As amígdalas palatinas são uma rica fonte de linfócitos B e T. Aqui fornecemos um protocolo fácil, eficiente e rápido para isolar linfócitos B e T de amígdalas palatinas humanas. O método descrito foi adaptado especificamente para estudos da etiologia viral da inflamação das amígdalas conhecida como amigdalite.
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Artigo de método
Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As amígdalas fazem parte do sistema imunológico, fornecendo a primeira linha de defesa contra patógenos inalados. Normalmente, o termo "amígdalas" refere-se às amígdalas palatinas situadas nas paredes laterais da parte oral da faringe. As amígdalas palatinas removidas cirurgicamente fornecem uma fonte acessível conveniente de linfócitos B e T para estudar a interação entre patógenos estranhos e o sistema imunológico do hospedeiro. Este protocolo de vídeo descreve a dissecção e o processamento de amígdalas palatinas humanas removidas cirurgicamente, seguido pelo isolamento das populações individuais de células B e T da mesma amostra de tecido. Apresentamos um método que separa eficientemente os linfócitos B e T tonsilares usando um protocolo de afinidade dependente de anticorpos. Além disso, usamos o método para demonstrar que o adenovírus humano infecta especificamente a fração de células T tonsilares. O protocolo estabelecido é geralmente aplicável para isolar de forma eficiente e rápida as populações de células B e T tonsilares para estudar o papel de diferentes tipos de patógenos nas respostas imunes tonsilares.
Introdução
As amígdalas são coleções de tecidos linfóides incompletamente encapsulados que se encontram sob e em contato com o epitélio no trato aerodigestivo superior. Normalmente, o termo "amígdalas" refere-se às amígdalas palatinas situadas nas paredes laterais da parte oral da faringe. As amígdalas palatinas pareadas, juntamente com a amígdala nasofaríngea (adenóide), amígdalas tubárias pareadas e amígdalas linguais constituem o chamado "anel de Waldeyer". Este último é responsável pelo contato inicial entre patógenos inalados ou ingeridos e os tecidos linfóides do trato aerodigestivo1,2. De fato, vários relatos mostraram que antígenos bacterianos e virais podem s....
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Protocolo
O protocolo descreve o isolamento de células linfóides a partir de material humano paciente e, por conseguinte, requer uma homologação ética. O trabalho realizado no presente estudo foi concedido pelo Ethical Review Board Uppsala (DNR. 2013/387).
1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de tonsilas palatinas Humanos
CUIDADO: Todo o material de origem humana sem tela como sangue, tecidos ou fluidos corporais deve ser considerado como material potencialmente infectado. Portanto, as práticas de biossegurança recomendadas para o tratamento dos tecidos humanos devem ser seguidas.
Nota....
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Resultados
Uma separação eficiente de MNCs tonsilares resultados em subpopulações de linfócitos altamente purificados B e T. Isto foi confirmado por análise de FACS utilizando anticorpos anti-CD20 e anticorpos anti-CD2 para a detecção de linfócitos T e B, respectivamente, populações (Figura 3A). Em contraste, uma separação ineficiente das MNCs resulta em fracções de células que são uma mistura de células a partir de ambas as subpopulações de linfócitos B e T (Figura 3B).
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Discussão
Um dos factores mais importantes que afectam o resultado do presente protocolo é a utilização de material fresco das amígdalas como o material de partida. Portanto, as amostras de amígdalas deve ser processado dentro de 3 horas após a cirurgia. Amígdalas poderiam ser obtidos de adultos e crianças. O material tonsilar das crianças é geralmente menor, devido à remoção cirúrgica parcial das amígdalas (tonsilotomia). Portanto, o número de PTM obtido a partir de amostras tonsilotomia (1 x 10 7 x 10 -1 8)
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Sueca do Câncer (11 0253, 13 0469), pelo Conselho Sueco de Pesquisa (K2012-99X-21959-01-3), pela Fundação Marcus Borgströms e pelo Conselho Sueco de Pesquisa por meio de uma doação ao Centro de Pesquisa de RNA de Uppsala (2006-5038-36531-16). Estamos em dívida com a instalação central do BioVis na Universidade de Uppsala por muita ajuda com a análise do FACS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina balanceada Hanks (HBSS) | Gibco | 14175-053 | Contém 5% de soro fetal bovino (FBS), 10 mM de glutamina, 0,05 mg/ml de gentamicina e 1% de mistura antibiótico-antimicótico |
| de congelamento | 90% FBS e 10% | ||
| DMSO tampão | PBS (pH 7,2), 0,5% BSA e 2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS contendo 0,2% de BSA, | ||
| PFA, | PBS contendo 1% de paraformaldeído (PFA). Faça fresco. O PFA é suspeito de ser cancerígeno. Use luvas e óculos de proteção. | ||
| Mistura antibiótica-antimicótica | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecando foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| Tesoura de íris reta | Fisher Scientific | 12912055 | |
| bisturis descartáveis | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μ m filtro de célula de plástico | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μ m filtros de células de plástico | Corning Life Sciences | 352340 | |
| Seringa de plástico de 2 ml | BD Biosciences | ||
| tubos de centrífuga cônicos de 15 ml | SARSTEDT | 62554502 | |
| tubos de centrífuga cônicos de 50 ml | SARSTEDT | 62547254 | |
| Centrífuga de baixa velocidade com rotor de ângulo fixo ou balde oscilante | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll– Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Solução Ficoll |
| Soro fetal para bezerros | Biological industries | 040071A | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS humano CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| separador MACS (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 conjugado à aloficocianina ( CD2-APC) | BD Biosciences | ||
| CD20 conjugado ao isotiocianato de fluoresceína (CD20-FITC) | BD Biosciences | ||
| Soro humano | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion DNA Polimerase de Alta Fidelidade | Thermo Scientific | F-530L | |
| Tubos FACS | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| Software BD FACSDiva 4.1 | BD Biosciences | ||
| Nucleospin Sangue | Kit de isolamento de DNA Macherey-Nagel | 740951.50 | |
| Reagente de TRIzol Reagente | isolamento de RNA | Life technologies | 15596 |
| Hemocitômetro | dispositivo contador de células | de 0610030 | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG |
| GelRed | Biotium | 41003 | Coloração de gel de ácido nucleico |
Referências
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J.
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Reimpressões e permissões
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