imagem ou uma fluorescência estereoscópio capaz. Uma discussão de métodos vulgarmente utilizados é apresentada seguido por uma demonstração de como a análise de QRT-PCR pode ser usado tanto como um separado ou como um método para avaliar companheiro metástase. Este procedimento tem o potencial de fornecer uma análise quantitativa de carga metastático.

Métodos padr....

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes e padrões de cuidados de animais da Medical University of South Carolina (MUSC) e seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Dissecção do tumor mamário (opcional, dependendo objetivos do estudo e se a análise do tumor primário ou veia da cauda injeção foi realizada).
   1. Euthanize rato usando uma dose letal de anestesia isoflurano acordo com IACUC e regulação universidade. Confirme a eutanásia por deslocamento cirúrgico.
   2. Na placa de espuma, o pino com pinos de dissecação, colocando o mouse sobre as suas costas com membros spread.
   3. Spray de rato com etanol 70%.

Resultados

Além do tempo que demora a efectuar a inoculação inicial de células de tumor no animal experimental e de se realizar, na análise primária do tumor in vivo, a colheita de tecido, o isolamento do ARN e a análise qRT-PCR é um procedimento de 1-2 dias (Figura 1) .

Um exemplo de análise bruta é imagiologia bioluminescente para avaliar células tumorais dentro do tecido pulmonar. Aqui, um experiment.......

Discussão

Este protocolo descreve o uso de qRT-PCR para avaliar a metástase de células de tumor mamário de pulmão utilizando um modelo de xenoenxerto de ratinho. Reconhece-se que outras técnicas, incluindo a imagem de bioluminescência, estão disponíveis e também são eficazes para detectar metástase apesar de ter os seus próprios valores e limitações. Os dados apresentados sugerem que qRT-PCR proporciona uma medida eficaz de detecção de ARNm derivado de tumor dentro de tecido pulmonar para a quantificação de metástases total. Prop.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-mercaptoetanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
Kit de Isolamento de RNA GeneJet	Thermo Scientific	K0732
iScript Transcrição Reversa Supermix para QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Ensaio PrimePCR SYBR Green: ERBB2, Humano	Bio-Rad	100-25636
Modelo PrimePCR para SYBR Green Assay: ERBB2, Humano	Bio-Rad	100-25716
gapdh Sequência			de primer para-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG