Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Summary

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Abstract

transporte de proteínas de membrana no nível de proteína único ainda escapa análise detalhada, se o substrato translocado é não-electrogenic. Esforços consideráveis ​​têm sido feitas neste campo, mas as técnicas que permitem a análise automatizada de transporte de alto rendimento, em combinação com técnicas de bicamada lipídica livre de solvente necessária para a análise dos transportadores de membrana são raras. Esta classe de transportadores, porém, é crucial na homeostase celular e, portanto, um alvo chave no desenvolvimento de medicamentos e metodologias para ganhar novos conhecimentos precisava desesperadamente.

O manuscrito apresentado aqui descreve a criação e gestão de um romance biochip para a análise dos processos de transporte de proteínas mediada membrana em resolução transporter única. O biochip é composto de microcavidades fechados por nanoporos, que é altamente paralelo na sua concepção e pode ser produzido em quantidade e de qualidade industrial. lipossomas proteína-abrigando pode ser directamente aplicada aa superfície do chip formar bicamadas lipídicas-medindo poros auto-montadas usando SSM-técnicas (sólido suportado membranas lipídicas). Pore-abrangendo partes da membrana são independentes, proporcionando a interface para a translocação de substrato para dentro ou para fora do espaço da cavidade, o que pode ser seguido por leitura fluorescente multi-espectral em tempo real. O estabelecimento de procedimentos operacionais padronizados (POPs) permite a criação simples de bicamadas lipídicas-abrigando proteína na superfície do chip de proteína de membrana praticamente todos os que podem ser reconstituídos funcionalmente. O único pré-requisito é o estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescência para substratos de transporte não eletrogênica.

aplicações de alto teor de triagem são realizáveis ​​pelo uso de automatizados microscópios fluorescentes invertidos gravação múltiplos chips em paralelo. Grandes conjuntos de dados podem ser analisados ​​usando o software de análise de design personalizado disponível gratuitamente. Três cores de multi espectral fluorescenteleia-out, além disso, permite a discriminação de dados imparcial em diferentes classes de eventos, eliminando falsos resultados positivos.

A tecnologia de chip é atualmente baseado em _SiO2 superfícies, mas ainda funcionalização usando superfícies de fichas revestidas de ouro também é possível.

Introduction

A análise das proteínas da membrana tornou-se de crescente interesse para a pesquisa básica e farmacêutica nos últimos 20 anos. O desenvolvimento de novos medicamentos depende da identificação e caracterização de novos alvos detalhada, actualmente ser um dos factores limitantes. O facto de que cerca de 60% ​​de todos os alvos de drogas são proteínas de membrana ^1, faz com que o desenvolvimento de técnicas para elucidar a sua função mais importante.

No passado, as técnicas para o estudo de canais electrogénico e transportadores têm sido desenvolvidos na multiplicidade ^2-4. substratos não eletrogê....

Protocol

1. Preparação de vesículas Unilamelares Grandes (LUV)

1. Limpar um balão de fundo redondo (10 ml de volume) com azoto gasoso para remover quaisquer partículas de pó. Lavar o balão de fundo redondo com etanol.
   Nota: o etanol residual pode ser tolerada e não perturbe os passos subsequentes.
2. Lava-se 1 mL de 4x seringa de vidro com clorofórmio, para remover qualquer contaminação. Adicionar 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml em clorofórmio) para o balão de fundo redondo e DOPE a solução de lípido com um ^{ATTO 390} DOPE adicional para uma concentração final de 0,1% molar.
   Nota: Em vez de DOPE ^{ATTO 390} outros l....

Results

membranas que atravessa a poro pode ser facilmente criado na superfície do chip nanoestruturada de uma maneira auto-montadas. No entanto, o processo subjacente ainda é delicado e influenciado por muitos parâmetros como o tamanho de lipossomas, monodispersity da população de lipossomas, lamelaridade, lipídios e as propriedades do sal de concentração e de superfície química. A maioria destes parâmetros foram cuidadosamente caracterizado e padronizado no protocolo acima. Outros parâmetros n.......

Discussion

A técnica apresentada aqui permite uma análise altamente paralela de transporte de proteínas de membrana. sistemas de proteína da membrana reconstituídas pode ser directamente aplicado ao biochip, fazer a adaptação de cada teoricamente transportador de membrana ou canalizar possível. análise de Transporte só é limitado pelo estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescente, quer através de mudança direta de fluorescência (translocação de fluoróforos ou substratos marcados com fluorescência) ou a mudança indireta .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente
[2-(Trimetilamônio)etil] metantiossulfonato	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hidrolisado por água. Conservar como alíquota seca a -80 °C. Utilizar imediatamente (30 minutos) após solubilização em tampão.
Seringa estanque a gás de 1 ml	Hamilton	#1001
Balão redondo de 10 ml	Schott Duran
2,7 mm grânulos de vidro	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
Tubo de extensão Luer-Lock de 30 cm	Sarstedt	744304
acetona	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 O adsorvente	Bio-Rad	152-3920	precisa ser ativado antes do primeiro uso
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	armazenar escuro a -20 ° C
Produtos químicos de clorofórmio de grau	reagente VWR	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	armazenar escuro a -20 ° C
Etanol absoluto	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Seringa descartável	Braun	460 60 51V
Seringa descartável Injekt-F	Braun	91 66 017V
Keck clipes	Schott	KC29
L-&alfa;-Fosfatidilcolina, 20% (Soja)	Avanti Polar Lipids	5416016	armazenar sob gás inerte a -20 &graus; C
NaCl 99,5% a.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Alemanha)		disponível a pedido
Membrana Nucleopore Track-Etch 0.4 µ m	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	loja escura a -20 ° C
Oy647	Luminartis (Mü nster/Alemanha)	OY-647-T-1mg	loja escura a -20 &graus; C
Filtração por seringa de rotilabo, não estéril, tamanho de poro 0,22 µ m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	material de coluna para cromatografia de exclusão de tamanho
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		agente de cura para fixação de cavacos no suporte de vidro de cobertura
pegajoso-Slide 80828	ibidi	80828	poços para montagem em lâminas de vidro (porta-cavacos)
Torneira de três vias azul	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µ m filtro de membrana de nitrato de celulose	Roth	NH69.1
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Equipamento
Bü chi 461 banho-maria	Bü chi
Bü chi Rotavapor RE 111	Bü Espectrotômetro
Cary	Varian
LiposoFast Mini Extrusora	Avestin
Bomba de membrana	Vaccubrand	15430
	Nanosight Malvern / Nanosight	LM 14C
Microscópio	NyONE Synentec		disponível a pedido
Controle de bomba	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator banho Sonorex RK100H	Brandelin	31200001107477
Bomba de vácuo RC5	Vaccubrand	1805400204
Banho-maria W13	Haake	002-9910
Limpador de plasma PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Nome<	strong>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software
processamento de imagem	científica http://imagej.nih.gov/ij/	de código aberto
ImageJ Software	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ freeware		para conjuntos de dados cinéticos de transporte massivo
Software analítico NTA 2.3 Software de	Nanosight		para rastreamento de nanopartículas software do controle
da temperatura de Nanosight			para o microscópio de seguimento do nanoparticle