Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Resumo

Ao enxertar grânulos embebidos em fatores de crescimento ou inibidores específicos de vias de sinalização em embriões em desenvolvimento, é possível testar diretamente seus efeitos in vivo. Neste protocolo, grânulos são enxertados no broto do membro para determinar os efeitos dessas moléculas na expressão gênica e na transdução de sinal.

Resumo

Usando embriões de galinha, é possível testar directamente os efeitos de ambos os factores de crescimento específicos ou inibidores das vias de sinalização sobre a expressão do gene e a activação das vias de transdução de sinal. Esta técnica permite a entrega de moléculas de sinalização em estágios de desenvolvimento definidos com precisão para horários específicos. Após esta embriões podem ser colhidas e a expressão de genes examinados, por exemplo, por hibridação in situ, ou a activação de vias de transdução do sinal observado com a imunocoloração.

Neste contas de heparina vídeo embebido em FGF18 ou grânulos AG 1-X2 embebidas em U0126, um inibidor MEK, são enxertados no botão do membro in ovo. Isto mostra que induz a expressão de FGF18 MyoD e fosforilação de ERK e tanto endógena e FGF18 induzida MyoD expressão é inibida por U0126. Grânulos embebidos em um antagonista do ácido retinóico pode potenciar a indução precoce MyoD por FGF18.

Esta abordagem pode ser-nosed com uma vasta gama de diferentes factores de crescimento e inibidores e é facilmente adaptado a outros tecidos no embrião em desenvolvimento.

Introdução

Embriões de aves forneceram uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento de muitos anos ^1. Uma das suas características mais útil é que eles são relativamente fáceis de manipular. Desenvolvimento externo faz com que seja possível abrir o ovo para aceder ao embrião e executar várias micromanipulations incluindo exemplos, tais como o sistema de quimera de codorniz-do pintainho clássica para o estudo de ^2,3 destino celular, a injecção de retrovirus para a sobre-expressão em tecidos específicos durante o desenvolvimento ^4,5 e cultura explante para identificar fontes de sinalização de desenvolvimento ^6. Mais recentemente quimeras gerado entre hosts não marcados com enxertos de uma linha de galinha transgênica expressando GFP mostrou que a combinação de enxertia clássica e modificação genética pode fornecer importantes insights sobre o desenvolvimento ^7,8.

A facilidade com que o embrião aviário pode ser manipulado fez-se um excelente modelo para o estudo do membrodesenvolvimento ^9. Aplicação de fatores de crescimento específicos para membros em desenvolvimento in vivo tem sido fundamental na identificação de fatores que alteram membro padronização ^10,11 e continua a fornecer insights sobre este processo ^12. Essa abordagem também tem sido usado para estudar os fatores que regulam o desenvolvimento muscular e descobriu papéis para numerosos sinais como Wnts ^13, BMPs ^{14 e 15} HGF.

Recentemente, esta técnica tem sido utilizada para investigar os sinais que controlam a expressão do gene miogénica nos brotos dos membros e tem mostrado que as interacções entre o ácido retinóico e FGF18 pode controlar o tempo de expressão ^{de 16} MyoD. Usando uma combinação de fatores de crescimento e moléculas pequenas que podem ser carregados em esferas e, em seguida, enxertadas diretamente em tecidos específicos em estágios de desenvolvimento definidas dá a oportunidade de intervir em quase qualquer hora e região durante o desenvolvimento. Isto tem sido utilizado para investigate muitos processos, incluindo somite padronização ^17,18, especificação neural ^19, migração da crista neural ^{20 e 21 de} extensão do eixo.

Descrevemos aqui um método para o enxerto grânulos embebidos em ambos os factores de crescimento no desenvolvimento de inibidores ou membros de galinha. Este foi usado para determinar os efeitos destes sinais na miogénese, analisando a expressão do gene específico do músculo com a hibridização in situ. Nós descrevemos enxertos utilizando heparina grânulos embebidos, os quais são utilizados para factores de crescimento, ou grânulos AG 1-X2 para pequenas moléculas hidrófobas tais como o ácido retinóico ou pequenas moléculas inibidoras de vias específicas de sinalização. No entanto outros grânulos também estão disponíveis, que têm sido utilizadas para entregar ambas FGF Shh ^{22 e 23.}

Protocolo

Declaração de Ética: Todas estas experiências seguem o cuidado com os animais e as diretrizes éticas da Universidade de Nottingham.

1. Preparação de heparina Beads para enxertia

1. Lave cuidadosamente contas de heparina em PBS antes da utilização. Nota: contas podem ser armazenadas a 4 ° C como uma suspensão em PBS.
   1. Seleccionar os grânulos para enxerto, removendo-os do estoque com uma pipeta de 20 uL a uma queda de 1 ml de PBS. Em seguida, usar uma micropipeta ajustado para 2 ul de transferência de contas em uma gota de 20 ul de PBS numa placa de petri de 3 cm. Escolha grânulos com base no tamanho e, usando um aparelho de som microscópio de dissecação, transferir grânulos selecionados com uma ponteira P2; aqueles em torno de 100 mm de diâmetro são ideais.
2. Remover o PBS a partir dos grânulos. Remover a maior parte do líquido, com uma pipeta de 20 uL e o líquido residual por acção capilar com fórceps de relojoeiro finas. Nota: É importante remover tanto quanto possível de modo que o crescimento factoR não é diluído quando é adicionado aos grânulos.
3. Pipetar o factor de crescimento directamente sobre as esferas. Para FGF18 adicionar 0,5 mL de FGF18 recombinante reconstituído a 0,5 mg / ml em 0,1% de BSA em PBS. Coloque várias gotas de água em torno das bordas do recipiente para evitar que o líquido se evapore.
4. Incubar os grânulos durante 1 h à TA. Retirar as gotas de água do prato com uma pipeta Pasteur e colocar em gelo pronto para enxertia.
5. Se necessário (para contas transparente) a transferência de contas de 4-5 a 2% de fenol vermelho antes de enxertia para ajudar a visualizar-los. Enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião.

2. Preparação de grânulos AG 1-X2 para enxertia

1. Antes de usar derivatizar os grânulos com 0,2 N de ácido fórmico.
   1. Para fazer isso uso de uma espátula para transferir esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 mL de 0,2 N de ácido fórmico e lavar numa plataforma de agitação durante 1 h.
   2. Em seguida, retire o ácido fórmico com uma pipeta P1000 e substituir por umml de água. Lavar durante 1 hora e repetir seis vezes para remover o restante ácido fórmico.
   3. Remover o líquido remanescente com uma pipeta P1000 e armazenar as pérolas a 4 ° C. Nota: Não é necessária para remover a água residual todos nesta fase.
2. Retirar uma pequena pastilha de grânulos de cerca de 5-10 ul de volume a partir do estoque usando uma pequena espátula numa placa de petri de 3 cm e adicionar 1 ml de DMSO (ou qualquer outro solvente, o fármaco é dissolvido em). Nota: Isso deve fornecer várias centenas de grânulos a partir da qual para selecionar aqueles do tamanho certo.
3. Em seguida, utilizar uma pipeta P2 definido para 2 ul para transferir os grânulos de cerca de 100 um de diâmetro para uma gota de 20 ul de solvente na outra placa de Petri de 3 cm.
4. Remover o solvente com uma pipeta de 20 uL e qualquer solvente residual com uma pipeta de 2 ul. Substituir com 20 ul de fármaco a ser aplicado.
   NOTA: Para consistência dissolver o medicamento a uma concentração de 100 uM em DMSO (ou que nunca é utilizado solvente),aliquota em 20 ul e armazenar a -80 ° C, tal como algumas pequenas moléculas inibidoras são instáveis ​​e é melhor para evitar ciclos repetidos de congelação-descongelação. Se necessário, em seguida diluir a droga para a concentração desejada antes de embeber os grânulos. As concentrações eficazes podem necessitar de ser determinada empiricamente para cada fármaco.
5. Incubar durante 1 h. Proteger da luz como muitas destas moléculas são sensíveis à luz.
6. Antes de enxerto de transferência 4-5 grânulos com uma pipeta P2 definido para 2 mL em 20 mL de 2% de fenol vermelho dissolvidos em água. Execute esta etapa utilizando um microscópio de dissecação estéreo para visualizar as esferas. Remover um único talão com relojoeiros pinça fina ou um laço de arame e enxaguar em PBS antes de se transferir para o embrião. Não deixe grânulos em 2% de fenol vermelho por mais de 15 min antes do uso, pois isso pode causar perda de atividade.

3. Preparação de tungstênio Needles

1. Corte fino fio de tungstênio em 3-4 comprimentos cm. Inserir um pedaço de fio para dentro da extremidade deuma pipeta de Pasteur de vidro e derreter em um bico de Bunsen para fixar na posição. Prepare-se para 10 agulhas para garantir que não há peças de reposição se eles estiverem danificados durante a utilização.
2. Coloque a extremidade do fio em uma chama maçarico e mantê-lo lá até que o tungstênio brilha branco e na ponta é afiada (cerca de 2-3 min). Nota: Durante a utilização a agulha pode ser limpo e re-afiada no maçarico, conforme necessário.
   NOTA: Estes agulhas também pode ser usado para fazer ciclos de transferência de grânulos. Toque suavemente a agulha para o banco e que se curva para formar um laço.

4. Os embriões Preparando para Bead Enxertos

1. Incubar os ovos com o brusco fim até que eles atinjam o estágio desejado (3-5 dias para a maioria das manipulações de bud membro). Usando uma pinça sem corte torneira no fim brusco para quebrar a casca e depois usar a pinça para remover a casca e expor o embrião. Certifique-se a membrana da casca do ovo também é removido.
   NOTA: 1-2 ml de PBS pode ser adicionado com uma pipeta de Pasteur para auxiliarisso se a membrana adere à gema. Pipeta suavemente o PBS sobre a superfície da gema, segure a membrana com a pinça, tomando cuidado para não danificar a gema, e puxe-o para longe do óvulo.
2. Remove-se a 5 ml de albumina de ovo com uma seringa de 10 ml e uma agulha 19 G. Leve somente tanto quanto necessário para assegurar o embrião não faz contato com a fita usada para selar o ovo como a remoção de volumes maiores podem reduzir as taxas de sobrevivência de embriões.
3. Para visualizar o embrião adicionar 5-6 gotas de tinta india artistas para 15 mL de PBS contendo 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml. Injectar 0,5-1 ml diretamente sob o embrião com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25 G.
4. Adicionar 2-3 ml de PBS com 1% de soro fetal de vitelo e 100 U de penicilina e estreptomicina a 0,1 mg / ml para dentro do ovo para assegurar o embrião não desidrata. Usando afiadas relojoeiros fórceps remover a membrana vitelina e abrir o amnion ao longo dos brotos de membros em desenvolvimento. Certifique-se de que o embrião não secar eSe necessário, adicione mais PBS / FCS.
   NOTA: Os brotos dos membros pode ser visto claramente como excrescências emparelhados sobre o flanco do embrião. Nessas etapas o embrião vai virar o lado direito é tal normalmente mais elevada. Como resultado, é normalmente mais fácil de enxertar miçangas nas extremidades direita e use os que foram deixados como controle contralateral.
5. Usar um fio de tungsténio afiada para fazer uma incisão no botão do membro em que o talão irá ser implantado. Evite cortar todo o caminho através do botão do membro, sempre que possível, embora em estágios mais jovens isso é difícil.
   NOTA: Em embriões mais velhos (HH estágio 22 e acima) é possível seleccionar regiões específicas do broto de membro para enxertia, mas em estágios mais jovens isto é mais difícil como o membro brotar em si é pequeno. É também importante recordar que o botão de membro irá crescer passado o grânulo enxertado assim, especialmente nas fases mais jovens, o rebordo irá permanecer no coto proximal.
6. Pegar um talão de qualquer fator de crescimento ou de drogas usando wa extra finotchmakers fórceps ou um laço feito de uma agulha de tungstênio. Se o talão foi embebido em DMSO ou vermelho de fenol, lavar em PBS antes de se aplicar ao embrião. Transferir o talão para o embrião com o ciclo de fórceps / fio. Em seguida, use o fio de tungstênio afiadas para inserir o talão na incisão.
7. Adicionar 1-2 ml de PBS / FCS para o ovo assegurar que o embrião é mantido hidratado mas evitar aplicar directamente sobre o próprio embrião como esta pode danificar os embriões e fazer com que o cordão de ser desalojado. Fecha-se o ovo com fita e voltar para a incubadora.

Resultados

Na fase HH 21 MyoD não é expresso em mioblastos em desenvolvimento de membros embora coloração pode ser visto na miótomo dos somitos em desenvolvimento (Figura 1A). A Figura 1B mostra a hibridização in situ para MyoD 6 horas no seguimento de um enxerto FGF18 grânulo. MyoD é induzida em mioblastos perto do rebordo, enquanto não há expressão no membro contralateral. Co-enxerto de um grânulo embebido em U0126, um inibidor específico da MEK, a indução de blocos FGF18 MyoD (...

Discussão

A utilização de enxertos de talão aplicados directamente para o desenvolvimento de tecidos in ovo é uma ferramenta poderosa para dissecar o papel do crescimento factor de sinalização durante o desenvolvimento dando controlo sem paralelo através da fase de desenvolvimento em que elas são aplicados e a duração da exposição.

A escolha de grânulo para cada tipo de molécula é importante. Pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como os inibidores aqui descritos e ácido retinóico, geralmente liga bem...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Contas de acrílico de heparina	Sigma	H5263	As contas de acrílico-heparina usadas foram descontinuadas. No entanto, um produto de substituição está disponível, contas de agarose de heparina, cat no H6508. Estes são transparentes, então mais difíceis de trabalhar, mas podem ser manchados com vermelho de fenol da mesma maneira que as contas AG 1-X2,
contas AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Contas azuis Affi Gel	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Estas contas têm sido usadas com uma variedade de fatores de crescimento, incluindo Shh e FGFs e podem ser usadas para substituir contas de heparina
FGF18	Peprotech	100-28	Ressuspenda em PBS com 0/1% de BSA, prepare alíquotas de uso único de 0,5-1ul e armazene a -80 ° C. Os lotes e os fornecedores podem variar, portanto, diferentes concentrações devem ser testadas para determinar uma dose eficaz.
U0126	Sinalização	9903	Faça um estoque de 20mM em DMSO e armazene alíquotas de uso único a -80 graus Celsius. Proteger da luz.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Ressuspenda em DMSO e armazene em alíquotas de uso único a -80 graus Celsius. Proteja da luz.
Tinta da China preta	Windsor e Newton	5012572003384 (30 ml)	Embora alternativas a este produto estejam disponíveis, deve-se tomar cuidado, pois algumas tintas são tóxicas para embriões
Fio de tungstênio, 0,1 mm de diâmetro. 99,95%	Alfa Aesar	10404
Penicilina / estreptomicina	Sigma	P0781	Diluir 100X em PBS / tinta e PBS / FCS