Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Resumo

As amígdalas palatinas são uma rica fonte de linfócitos B e T. Aqui fornecemos um protocolo fácil, eficiente e rápido para isolar linfócitos B e T de amígdalas palatinas humanas. O método descrito foi adaptado especificamente para estudos da etiologia viral da inflamação das amígdalas conhecida como amigdalite.

Resumo

As amígdalas fazem parte do sistema imunológico, fornecendo a primeira linha de defesa contra patógenos inalados. Normalmente, o termo "amígdalas" refere-se às amígdalas palatinas situadas nas paredes laterais da parte oral da faringe. As amígdalas palatinas removidas cirurgicamente fornecem uma fonte acessível conveniente de linfócitos B e T para estudar a interação entre patógenos estranhos e o sistema imunológico do hospedeiro. Este protocolo de vídeo descreve a dissecção e o processamento de amígdalas palatinas humanas removidas cirurgicamente, seguido pelo isolamento das populações individuais de células B e T da mesma amostra de tecido. Apresentamos um método que separa eficientemente os linfócitos B e T tonsilares usando um protocolo de afinidade dependente de anticorpos. Além disso, usamos o método para demonstrar que o adenovírus humano infecta especificamente a fração de células T tonsilares. O protocolo estabelecido é geralmente aplicável para isolar de forma eficiente e rápida as populações de células B e T tonsilares para estudar o papel de diferentes tipos de patógenos nas respostas imunes tonsilares.

Introdução

As amígdalas são coleções de tecidos linfóides incompletamente encapsulados que se encontram sob e em contato com o epitélio no trato aerodigestivo superior. Normalmente, o termo "amígdalas" refere-se às amígdalas palatinas situadas nas paredes laterais da parte oral da faringe. As amígdalas palatinas pareadas, juntamente com a amígdala nasofaríngea (adenóide), amígdalas tubárias pareadas e amígdalas linguais constituem o chamado "anel de Waldeyer". Este último é responsável pelo contato inicial entre patógenos inalados ou ingeridos e os tecidos linfóides do trato aerodigestivo^1,2. De fato, vários relatos mostraram que antígenos bacterianos e virais podem ser detectados em amostras de tecido de tonsila palatina^2-6.

As amígdalas palatinas são compostas de tecido linfóide denso coberto por um epitélio escamoso estratificado não queratinizante. As amígdalas têm numerosas criptas, invaginações epiteliais, que penetram no parênquima aumentando a área de superfície. Histologicamente, as amígdalas palatinas contêm numerosos folículos linfóides com centros germinativos, que são os locais de maturação e diferenciação das células B (áreas das células B). Da mesma forma, as tonsilas palatinas englobam as células T, que estão localizadas principalmente nas regiões extrafoliculares (áreas de células T). Além das células B e T, também várias células dendríticas foliculares podem ser detectadas nas tonsilas palatinas^1,2.

Devido à sua localização anatômica, as tonsilas palatinas são facilmente acessíveis por intervenções cirúrgicas. Por exemplo, a remoção cirúrgica de amígdalas, conhecida como amigdalectomia, é realizada rotineiramente em todo o mundo⁷. Em crianças com hiperplasia tonsilar, às vezes é utilizada a remoção cirúrgica parcial das amígdalas (amigdalotomia), causando menos dor pós-operatória aos pacientes. Considerando o acúmulo de vários patógenos nas amígdalas, as amígdalas removidas cirurgicamente oferecem uma oportunidade única para estudar a influência de agentes virais e bacterianos nas funções dos linfócitos tonsilares^2,8. Além disso, é possível estudar se alguns patógenos preferem residir em subpopulações celulares específicas⁹. Além disso, como as amígdalas são ricas fontes de linfócitos B, os linfócitos B tonsilares isolados podem ser eficientemente usados para estudar a atividade de diferentes subpopulações de células B¹⁰. No entanto, como as amígdalas palatinas contêm uma mistura de tipos de células, é necessário um método eficiente para separar as diferentes subpopulações celulares.

Aqui, descrevemos um método simples para isolamento eficiente e rápido de populações de células B e T tonsilares de amígdalas palatinas humanas usando uma técnica de separação de células ativadas por magnetismo (Figura 1). O método descrito aqui é útil para cientistas que desejam avaliar o papel de diferentes agentes infecciosos em órgãos linfóides humanos, como as amígdalas palatinas.

Protocolo

O protocolo descreve o isolamento de células linfóides a partir de material humano paciente e, por conseguinte, requer uma homologação ética. O trabalho realizado no presente estudo foi concedido pelo Ethical Review Board Uppsala (DNR. 2013/387).

1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de tonsilas palatinas Humanos

CUIDADO: Todo o material de origem humana sem tela como sangue, tecidos ou fluidos corporais deve ser considerado como material potencialmente infectado. Portanto, as práticas de biossegurança recomendadas para o tratamento dos tecidos humanos devem ser seguidas.

Nota: Para evitar a contaminação, todas as soluções e equipamentos de cultura celular deve ser estéril. Todos os buffers e soluções devem ser pré-arrefecido e mantido em gelo. Tecidos das amígdalas e células isoladas devem ser mantidos e manipulados no gelo.

1. Obter amígdalas frescos de pacientes submetidos a amigdalectomia ou tonsilotomia (Figura 2). Mergulhar o tecido ClumPS para um tubo de centrífuga de 50 ml cheio com solução salina arrefecida com gelo estéril de Hanks equilibrada (HBSS), suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 10 mM de glutamina, 0,05 mg / ml de gentamicina e 1% de mistura de antibióticos-antimicótico (penicilina, estreptomicina e Anfotericina B).
2. Manter os tubos com as amostras de tecidos das amígdalas submersas em todos os momentos no gelo. Tente processar as amígdalas, logo que possível, eo mais tardar três horas após a remoção cirúrgica.
3. Coloque a amígdala em um 60 milímetros placa de cultura de células de plástico no gelo e manter o tecido umedecido com HBSS. Remover coágulos sanguíneos visíveis, gordo e tecidos conjuntivos com uma pinça limpa da superfície da amígdala.
4. Usar uma nova placa de 60 mm de cultura de células, contendo 5 ml de HBSS. Cortar o tecido tonsilar moita em fragmentos de 3-10 mm, usando um par de tesouras estéril e / ou um bisturi.
5. Prepara-se uma nova placa de 60 mm de cultura de células contendo 10 ml de HBSS e colocar um 100 um filtro de células de plástico na solução de HBSS.
6. Transfira os Dissfragmentos da amígdala ected para o filtro de células com pinça estéreis. Usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de plástico, sem problemas espremer os fragmentos de tecido através do filtro de células. Certifique-se de que os fragmentos da amígdala está totalmente imerso no HBSS.
7. Descartar o filtro celular com os restos de tecido e transferir a suspensão de células resultante a 60 mm de placa de cultura celular num tubo de centrífuga de 50 ml de plástico. Deixe o tubo em gelo enquanto prosseguir com passos 1.8 e 1.9.
8. No caso de grandes amígdalas, maior do que 2 cm de tamanho (Figura 2), apertar os fragmentos de amígdalas de dois filtros de células para evitar o entupimento da malha no filtro.
9. Obter o volume final de 35 ml da suspensão de células.
   Nota: Neste passo é possível preparar a suspensão de células para criopreservação (ver secção 2).
10. Adicionar 10 ml de solução de gradiente de densidade de Ficoll, tais como para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Delicadamente sobrepor as suspens celularesde iões (passo 1.9) na parte superior da solução de gradiente de densidade. Evitar a mistura da suspensão de células e a solução do gradiente de densidade.
    Nota: A solução de gradiente de densidade tem de ser aquecida até à temperatura ambiente.
11. Centrifugar a suspensão celular num rotor basculante para fora a 700 xg durante 20 min à TA. Não ative a função de frenagem na centrífuga como frenagem rápida pode perturbar o gradiente. Além disso, use a função de aceleração mais baixa disponível na centrífuga.
    Nota: Após este passo de centrifugação, observar PTM como uma camada fofa branca na interface, e glóbulos vermelhos (RBC), os fibroblastos e os detritos celulares como o sedimento no fundo do tubo.
12. Recolher cuidadosamente a camada de multinacionais, usando uma pipeta de 10 ml. Colocar a suspensão de células para um novo tubo de centrífuga de 50 ml.
13. Adicionar 25 ml de PBS gelado à suspensão de células e girar o tubo a 300 xg durante 5 min num rotor basculante para fora a 4 ° C.
14. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 25 mle repita pellet celular lavagem passo mais duas vezes. Finalmente ressuspender o pellet celular em 15 ml de PBS.
    Nota: Após o passo final de lavagem, é possível criopreservar da suspensão celular (ver secção 2).
15. Aplicar 10 ul de suspensão de células para dentro da câmara de contagem de células hemocitómetro e contar o número de células sob um microscópio. Dispensar a quantidade apropriada de células (por exemplo, 2-3 x 10 ⁷⁾ num tubo de centrífuga de 15 ml para subsequente separação esférulas magnéticas. Manter esta alíquota em gelo até o passo 3.2.

2. criopreservação de células tonsilares

1. Prepare meio de congelação (90% de FBS e 10% de DMSO) e mantê-lo em gelo. Para armazenamento a longo prazo manter os meios de congelação a -20 ° C.
2. Determinar o número total de células utilizando uma câmara de contagem de hemocitómetro célula (passo 1.15). Calcula-se a quantidade necessária de meio de congelação de acordo com a densidade celular congelado desejado (por exemplo, 10 ⁷ célulasS / ml de meio de congelação).
3. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e ressuspender o sedimento de células em meio de congelação arrefecida com gelo (a partir do passo 2.1).
4. Distribuir aliquotas de 1 mL da suspensão de células em tubos de ensaio estéreis concebidas para a armazenagem a longo prazo em azoto líquido. Congelar os frascos em uma câmara de isopropanol e armazená-los a -80 ° CO / N. Para a preservação a longo prazo transferir os frascos em azoto líquido que contém um tanque de armazenamento ou uma -140 ° C congelador de células.
5. Para descongelar frascos com células congeladas, aquecê-los rapidamente em um banho de água a 37 ° C. Imediatamente quando descongeladas, dispersar a suspensão de células para 10 ml de HBSS pré-aquecido (com suplementos, passo 1.1) em um tubo de centrífuga de 15 ml. Girar o tubo a 300 xg durante 5 minutos, remover HBSS e ressuspender o pellet celular a uma densidade de células desejada em HBSS (com suplementos, passo 1.1).
   Nota: A viabilidade do af EMNsTer o descongelamento é de importância, uma vez que a presença de células mortas irá diminuir o rendimento final de B e linfócitos T purificados.
   Nota: De acordo com a nossa experiência a viabilidade celular inferior a 80% irá reduzir a eficiência de isolamento de células.

3. Selecção positiva de Linfócitos T População de tonsilares multinacionais

Nota 1: Este protocolo baseia-se na selecção positiva de linfócitos ^T CD3 + humanos de empresas multinacionais de amígdalas usando pérolas magnéticas acopladas ao anticorpo CD3. É possível começar esta seção de fresco (Seção 1) ou os congelados (Seção 2) as multinacionais.

Nota 2: Comece com 3 x ¹⁰ 7 multinacionais. Não exceder este número de células, uma vez que as colunas de separação podem entupir e isso vai reduzir a eficiência do isolamento. Use colunas maiores se mais células serão tratadas. Os volumes utilizados no presente protocolo tem sido experimentalmente optimizado para o número de células USed em nossa configuração experimental.

1. Preparar o tampão de separação [PBS (pH 7,2), 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA]. Filtra-se o tampão de separação através de um filtro de 0,45 um e armazenar a 4 ° C.
2. Girar a suspensão PTM (passo 1.14) a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento resultante em 240 uL de células (80 ul por 10 ⁷ células) de tampão arrefecido com gelo de separação. Transferir a suspensão de células para um tubo de 2 mL estéril.
3. Adicionar 20 ul de anticorpo CD3 magnética para a solução de células. Incubar os tubos durante 1 hora a 4 ° C com agitação suave contínua para manter as células em suspensão.
4. Transferir todo da suspensão de células para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de tampão arrefecido com gelo de separação para lavar as células.
5. Centrifuga-se o tubo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C num rotor basculante para fora.
6. Enquanto isso configurar o separador magnético e coluna. Fixar o separador magnético para o suporte e colocar a coluna na SEPARator. Lava-se a coluna por aplicação de 500 ul de tampão de separação gelada. Descartar o fluxo através.
7. Coloque um novo tubo de recolha de 15 ml por baixo da coluna. Mantenha o tubo de coleta no gelo.
8. Descartar o sobrenadante (passo 3.5), através da pipeta e ressuspender cuidadosamente a pelete de células em 500 ul de tampão de separação. Aplicar a suspensão de células na parte superior da coluna de pré-lavadas e deixá-lo correr através.
   Nota: aglomerados de células podem obstruir a coluna e, assim, reduzir a taxa de fluxo. Para evitar este problema, coloque um 40 um filtro de células de plástico no topo da coluna. Passando as células através desta malha vai melhorar muito a eficiência deste método.
9. Lava-se a coluna 4 vezes com 1,5 ml de tampão de separação (500 ul para 10 ⁷ células). Espere até que o reservatório coluna estar vazio (sem líquido deve ser observado na coluna) antes da aplicação do próximo passo de lavagem.
   Nota: as células não marcadas obter CD3, consideradas como fracção de linfócitos B, como eles sãoeluiu-se para dentro do tubo de recolha.
10. Remova a coluna do separador e coloque em um novo tubo de 15 ml coleção. Pipetar 2 ml de tampão de separação na coluna. Usando o êmbolo fornecidas com a coluna eluir os linfócitos T seleccionados positivamente, os quais são considerados como a fracção de linfócitos T.
11. Determinar o número de células purificadas (passo 1.15), se necessário. Suspensões celulares agora está pronto para os experimentos a jusante.

4. Análise de Citometria de Fluxo Isolado tonsilar linfócitos B e T

CUIDADO: solução de paraformaldeído é irritante e possivelmente cancerígeno. Usar vestuário de protecção, luvas e proteção para os olhos / face.

Nota 1: Este protocolo descreve o método para a coloração directa do isolado B e células T de células activadas por fluorescência Sorting (FACS). O principal objectivo deste passo é o de avaliar a pureza do isolado de células populações afTer anticorpo CD3 separação magnética. Para este efeito, B estabelecida e marcadores de células T, os anticorpos monoclonais a fluoróforos, CD20 e CD2-FITC-APC, são utilizados. Também a inclusão de anticorpos de controlo de isotipo é altamente recomendável para distinguir o "fundo" ligação não específica dos anticorpos CD2 e CD20 (ver passo 4.8).

Nota 2: Não é possível manter as fracções de células purificadas numa solução de paraformaldeído a 1% (PFA) no escuro a 4 ° C até o tempo de coloração (por exemplo, no dia seguinte.). Além disso, o mesmo procedimento é aplicável, se houver um intervalo de tempo entre a coloração e análise de FACS. Recordar que em ambos os casos, as células devem ser devidamente lavados com PBSA (PBS contendo BSA a 0,2%) tampão, antes da coloração ou análise de FACS.

1. Retire 6 x 10 ⁶ células de multinacionais do passo 1,15 (antes de aplicar para a coluna), fração de linfócitos B a partir do passo 3.9 e fração de linfócitos T do passo 3.10.
2. Gire a célulasuspensões a 300 xg durante 5 min a 4 ° C utilizando um rotor basculante para fora.
3. Remover o sobrenadante com uma pipeta e lava-se a pelete celular uma vez com 1 ml de gelo-frio PBSA. Rodar as suspensões celulares a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender com a pipeta células em 600 ul de tampão de PBSA gelada.
4. Adicionar 100 ul da suspensão de células para a parte inferior de um tubo de FACS.
5. Adicionar 100 ul de PBS contendo soro humano inactivado pelo calor 10% a cada tubo, misturar bem e incubar durante ~ 1 min à temperatura ambiente ou 20 min no gelo.
   Nota: os linfócitos B transportam receptores de Fc. A fim de bloquear a receptores Fc das fracções purificadas de células são incubadas com soro humano inactivado pelo calor 10%. O soro humano é inactivado pelo calor por incubação a 56 ° C durante 1 h. Divida o soro inactivado calor em pequenas alíquotas e armazenar congelados a -20 ° C.
6. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C num SWing-out rotor.
7. Remover o sobrenadante com uma pipeta e lava-se a pelete de células com 1 ml de PBSA. Repetir a centrifugação (300 xg durante 5 min a 4 ° C).
8. Adicionar 100 ul de PBSA a cada tubo em gelo. Adicionar a quantidade apropriada de anticorpo monoclonal conjugado com fluoróforo, de acordo com a recomendação do fabricante (por exemplo, 20 uL de anti-CD20 e / ou 5 ul de anticorpos anti-CD2 em 100 ul de PBSA). Nota: Não se esqueça de atribuir tubos de controlo suficientes para a análise FACS. Neste protocolo os seguintes controles devem ser incluídos: 1) células coradas com os anticorpos anti-CD2 e anti-CD20 individualmente, 2) células coradas com os anticorpos anti-CD2 e anti CD20 de controle de isótipo individualmente e, 3) células sem adição de anticorpos.
9. Resumidamente vortex do tubo e incubar durante 30 min a 4 ° C no escuro.
10. Lave 2 vezes com PBSA. Adicionar 2 ml de solução de PFA 1% para as amostras. Permitir que as células permanecem na solução PFA a 476; C no escuro até o momento da análise FACS.
11. Imediatamente antes de executar as amostras na máquina de FACS, lavar as células 2 vezes com PBSA (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Suspenda as amostras em 1 ml de PBS e manter a 4 ° C (ou em gelo), protegida da luz, antes da separação no citómetro de fluxo.
12. Fazer a triagem FACS seguindo o protocolo do citômetro de fluxo fabricante.

5. Detecção de PCR de ADN de adenovirus em Isolado de Tonsillar linfócitos B e T

Nota 1: Os iniciadores do gene de adenovirus hexon são AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') e AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Estes iniciadores gerar um amplicão de 139 pb. O gene de rRNA 18S de acolhimento pode ser detectada com iniciadores tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') e tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). O tamanho esperado de 300 pb do amplicon.

Nota 2: Cada PCRrun inclui um controle negativo (destilada _H 2 O) e um controlo positivo de DNA obtido a partir de linha de células B humanas (BJAB) infectadas com adenovírus humano tipo 5 ^12.

1. Extracto de ADN (a partir de pelo menos 1 x 10 ⁶ células, etapa 3.11) utilizando membrana de sílica método de purificação com base em coluna. Extrair ARN utilizando uma solução de fenol e isotiocianato de guanidina ^13.
2. Adicionam-se 100 ng de ADN a partir de linfócitos B e T, a uma mistura de reacção contendo tampão 1x HF, 0,2 mM de mistura de trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 0,25 uM de cada iniciador e 1 U de alta-fidelidade da polimerase de ADN num volume total de 20 ul.
3. Efectue a amplificação de PCR sob as seguintes condições de ciclo: 30 s de desnaturação a 98 ° C, seguido de 30 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 67 ° C (hexon) ou 58 ° C (18S rRNA) durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg. A reacção de PCR foi terminada com um passo de extensão final de 7 minutos a 72 ° C.
4. Separa-se a amplif PCR resultanteprodutos icação sobre um gel de agarose a 1,5% em tampão 1 x TBE e as bandas esperadas visualização por coloração com mancha de ácido nucleico.

Resultados

Uma separação eficiente de MNCs tonsilares resultados em subpopulações de linfócitos altamente purificados B e T. Isto foi confirmado por análise de FACS utilizando anticorpos anti-CD20 e anticorpos anti-CD2 para a detecção de linfócitos T e B, respectivamente, populações (Figura 3A). Em contraste, uma separação ineficiente das MNCs resulta em fracções de células que são uma mistura de células a partir de ambas as subpopulações de linfócitos B e T (Figura 3B).

Discussão

Um dos factores mais importantes que afectam o resultado do presente protocolo é a utilização de material fresco das amígdalas como o material de partida. Portanto, as amostras de amígdalas deve ser processado dentro de 3 horas após a cirurgia. Amígdalas poderiam ser obtidos de adultos e crianças. O material tonsilar das crianças é geralmente menor, devido à remoção cirúrgica parcial das amígdalas (tonsilotomia). Portanto, o número de PTM obtido a partir de amostras tonsilotomia (1 x 10 ⁷ x 10 -1 ⁸⁾

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina balanceada Hanks (HBSS)	Gibco	14175-053	Contém 5% de soro fetal bovino (FBS), 10 mM de glutamina,    0,05 mg/ml de gentamicina e 1% de mistura antibiótico-antimicótico
		de congelamento	90% FBS e 10%
DMSO tampão			PBS (pH 7,2), 0,5% BSA e 2mM EDTA
PBSA			PBS contendo 0,2% de BSA,
PFA,			PBS contendo 1% de paraformaldeído (PFA). Faça fresco. O PFA é suspeito de ser cancerígeno. Use luvas e óculos de proteção.
Mistura antibiótica-antimicótica	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecando foreceps	Fisher Scientific	1381241
Tesoura de íris reta	Fisher Scientific	12912055
bisturis descartáveis	Swann-Morton	REF 0501
100 μ m filtro de célula de plástico	Corning Life Sciences	352360
40 μ m filtros de células de plástico	Corning Life Sciences	352340
Seringa de plástico de 2 ml	BD Biosciences
tubos de centrífuga cônicos de 15 ml	SARSTEDT	62554502
tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	SARSTEDT	62547254
Centrífuga de baixa velocidade com rotor de ângulo fixo ou balde oscilante	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Solução Ficoll
Soro fetal para bezerros	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS humano CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
separador MACS (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Albumina de soro bovino (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugado à aloficocianina ( CD2-APC)	BD Biosciences
CD20 conjugado ao isotiocianato de fluoresceína (CD20-FITC)	BD Biosciences
Soro humano	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion DNA Polimerase de Alta Fidelidade	Thermo Scientific	F-530L
Tubos FACS	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
Software BD FACSDiva 4.1	BD Biosciences
Nucleospin Sangue	Kit de isolamento de DNA Macherey-Nagel	740951.50
Reagente de TRIzol  Reagente	isolamento de RNA	Life technologies	15596
Hemocitômetro	dispositivo contador de células	de 0610030	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
GelRed	Biotium	41003	Coloração de gel de ácido nucleico