Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

Resumo

Os percevejos dependem de neurônios receptores olfativos alojados em sua sensila olfatória antenal para detectar semioquímicos no ambiente. Utilizando a gravação de um único sensor, demonstramos um método para avaliar a resposta dos percevejos aos semioquímicos e explorar o processo de codificação envolvido.

Resumo

O sistema olfactivo inseto desempenha um papel importante na detecção de semioquímicos no ambiente. Em particular, o sensilas antenal que abrigam neurónios simples ou múltiplas, para dentro, são considerados para tornar a maior contribuição para responder aos estímulos químicos. Ao gravar diretamente potencial de ação no sensillum olfativa após a exposição a estímulos, a gravação sensillum único (SSR) técnica fornece uma abordagem poderosa para investigar as respostas neurais dos insetos a estímulos químicos. Para o bug cama, que é um parasita humano notório, vários tipos de sensillum olfatório foram caracterizados. Neste estudo, demonstramos respostas neurais de cama bug sensilla olfativo a dois estímulos químicos e as respostas dependentes da dose para um deles usando o método SSR. Esta abordagem permite que pesquisadores para realizar rastreio precoce de estímulos químicos individuais na olfativo sensilla cama bug, que iria fornecer informações valiosas para o desenvolvimento de novos atrativos ou repelentes de insetos de cama e benefícios dos esforços de controle de cama bug.

Introdução

O percevejo comum Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), como um ectoparasita temporária, é um inseto sugador de sangue obrigado, o que significa a sua sobrevivência, desenvolvimento e reprodução necessitam de fontes de sangue de hospedeiros, incluindo seres humanos e animais ^1,2. Embora a transmissão do vírus raramente tem sido relatada devido a C. lectularius, o incômodo gerado por morder uma infestação afeta seriamente anfitriões tanto física como psicologicamente ^3. A introdução e uso generalizado de inseticidas químicos, especialmente o DDT, reduziu o risco de infestações e até o final de 1950 as infestações estavam em um nível tão baixo que eles já não eram uma preocupação pública grave. No entanto, uma série de possíveis fatores levaram a ressurgimento em populações de percevejos em todo o mundo, tais como a redução do uso de inseticidas, um declínio de sensibilização da opinião pública, o aumento da atividade viajar, eo desenvolvimento de resistência a inseticidas ^4-9.

Sinais químicos no ambiente são detectados e reconhecidos por insetos através de órgãos olfativos, como antenas e palpos maxilares. O sensilla olfativo sobre o inseto antenas desempenham um papel crucial na detecção desses sinais químicos. As moléculas químicas entrar na cutícula antenal através de poros na superfície da cutícula. Proteínas de ligação odorante no ligamento linfa antennal a estas moléculas químicas e transportá-los para os receptores olfativos ^10. Os receptores olfactivos e os seus co-receptores do canal de iões catiónica não-selectivos na membrana neuronal, que será despolarizada uma vez que estas moléculas químicas são reconhecidas pelos receptores olfactivos ^11.

Sensillum gravação único (SSR) foi desenvolvido para detectar a alteração extracelular no potencial de acção causada pela aplicação de um destes estímulos químicos ou não químicos. Através da inserção de um eletrodo de registro na linfa sensillum e um eléctrodo de referênciaem alguma outra parte do corpo do insecto (geralmente se os olhos compostos ou do abdómen), a taxa de disparo dos neurónios em resposta a estímulos podem ser gravados ^12. As alterações no número de picos representam a sensibilidade do insecto a estímulos específicos. Estímulos químicos de diferentes identidades e concentração irá eliciar respostas neurais diferentes, com diferentes taxas de combustão e estruturas temporais, e pode assim ser utilizado para investigar o processo de codificação de o insecto a substâncias químicas específicas.

Para o percevejo comum, ambas as formas sexuais compartilhar o mesmo padrão de sensilla olfativa nas antenas: nove sulcado sensilla peg C, 29 cabelo-como E (E1 e E2) sensilla, e um par de cada um dos Dα, Dβ, Dγ peg suave sensilla ^13,14. Como vários neurónios foram identificadas em cada tipo de sensillum, não é fácil de distinguir os potenciais de acção de diferentes neurónios alojados no mesmo sensillum, assim, para esta experiência a total números de potenciais de ação foram contadas off-line por um período de 500 ms antes e após a estimulação. O número de potenciais de ação após a estimulação foi então subtraído do número de potenciais de ação antes do estímulo e multiplicado por dois, a fim de quantificar as mudanças na taxa de disparo em cada sensillum indivíduo em picos por segundo ^15.

Protocolo

1. Preparação de Instrumentos, Soluções de estímulos, e Percevejos

1. Prepara-se uma solução de KNO ₂ 50% (w / v) em um frasco de 20 ml.
2. Afie dois microeléctrodos de tungsténio em solução KNO ₂ a 5 V mergulhando repetidamente os eletrodos de tungstênio dentro e fora da solução.
   1. Cerca de afiar o fio de tungsténio por imersão a cerca de 10 mm de fio de tungsténio a dentro e para fora da solução de KNO ₂ a uma velocidade de 2 imersões / seg durante cerca de 5 min, o que pode consumir muito, a extremidade dianteira do fio de tungsténio.
   2. Delicadamente afiar o eléctrodo por meio de imersão de cerca de 1 mm da ponta do fio dentro e para fora da solução a uma velocidade de 2 imersões / seg durante pelo menos 1 minuto, de modo a fazer um ponto de o eléctrodo fino e afiado. Verifique o diâmetro ponta do eletrodo sob o microscópio com freqüência até que ele atinja 0,2-0,5 mm, que deve estar bem o suficiente para perfurar a cutícula percevejos sensillum olfativo.
      Nota: Enquanto manualmente afiadaening o eléctrodo, a velocidade de imersão de o fio de tungsténio na solução de KNO ₂ não é constante durante todo o tempo. Com mais prática, é muito mais fácil de manter uma velocidade relativamente constante no afiar do eléctrodo. O tempo de nitidez também é incerto, dependendo de como o eléctrodo fino deve ser. Aqui, uma ponta de eléctrodo com o diâmetro de 0,2 m ~ é suficiente para perfurar através do sensillum olfactiva.
3. Dilui-se cada um dos estímulos químicos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a partir do composto puro a uma concentração inicial de 1:10 v / v como uma solução estoque. Criar uma série de diluições Decádico dependendo do número de doses necessárias na experiência, novamente com o DMSO, a partir de cada uma das soluções de reserva para cada químico. Aqui, usa 10% (+) - β-pineno e eucaliptol.
4. Coloque os dias em jejum ou sete de pós-alimentação percevejos adultos (macho ou fêmea) do Ft. Dix colónia (uma oferta do Dr. Haynes na Universidade de Kentucky) para ser usado em tele experimentar numa placa de Petri.
   Nota: Não há um número exato para percevejos colocados na placa de Petri. Ele pode ser um pouco ou muito.

2. Bed Bug Antena Preparação

1. Anestesiar os percevejos no gelo (2-3 min).
2. Corrigir tanto as antenas eo corpo inseto em uma lamela de microscópio com fita dupla face e remover as pernas com uma tesoura fina.
3. Use um pequeno pino para tocar suavemente as antenas de modo a colocá-los na fita de forma constante.
4. Descansar a lamela contra uma esfera pequena (~ 1 cm de diâmetro) de cera dental para facilitar a manipulação e ajustá-lo a um ângulo apropriado (~ 90 °) para o eléctrodo de registo (Figura 1).
5. Uma vez garantido, coloque o bug cama sob um microscópio estéreo, ligue a fonte de luz fria e ajustar a intensidade da iluminação até a antena está claramente apresentada, e concentrar-se o microscópio sobre a segunda flagelo da antena de percevejos em alta ampliação (720x) .
   Nota: A intensidade de iluminação utilizado na experiência não é quantificada, que realmente depende de como os olhos do experimentador sentir a intensidade de iluminação.

3. Único Sensillum Recording

1. Ligue o pré-amplificador (10X) com o controlador de aquisição de sinal, o qual está ligado com o computador para o registo e visualização de sinais. Ligue o computador e iniciar o software, por exemplo, AutoSpike32 e clique no modo "Record" na barra de menu. Em seguida, escolha a "onda" de modo a começar a gravar os sinais de onda.
   Nota: Uma linha reta em execução a partir da esquerda para a direita do monitor repetidamente deverão ser agora visíveis. Aqui, a janela de gravação dura 40 seg. Gravação de onda máximo é de 10 segundos. Taxa de amostragem selecionada é 96.000 e taxa de amostragem digital é 240. Há 0 deslocamento% e sem filtragem, nenhuma retificação para os sinais de gravação. Todas estas definições de parâmetros do software pode ser modificado conforme necessário.
2. Ligue o alto-falante ligado ao pré-amplif icador, que é usado para apresentar o modo de tonificação para as respostas neuronais a partir de sensillum antenal.
3. Insira o eletrodo de referência para o abdome do percevejo estabilizado.
   Nota: O eletrodo de referência foi realizada por um metal estande fixada magneticamente à mesa do ar.
4. Depois de o eléctrodo de referência tenha sido ligado ao abdómen da percevejo, mover o eléctrodo de registo, que está conectado ao pré-amplificador e manipulado por um micromanipulador, no sentido da extremidade posterior da antena do percevejo.
5. Quando o eléctrodo de gravação está em contacto com a ponta direita da antena, ligar o microscópio e localizar o eléctrodo a baixa ampliação.
6. Ajustar o eléctrodo de registo enquanto aumenta gradualmente até que a ampliação tanto o eléctrodo e o sensillum antenal estão no mesmo plano e claramente visíveis ao microscópio.
   Nota: Por esta altura, o microscópio é habitually com a maior ampliação.
7. Insira o eletrodo de registro no eixo da sensillum usando o micromanipulador e ir um pouco mais fundo, se o ruído de fundo é elevado em comparação com o potencial de ação.
8. Uma vez que os potenciais de acção claros são observados a partir do sensillum gravado, preencher uma micropipeta com 10% de (+) - β-pineno. Utilizar a micropipeta para depositar 10 ul aliquota de 10% (+) - β-pineno em uma tira de papel de filtro (~ 3 x 15 mm) colocado dentro de uma pipeta de Pasteur de vidro.
   1. Ligar a pipeta carregado para o tubo de saída do fluxo de impulsos de estímulo e o controlador de colocar a ponta da pipeta no pequeno orifício no tubo orientado para a antena.
9. Quando todas essas ligações tenham estabilizado, pressionar o pedal do controlador de estímulo para fornecer um sopro de 0,5 seg estímulo (0,5 L / min) para o fluxo de ar humidificado contínua. A gravação do potencial de ação será iniciada simultaneamente quando o footswitch é deprimido. O processo de gravação será passado para 10 segundos a partir de 1 segundo antes da estimulação.
10. Conte os potenciais de ação off-line para dois períodos 500 ms, uma antes e outra após a estimulação. Subtrair qualquer alteração na taxa de pico durante a 500 mseg após a estimulação da actividade espontânea registados durante os últimos 500 mseg e converter as contagens na escala convencional de espigas / s por sua multiplicação por 2.

4. Estímulo substituição na SSR

1. Uma vez que o interruptor de pé foi desencadeada, entregar a 10% (+) - β-pineno na pipeta para o percevejo antenas e gravar a resposta a este odorante específico durante 10 seg, após o que a pipeta é removido.
2. Rotular outra nova pipeta com o eucaliptol 0,001% a ser testado. Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro sobre a qual 10 ul do estímulo foi aplicado, na nova pipeta.
3. Espere por 2-5 min até que o estímulo é completamente vaporized na pipeta de vidro. Fixar a pipeta para o tubo de saída do fluxo de impulsos.
4. Insira a ponta da pipeta no pequeno orifício do tubo orientado para a antena. Pressionar o pedal e iniciar a gravação de 10 segundos.
5. Desligue a pipeta e preparar outra pipeta com 0,01% de eucaliptol.
6. Teste todo o resto das doses de eucaliptol (de 0,001% a 10%) sobre o sensilla antennal para observar as respostas dependentes da dose. Teste a partir do mais diluída para as doses menos diluir.

Resultados

Sensillum gravação única é uma técnica de investigação poderoso utilizado em estudos de insetos ecologia química e fisiologia neural. Investigando as respostas neurais dos insetos aos compostos voláteis diferentes, especialmente aqueles pensado para ser ecologicamente relacionado com a sobrevivência eo desenvolvimento dos insetos, não só nos dá insights valiosos no processo de olfato do inseto, mas também abre novos caminhos promissores que poderiam, potencialmente, levar para o desenvol...

Discussão

A técnica standard sensillum gravação tem sido extensivamente utilizado para testar as respostas neurais de insectos, tais como moscas de fruta, mosquitos e percevejos a diferentes estímulos químicos no ambiente. Estes estímulos químicos são frequentemente dissolvidos e diluídos num solvente comum, a fim de preparar a diferentes doses de tratamentos. No entanto, diferentes solventes pode produzir diferentes taxas de libertação bastante para os estímulos. Estudos anteriores sobre alguns insetos amplamente estudados, tais...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fio de tungstênio	AM SYSTEMS	#716500	Usado para preparar o eletrodo
KNO2	Sigma	#310484	Usado para afiar o fio de tungstênio
Fonte de alimentação CA	BK Precision	1653A	Fornecendo a tensão na afiação do fio de tungstênio
Leica Z6 APO Microscópio	Leica	10447424	Usado para observar a sensilla nas antenas
Controlador Simulus	Syntech	CS-55	Usado para controlar a aplicação de estímulo
Controlador de aquisição USB de 4 canais	Syntech	IDAC-4	Exibição na tela em tempo real de todos os sinais antes e durante a gravação
Fonte de luz	SCHOTT	A20500	Fornecendo fontes de luz para observação
Micromanupulator	Leica	115378	Usado para pequenos movimentos de eletrodo
Alto-falante	Juster	95a	Conectado com o Controlador de Aquisição IDAC-4 e fornecendo som para o sinal
Suporte magnético	Narishige	GJ-1	Usado para segurar o eletrodo de referência, percevejo estabilizado e tubo de entrega de estímulo
Mesa de Isolamento de Vibração TMC	TMC	63-500	Usado para isolar a vibração dos equipamentos
Coverslip	Tedpella	2225-1	Usado para segurar o percevejo
Fita dupla face	3M	XT6110	Usado para estabilizar o percevejo no clipe de cobertura
Cera Dental	Dentakit	DK-R012	Usado para apoiar o clipe de cobertura onde o percevejo é estabilizado