Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

Dae-Woong Jeong; KyuHan Kim; Myung Chul Choi; Siyoung Q. Choi

doi:10.3791/53376

Artigo de método

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

10.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/53376

⸱

15 de outubro de 2015

Dae-Woong Jeong¹ , KyuHan Kim² , Myung Chul Choi¹ , Siyoung Q. Choi²

¹Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, ²Information and Electrical Research Institute, KAIST

Neste artigo

Resumo

Apresentamos uma nova técnica para medir a difusão lateral de uma espécie tensoativa na interface fluido-fluido, mesclando uma monocamada de gotículas em uma monocamada plana.

Resumo

Introduzimos um novo método para medir a difusividade lateral de uma monocamada de surfactante na interface fluido-fluido, chamado recuperação de fluorescência após fusão (FRAM). O FRAM adota os mesmos princípios da técnica de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP), especialmente para medir a recuperação de fluorescência após o branqueamento de uma área específica, mas o FRAM usa uma coalescência de gota em vez de moléculas de corante de fotobranqueamento para induzir um gradiente de potencial químico de moléculas de corante. Nossa técnica tem várias vantagens sobre o FRAP: requer apenas um microscópio de fluorescência em vez de um microscópio confocal equipado com lasers de alta potência; é essencialmente isento da seleção de corantes de fluorescência; e tem muito mais liberdade para definir a área de difusão medida. Além disso, o FRAM potencialmente fornece uma rota para estudar a mistura ou interdifusão de dois surfactantes diferentes, quando as monocamadas em uma superfície de gotícula e em uma interface plana ar / água são preparadas com espécies diferentes, independentemente.

Introdução

Os fosfolípidos são os principais componentes das membranas celulares e as membranas de organelos, e a fluidez destas camadas de membrana frequentemente afecta as funções celulares através da alteração da actividade de proteínas de membrana ^{1 - 3.} Por exemplo, a membrana homeostase de lípidos é conseguido através do controlo da fluidez da membrana, que é detectada por proteínas de membrana, e um nível anormal de fluidez provoca doenças graves, tais como colestase e esteatose hepática ^4. Além disso, a fluidez de uma monocamada de fosfolípidos na interface fluido-ar alvéolos tem implicações importantes em suas funções. Alta fluidez da monocamada de surfactante pulmonar phospholipid facilita a propagação da camada durante a inalação, ao passo que uma fluidez baixo permite que a camada para permanecer dentro dos alvéolos durante a expiração ^5,6. Assim, é importante para estimar a fluidez das camadas de fosfolipídios para entender seus papéis.

_content "> uma medida directa da fluidez é a viscosidade, e a viscosidade das camadas de fosfolípidos foi medido por meio de colóides de tamanho ^{micron-7, 8,9,} magnéticos agulhas e ^{micro-6,10,11} botões magnéticos. No entanto, estas técnicas estão limitados a películas relativamente rígidos, e não se pode medir filmes menos viscosos. Para tais casos, difusividade seria uma alternativa para quantificar a fluidez das camadas de fosfolípidos. Durante várias décadas, uma variedade de técnicas para medir as propriedades de difusão de camadas de fosfolípidos têm sido desenvolvidos, tais como fluorescência método de têmpera ^12, gradiente de campo pulsado ¹³ RMN e espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) Um dos métodos mais representativas ^14. é a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) ^15,16. Devido à simplicidade do processo de medição e relacionada teorias, vários estudos sobre as propriedades de difusão de camadas de fosfolípidos foram realizadas utilizando FRAP ^{¹⁷ - 19. No entanto, FRAP geralmente requer uma configuração de microscópio confocal caro, com um laser de alta potência.
Aqui, nós apresentamos uma nova técnica para medir a difusão lateral de monocamadas de fosfolipídios, denominado como recuperação de fluorescência após a fusão (FRAM). A principal diferença entre FRAP e FRAM é que o passo fotodegradação passa a ter a coalescência gota. Juntar uma gota coberto por não-fluorescência monocamada numa monocamada plano marcado por fluorescência deixa uma mancha escura circular em uma monocamada plano brilhante, estabelecendo assim o mesmo estado inicial com o passo fotodegradação. Nós, então, observar a recuperação de fluorescência na mancha escura com o tempo para medir a difusividade lateral. Este novo "branqueamento" passo a coalescência gota fornece vantagens significativas em relação FRAP: Fram requer apenas um microscópio de fluorescência, em vez de um microscópio confocal caros com um laser de alta potência, que é necessário para FRAP. Eun disso, FRAM tem uma vasta selecção de corantes fluorescentes, uma vez que não envolve o processo de fotodegradação. Finalmente, as duas monocamadas diferentes, uma monocamada de gotículas e uma monocamada plana, pode ser preparado de forma independente, permitindo assim que a interdifusão a ser medido, enquanto FRAP só mede a autodifusão de monocamadas.
FRAM fornece uma ampla gama de medidas de difusão de materiais de elevada viscosidade para materiais quase invíscidos. Em princípio, FRAM pode medir a difusividade máximo de 10 ⁶ uM ² / seg, que é comparável com as técnicas existentes, quando a difusão ocorre através da área de 100 um até 100 um, durante o tempo para o processo de coalescência gota (~ 10 ms). Além disso, o processo de difusão lenta pode ser facilmente medido a menos monocamadas são sólidos. Fram pode ser usado para quaisquer tipos de materiais tensio-activos, desde que as moléculas marcadas por fluorescência adequados estão disponíveis.}

Protocolo

Atenção: Consulte as folhas de dados de segurança de materiais (MSDS) antes do uso de acetona e clorofórmio que são cancerígenos.

1. Preparação de Phospholipid Monolayer a uma água-Air Interface Plano

Formação de uma monocamada de fosfolípidos
1. Preparação de uma solução de fosfolípido
  1. Limpe um frasco de 4 ml com uma tampa revestida de politetrafluoretileno utilizando acetona, etanol e água deionizada, pelo menos, três vezes, e soprar azoto gasoso cuidadosamente para dentro do frasco para se livrar de água.
  2. Dissolve-se 1 mg de fosfolípido (por exemplo, dioleoilfosfatidilcolina, DOPC) e 1 ml de clorofórmio no frasco para obter 1 mg / ml de concentração. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. Use concentrações mais baixas ou mais altas de solução de fosfolípido, se necessário.
  3. Adicionar corante etiquetado fosfolípidos (por exemplo, rodamina dipalmitoilfosfatidiletanolamina, DPPE Rodamina) com menos de 1 mol% de fosfolípido de Solução, a fim de visualizar a monocamada de fosfolípido com um microscópio de fluorescência. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança.
  4. Envolver o frasco com uma fita de politetrafluoretileno para evitar a evaporação do solvente, e armazenar a amostra num congelador a -20 ° C.
2. Deposição de fosfolipídios na interface ar-água
  1. Limpar uma placa de Petri (55 mm de diâmetro e 12 mm de altura) com etanol, e água desionizada, pelo menos, três vezes.
  2. Encher a placa de Petri com 10 ml de água desionizada para criar uma interface ar-água.
  3. Espalhe alguns microlitros da solução de fosfolípido com uma micro-seringa para uma interface limpa para atingir a pressão de superfície desejada e espere durante pelo menos 30 minutos para evaporar o solvente completamente, antes de fazer a experiência.
    Nota: Uma calha de Langmuir pode ser utilizado em vez de uma placa de Petri, se é necessário um controlo preciso da pressão de superfície.
Sumedição de pressão rface
1. Medir a pressão superficial da monocamada de fosfolípido com uma placa de Wilhelmy tensiómetro. Espera durante pelo menos 30 minutos para obter o papel de filtro humedecido suficiente se o papel de filtro é usado como uma placa de Wilhelmy. O protocolo detalhado está disponível em Kuhn et al. ^20.
2. Ajustar a quantidade depositada do fosfolípido para controlar a pressão de superfície precisamente. Adicionar 4 ml da solução de DOPC (1 mg / ml) para a 30.25 cm ² -Área da interface se ~ 5 mN / m de superfície de pressão é necessário.
  Nota: Se o papel de filtro não é completamente molhado, a pressão de superfície muda dramaticamente durante os primeiros 30 minutos da experiência, devido à mudança de peso do papel de filtro.
Minimização do fluxo convectivo da monocamada
1. Usar um aparelho em forma de cone que contém um reservatório de 3 mm com dois canais finos, ligado a uma grande parte da placa de Petri, para suprimir o fluxo convectivo dea monocamada, que pode perturbar o imaging morfologia e medição de pressão de superfície.
2. Certifique-se de combinar os níveis de água entre o interior eo exterior do aparelho de cone-forma para garantir que fosfolipídios circular livremente em toda a região antes de depositar fosfolipídios na interface ar-água.

2. Preparação de Fosf monocamada na superfície curva de uma gotícula

Processo afinando de um capilar de vidro usando micropipeta extrator
1. Coloque um capilar de vidro (1 mm OD, ID de 0,78 mm, comprimento 100 mm) sobre um suporte de capilar de um puxador de micropipeta.
2. Projetar um programa para puxar os capilares com os valores dos parâmetros apropriados (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 e de pressão 200) e puxe os capilares com o programa projetado de acordo com o protocolo do fabricante.
  Nota: Um capilar acabar com alguns micrômetros de diâmetro é necessário para formar uma gota de 100 um-por Applying com uma pressão de 10 kPa ~. Se a extremidade da ponta do capilar é muito pequena, muito mais elevada pressão,> 600 kPa, é necessário para obter a gota, ao mesmo tempo que é difícil controlar o tamanho das gotículas com uma muito grande extremidade da ponta capilar.
Absorção de fosfolípidos na superfície da gotícula
Nota: Para formar uma monocamada de fosfolípidos na interface curvo de uma gota, uma solução de fosfolípido, sem corante fosfolípidos com etiquetas é usado para se obter um contraste de intensidade, contra a monocamada plana, preparada por procedimento 1. Além disso, ambos os processos 2.2.1 e 2.2 .2 são permitidas aqui. Se é necessário um controlo preciso da pressão de superfície à superfície da gotícula, 2.2.2 procedimento é altamente recomendável. No entanto, se não, o procedimento 2.2.1, que é uma forma muito mais fácil do que o procedimento 2.2.2, é útil.
1. Processo de fosfolípidos revestimento a uma extremidade da ponta
  1. Limpe a lâmina de vidro usando acetona, etanol e água deionizada, pelo menos, três vezes.
  2. Place o capilar cônico em uma lâmina de vidro limpa, e incline o capilar para facilitar a tocar a lâmina de vidro com uma extremidade de ponta.
  3. Deixar cair algumas gotas de solução de fosfolípido (1 mg / ml) para a extremidade de ponta de um capilar que é aderida à lâmina de vidro usando uma seringa de vidro, e esperar, pelo menos, 30 minutos para evaporar o solvente completamente.
    Nota: É altamente recomendável para aderir a extremidade da ponta do capilar para a lâmina de vidro durante o processo 2.2.1.3 porque o perímetro da extremidade da ponta é demasiado pequeno para conter a gota dos fosfolípidos na extremidade da ponta apenas por força de capilaridade.
2. Preparação de uma solução de vesículas
  1. Limpe um frasco, e remover a água do frasco, tal como foi introduzido no processo 1.1.1.1.
  2. Seca-se num volume de 2 ml de solução de fosfolípido (1 mg / ml) através da aplicação de gás de azoto suavemente, e desidratar o frasco durante 1 h à TA para eliminar qualquer solvente remanescente. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança.
  3. Adicionar 2ml de água desionizada num frasco para injectáveis contendo lípidos secos, e incuba-se o frasco num forno a 60 ° C durante 1 h.
  4. Agitar o frasco várias vezes, e sonicate (HF-frequência: até 40 kHz, potência: 370 W) por 30 min para obter vesículas.
  5. Executar processos de extrusão e de congelamento e descongelamento para obter vesículas unilamelares monodispersas. O protocolo detalhado para a preparação de vesículas é descrito em Mayer et al. ^21.
    Nota: pressão de superfície da interface de gotículas é controlado com precisão ajustando-se o tempo de espera após a formação da gotícula que contém vesículas unilamelares monodispersas. Usando um método de gota pendente ^22, é necessário medir a variação de pressão de superfície em função do tempo, antes de fazer a experiência.
Formação de uma gota que contém uma monocamada de fosfolípidos na superfície curva
1. Preencha o capilar afilado com 10 ml de água deionizada de Procedure 2.2.1. Em alternativa, utilizar 10 ml da solução de vesículas a partir de procedimento 2.2.2.
2. Ligue o capilar para um micro-injector automatizado para proporcionar a pressão para formar a gota.
3. Montar o capilar que está ligado a um micro-injector a um micromanipulador para controlar a posição do capilar precisamente.
4. Prepare um microscópio de campo brilhante (Microscópio 1, lente objetiva: 10X NA 0,3) para geração de imagens a vista lateral do capilar com uma câmera CCD. Microscópio 1 permite, assim, para observar a posição precisa da gotícula ao longo do eixo z e estimar o tamanho da gotícula.
5. Mover a extremidade da ponta para uma posição onde a vista lateral da extremidade da ponta é bem visualizado por microscópio 1 utilizando um micromanipulador, e aplicar uma pressão variável (~ 100 hPa) com a extremidade da ponta do capilar, até um tamanho apropriado (~ 100 um de diâmetro) de gotícula é formado.
  Nota: Recomenda-se que micro-injector e micromanipulador automatizada ser usod, se é necessário um bom controle do tamanho das gotas e localização da gota. Também é possível utilizar os manuais.

3. imagens de fluorescência de Recuperação Após a fusão da gota

Nota: Os princípios fundamentais deste protocolo são idênticos aos da técnica FRAP, excepto para o processo de coalescência gota. O Protocolo e afins teorias detalhadas de FRAP estão disponíveis em A. Lopez et al. ^{15 e} D. Axelrod et al. ^16.

Monitorizar e controlar a localização da gotícula
1. Preparar um microscópio invertido definido (Microscópio 2, lente objectiva: 10X NA 0,3, lente do tubo: distância focal 17 de cm) que permite tanto um microscópio de fluorescência com um conjunto de filtro adequado para Rodamina-DPPEs (excitação a 560 nm, emissão a 583 nm) e um microscópio de campo brilhante. Use uma câmera CCD aqui para visualizar os melhores vistas da gotícula com um microscópio de fluorescência mode e um modo de microscópio de campo brilhante.
2. Mover a gota revestido com um fosfolípido para uma interface ar-água plana ao longo do eixo Z, mas não se fundem a gota, no entanto, utilizando o micromanipulador. Use Microscópio 1 para visualizar a vista lateral da gota.
3. Localizar a gota no centro da vista de topo da monocamada plana, utilizando o micromanipulador. Use o modo de microscópio de campo brilhante de Microscópio 2 para visualizar visão de cima de monocamada plana.
Mesclando a gota na interface ar-água plana
1. Mover a gota ainda mais para a interface plana até que a gota se funde na interface, utilizando o micromanipulador. Se o processo de fusão é feita com sucesso, uma região escura com uma forma circular, que está rodeado por um fundo branco, observa-se fluorescência utilizando o modo de microscópio 2.
2. Gravar a série de imagens fluorescentes de acordo com o tempo após a fusão a gota, utilizando o modo de fluorescência de micros2. Use enfrentar uma taxa de quadros mais rápido do que a escala de tempo de difusão da monocamada aqui. Em DOPC monocamada, que leva alguns minutos para difundir para a área escura 200 um completamente.

4. Determinar o coeficiente de difusão por Análise de Imagem

Nota: Para determinar o coeficiente de difusão a partir de uma série de imagens, programa personalizado para análise de imagem é construído como descrito abaixo. Um código fonte detalhada deste programa está disponível no site Jove.

A detecção de uma região circular de interesse
1. Detecção do centro da região de interesse
  1. Obter uma série de imagens fluorescentes que foram gravados durante um processo de recuperação que contém uma área circular escuro e um fundo branco, e definir a primeira imagem da série como uma imagem de referência. Aqui, R _{D é} o raio da área escura de uma imagem de referência em.
  2. Convolute a imagem de referência com um círculo branco queSE intensidade é uniforme ao longo de toda uma região. Use função incorporada com o nome 'conv2' para convolution como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 124. Aqui, o raio do círculo branco é ligeiramente menor do que R _D.
  3. Encontrar uma posição que indica um valor mínimo no cálculo de convolução, e definir esta posição como o centro da região de interesse na imagem de referência.
2. Determinação de um raio da região de interesse
  1. Convolute a imagem de referência com um círculo branco que contém uma posição central, determinada por um procedimento de 4,1 e intensidade uniforme ao longo de toda uma região. Aqui, R _{S é o} raio do círculo branco. Use iteração como 'para' ou 'enquanto' com a equação de um círculo para fazer o círculo branco, como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 102-109.
  2. Convolute a imagem de referência com outro círculo branco que tem um poucoraio maior (5% -10%), _L R, a R _S. Usar o mesmo método com o procedimento 4.1.2.1 para fazer o círculo como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 113-120.
  3. Obter a diferença de valor entre os dois cálculos convolução de 4.1.2.1 e 4.1.2.2.
  4. Repita os procedimentos acima de _R S R = _D / 2 a R _S = 2R _D, aumentando ambos os R e R _{S L com} um nível de pixel. Faça uma iteração que contém códigos de origem de todo procedimento 4.1.2.1 a 4.1.2.3 para repetir.
  5. Encontre o raio de R _S que indica a máxima diferença de valor entre os dois cálculos convolução. Use função incorporada denominada 'max' para encontrar o raio indica a máxima diferença de valor, como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 148 a 149. Isso R _{S indica,} assim, o raio da área escura na imagem de referência.
Cálculo de uma intensidade fraccionada
1. Definir um círculo que contém uma posição central e um raio, determinado pelo procedimento 4.1 como uma região de interesse.
2. Calcular as intensidades médias da região de interesse em uma série de imagens de fluorescência em função do tempo. Convolute cada quadro com a região de interesse e dividi-lo pela área da região de interesse para calcular a intensidade média. Os detalhes estão disponíveis no código-fonte do programa personalizado que está disponível no site Jove.
3. Calcular uma intensidade fraccionada, definida como a equação abaixo, em que F (t) é a intensidade média do círculo que é uma região de interesse de acordo com o tempo, F _I é a intensidade inicial no círculo, e _Fo é a intensidade de um fundo branco.
  F (t) = (F (t) - M _I) / (F _{O - F} i) (Equação 1).
Montagem da fintensidade ractional a teoria FRAP
1. Montar a intensidade fracionária com a equação abaixo, onde τ é um tempo de difusão característica e eu _{0, I} 1 são funções de Bessel modificadas, utilizando um programa de ajuste, e obter τ
  (Equação 2).
2. Obter um coeficiente de difusão a partir da relação, um τ = ^2/4 D, em que D é o coeficiente de difusão e a é o raio da área escura.
  Nota: Durante o processo de ajuste, é possível mudar o perfil de intensidade fraccionada ao longo de um eixo de tempo, quando o processo de recuperação já começou, antes de gravar as imagens.

Resultados

Uma série de imagens de fluorescência foram obtidas com o tempo durante o processo de recuperação após a fusão de uma gotícula revestida com uma monocamada de DOPC sobre uma monocamada de DOPC plana, conforme indicado na Figura 1. A monocamada DOPC na interface ar-água plana foi dopado com pequenas quantidades de Rodamina-DPPE, e, assim, este tornou possível a visualização de um fundo com uma cor brilhante e uma região escura recentemente adicionado à interface plana. Há, um processo de recuperação foi observada a 23 mN / m de superfície de pressão fixa. Um ajuste da equação 1 para a mudança de intensidade fraccionada de acordo com o tempo é mostrada na Figura 2. O valor de ^R2 de este ajuste é 0.999, e este ajuste ainda funciona bem, mesmo a pressões de superfície elevadas ou mais baixas. O coeficiente de difusão da monocamada DOPC obtido a partir deste ajuste foi 27,54? M ² / s a 23 mN / m de superfície de pressão.

Para mais validação da FRAM, coeficientes de difusão da DOPC e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) as monocamadas foram medidos de acordo com a pressão de superfície. Como mostrado na Figura 3, FRAM capta a rápida diminuição do coeficiente de difusão da monocamada de DPPC em ~ 9 mN / m de pressão de superfície, onde LC (líquido condensado) - LE (líquido expandido) de transição de fase ocorre ^10, e os valores de coeficientes de difusão são também concordaram bem com as medidas anteriormente por Peters et al. ^19. Além disso, um decaimento exponencial do coeficiente de difusão com a pressão de superfície foi observada em monocamada DOPC, e esta tendência é quase idêntico àquele medido por Caruso et al. ^12.

figure-results-1
Figura 1. (A) Ilustração esquemática da FRAM (recuperação de fluorescência após a fusão) técnica. Como o lábioID de monocamada gota revestida é mesclado a interface ar-água plana, a monocamada lipídica sem fluorescência marcado lipídica é inserido no plano monocamada lipídica fluorescente. (Imagens B) microscópio de fluorescência com o tempo durante o processo de recuperação de uma monocamada de DOPC a 23 mN / m de superfície de pressão (escala bar = 100 pm). A região escura da monocamada DOPC está totalmente recuperado pelo processo de difusão dentro de alguns minutos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2. Fracção de intensidade versus tempo. Círculos pretos e a linha pontilhada cinza indicam os valores das intensidades fracionários obtidos a partir de análise de imagem (procedimentos 4.1 e 4.2) e o ajuste da equação 1 para as intensidades fracionários com o tempo,mostrado no procedimento 4.3, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3. Os coeficientes de difusão de DOPC (triângulo) e DPPC (quadrado vazio) monocamadas em função da pressão à superfície. As linhas com a cor cinzento claro e com a cor cinzento escuro indicam os valores do coeficiente de difusão anteriormente relatado por Peters et ai. e Caruso et al., respectivamente. Este valor foi modificado a partir Jeong et al. ^23. Reproduzido com permissão de Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Direitos de autor 2014 American Chemical Society. Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Fram partilha uma grande quantidade de princípios fundamentais com FRAP, especialmente para medir a recuperação de fluorescência após branqueamento de uma área específica, mas FRAM utiliza um processo de fusão de uma gota sobre a interface plana para formar uma área branqueados, em vez de aplicar uma luz intensa. O processo de fusão é, portanto, passo mais importante no FRAM e, especialmente, a forma da mancha escura na monocamada plana após a fusão uma gota determina a precisão da medição diffusivity. Especificamente, com base num método de corrente, só definir o círculo com um raio R tal como uma região de interesse para calcular a intensidade média da mancha escura, mostrado no Procedimento 4, e se houver um excesso desvio da forma circular, esta iria perturbar a medição precisa de um coeficiente de difusão. Portanto, é necessário para obter uma forma circular região escura, mas, formatos não circulares são formados por vezes, devido a várias razões. Em primeiro lugar, se existe um fluxo convectivo na Petprato RI, a forma da área escura se torna alongada ao longo da direcção do fluxo. Como mencionado no procedimento 1.3, um aparelho de cone em forma de ajuda a suprimir o fluxo convectivo, e este alongamento seria minimizado. Em segundo lugar, se a extremidade da ponta do capilar toca a interface plana durante um processo de fusão, a área escura é formado com uma variedade de formas, desde o final capilar interrompe o processo de fusão. Através da obtenção de uma gota que só é pendurado a partir do fim do capilar, esta interrupção pode ser evitada. Em particular, um tratamento hidrofóbico do capilar ajuda a gota a sentar-se no final do capilar. Portanto, tiroteios problemas acima e modificações nos permitirá medir propriedades de difusão mais precisamente.

Este processo também permite que solucionou assim FRAM ter várias vantagens significativas sobre FRAP. Em primeiro lugar, FRAM requer equipamento mais simples em comparação com FRAP. Para FRAM, é suficiente utilizar um simples micros fluorescênciaface, em vez de um microscópio confocal de laser caro, com um elevado poder de cujo comprimento de onda deve coincidir com o espectro de absorção do corante. Além disso, é necessária a utilização de material adicional para ajustar o tamanho da área branqueada na FRAP, enquanto o FRAM controla o tamanho da área facilmente ajustando o tamanho da gotícula, ou a pressão superficial na superfície da gotícula. Em segundo lugar, é possível utilizar espécies diferentes de corantes em FRAM. FRAP utiliza apenas moléculas de corante cujo processo de branqueamento é muito mais rápido do que o processo de difusão. Se a difusão dos corantes ocorre durante o processo de branqueamento, é difícil estimar com precisão a propriedade de difusão. Fram, no entanto, não necessita de um processo para o branqueamento de corantes e isto permite assim a utilização de vários tipos de tintas na imagem de fluorescência. Além disso, o FRAP requer lasers de alta potência e conjuntos de filtros adicionais para alterar as espécies de corante, embora seja apenas necessária para substituir os conjuntos de filtros no fram. Finalmente, Uma vez que as monocamadas na superfície das gotículas e a interface plana pode ser formada de forma independente, permitindo assim o estudo das diferenças inter-difusão ou de mistura entre duas monocamadas de lípidos diferentes por fusão de tipo A monocamada de tipo B em monocamada, enquanto o FRAP mede apenas o autodifusão de uma monocamada.

Apesar dessas vantagens, o processo de fusão uma gota em uma interface ar-água plano pode potencialmente limitar esta técnica devido a vários problemas que podem ser motivo de preocupação, como uma incompatibilidade de pressão à superfície entre as duas monocamadas, a escala de tempo do processo de fusão , e um aumento da pressão superficial da monocamada de gotículas plana após a fusão. Estes problemas, no entanto, não afectam de forma significativa a medição de difusão pelas seguintes razões. Primeiro, embora as pressões de superfície nas duas monocamadas diferentes são bastante diferentes, um processo de equilíbrio é completada numa fase muito cedo durante o processo de recuperação. Por exemplo, se Tque a superfície de pressão da monocamada na superfície da gota que é superior ao da monocamada na interface ar-água plana, a área escura expande até que a pressão se equilibra superfície. Uma vez que este processo é completado dentro de 10 ms, a pressão de superfície irá ser equilibrada antes que afecta significativamente o processo de difusão. Em segundo lugar, se o intervalo de tempo do processo de fusão é suficientemente rápido, que não limita a difusão de medição em tudo. Felizmente, um processo de fusão típica também está concluída dentro de 10 ms. Finalmente, mesmo fusão de várias das gotículas para a interface plana não aumentar a pressão à superfície uma vez que a área da superfície da calha é muito maior do que a área de superfície da gotícula. De acordo com os tamanhos de cocho e as gotículas, descrito no protocolo, a área por molécula aumenta menos do que 0,015%, mesclando uma gota. Por conseguinte, o aumento da pressão superficial, devido à alteração da área por molécula é inferior a 0,1%, que é negligible porque é muito menor do que o erro típica na pressão de superfície, tal como medido pela placa de Wilhelmy tensiómetro.

Em resumo, nós introduzimos um novo método para medir a propriedade difusão lateral de uma monocamada de fosfolípido, mesclando uma monocamada gota para a interface plana. Esta técnica exige um equipamento relativamente simples e também permite o uso de vários tipos de espécies de corante. Fram é, portanto, potencialmente aplicáveis para a medição da difusão de quaisquer agentes tensio-activos, incluindo os fosfolípidos, copolímeros de bloco, proteínas e até nanopartículas numa interface fluido-fluido. Além disso, espera-se que o FRAM fornece um novo modo para estudar a inter-difusão ou de mistura entre dois agentes tensio-activos diferentes.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelo Projeto KAIST-financiado K-Vale VERMELHO & B para 2014 eo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional da Coreia Research (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetona	OCI corporation	Acetona 3.8L Pureza Extra Pura	: ≥ 99.5%, Por favor, consulte as fichas de dados de segurança do material (MSDS) antes de usar.
Etanol	OCI corporation	Etanol 3.8L Pureza Extra Pura	: ≥ 94%, Por favor, consulte as fichas de dados de segurança do material (MSDS) antes de usar.
Dioleoilfosfatidilcolina, DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C	Consulte as fichas de dados de segurança do material (MSDS) antes de usar. O clorofórmio é cancerígeno.
Clorofórmio	LiChrosolv	Clorofórmio ultrapuro (A3633)	Pureza: ≥ 99,8%, Por favor, consulte as fichas de dados de segurança do material (MSDS) antes de usar.
Lipídios polares cancerígenos	DPPE	, 810158P	Evite a exposição direta à luz para impedir o tensiômetro R
placa de Wilhelmy	Tecnologia de filme orgânico ultrafino K	Tensiômetro Wilhelmy	http://www.rieglerkirstein.de/index.htm
Extrator de micropipeta	Instrumento Sutter	P-1000
Microinjetor	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulador	Eppendorf	Micromanipulador 5171
Microscópio 1	Lente objetiva: Olympus	Lente objetiva: UPlanFl 10x	Lente objetiva: 10X NA 0.3
Microscópio 2	Lente objetiva: Olympus, Lente tubular: Thorlabs	Lente objetiva: UPlanFl 10x	Lente objetiva: 10X NA 0.3, lente tubular: distância focal 17 cm
CCD para Microscópio 1		Jai	CV 950
CCD para Microscópio 2	Andor	iXon3 EMCCD
Conjunto de filtros	Tecnologia Chroma	Conjunto de catálogo 49004: ET545, T565, ET605	Prepare adequado para moléculas de corante
Sonicator	DAIHAN Scientific	Wiseclean WUC-D06H

810158C de Avanti da rodamina& da do fotobleaching Câmera

Referências

Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101(2014).
Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312(2011).
Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Técnica FRAM Medição de Pressão Superficial Coalescência de Gotículas Microscopia de Fluorescência Mistura de Monocamadas Lipídicas Medição do Coeficiente de Difusão Interface Ar-água

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer