Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

Summary

células de Sertoli primária são necessários para o estudo de testículo-imune privilégio, transdução de sinal durante a inflamação ou infecção, e a utilização das suas propriedades imunoprotectoras. Aqui, descrevemos um protocolo com base em enzima para o isolamento de células de Sertoli primário altamente purificadas e células peritubulares a partir de testículos de rato.

Abstract

O testículo, e em particular o gameta masculino, desafia o sistema imunológico de uma forma única, porque o esperma diferenciado aparecem em primeiro lugar no momento da puberdade - mais de dez anos após o estabelecimento da tolerância imunológica sistêmica. células espermatogénicas expressar um certo número de proteínas que podem ser consideradas como não-auto pelo sistema imunológico. O testículo deve, então, ser capaz de estabelecer a tolerância a estes neo-antígenos, por um lado, mas ainda ser capaz de proteger-se de infecções e desenvolvimento do tumor, por outro lado. Portanto, o testículo é um dos poucos lugares privilegiados do sistema imunológico do corpo que toleram os antígenos estranhos sem evocar uma resposta imune inflamatória prejudicial. células de Sertoli desempenham um papel chave para a manutenção deste ambiente privilegiado imune dos testículos e também prolongar a sobrevivência de células cotransplanted em um ambiente externo. Portanto, células de Sertoli primárias são uma importante ferramenta para estudar o privilégio imunitário do testículo que não pode ser easily substituídos por linhas celulares estabelecidas ou outros modelos de celulares. Aqui apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para o isolamento de células de Sertoli - e células peritubulares se desejado - a partir de testículos de ratos em um único dia.

Introduction

Testículos produzem gametas masculinos e hormônios sexuais, ou seja, os andrógenos. O órgão é composto de dois compartimentos. No compartimento intersticial, que representa cerca de 10-12% do volume total de testículo ^1, a esteroidogénese tem lugar no interior das células de Leydig. O compartimento tubular representa cerca de 60-80% do volume de testículo ¹ e contém células germinais, de dois tipos de células somáticas - peritubulares células de Sertoli e as células. O testículo é dividido por septos de tecido conjuntivo em 250-300 lóbulos, cada um contendo 1-3 túbulos seminíferos altamente complicadas. Estes tubos são fechados....

Protocol

Declaração 1. Ética animal

Experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes do Regierungspräsidium Giessen, Alemanha, como a autoridade local e confirme com o Código alemão de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Experimentais (Permissão não:. GI 20/23 Nr A 31 / 2012).

2. Preparação de Meios, soluções enzima e Animais

1. Prepare 1% de álcool de iodo através da dissolução de 1 g de iodo em 100 ml de etanol.
2. Prepare 2x 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (PBS) sem Ca ^{2+ e Mg 2+} suplementado cada um com 7,5 ml de D-glicose (100 g ....

Results

O procedimento descrito permite o isolamento de aproximadamente 12 x 10 ⁷ células de Sertoli de testículos de ratos 10. 3 X 10 ⁶ células são plaqueadas por cavidade em uma placa de 6 poços de modo a que seis a sete placas de 6 poços estão disponíveis para as experiências no dia 7. A tripsina-digestão com DNase I é o passo mais importante durante o isolamento de células de Sertoli. Se a digestão, neste ponto está avançando muito longe, a proporção de células germinai.......

Discussion

Os túbulos seminíferos são delimitados por uma camada circular de células peritubulares e uma lâmina basal no lado luminal. As células de Sertoli estão repousando na lâmina basal, estabelecem a barreira do testículo sanguíneo através da formação de junções de oclusão entre as células adjacentes e fornecem a estrutura estrutural para a organização do epitélio seminífero. As células de Sertoli e as células espermatogênicas adjacentes mantêm contatos íntimos durante todo o desenvolvimento das células germinativas, proporcio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clone de anticorpo de actina (músculo liso) 1A4	Dako	M0851	Anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo. Use diluição 1:100 para imunofluorescência.
Albumina bovina fração V Grau padrão, liofilizado	Serva	11930.04	Filtro (0.45 µ m) Soluções de BSA utilizadas para imunofluorescência.
Filtros de Célula Corning 70  µ m	Corning	431751	Cor branca
Collagenase A de Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glicose	Sigma	G8644	100 g/L
Dulbecco´ s PBS sem Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Microscópio eletrônico	Zeiss	EM 109S
Microscópio de fluorescência	Zeiss	Axioplan 2
Hialuronidase de testículo bovino	Sigma	H3506
Luz invertida microscópio	Olympus	CKX41	Microscópio de cultura de células
de rotina Camundongo IgG / IgM (H+L) policlonal secundário Anticorpo	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor 488 conjugado
Óleo Vermelho O	Sigma	O0625	Substituiu Sudan III e Sudan IV por causa da cor mais brilhante.
Paraformaldeído	Sigma	P6148
Penicilina (5.000  U/ml)/ Estreptomicina (5.000 µ g/ml)	Gibco	15070-063	Solução 100x
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contém 300 mg/L L-glutamina
Tripsina do pâncreas	suíno Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Inibidor de tripsina de soja	Sigma	T6522	O produto Sigma é consideravelmente mais barato do que o BPTI (Aprotinina) < BR/> usado anteriormente da Roche.
Anticorpo Vimentina (V9)	Sigma	V6630	Anticorpo monoclonal de vimentina de camundongo anti-porco.  Use diluição 1:100 para imunofluorescência.
Ratos Wistar WU	Charles River		Deve ter 19 dias de idade no dia do experimento.