De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em Drosophila melanogaster Usando a Flywalk Paradigm

Summary

O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster.

Abstract

Em seu ambiente natural, insetos, como o vinagre voar Drosophila melanogaster são bombardeados com uma quantidade enorme de odorants quimicamente distintos. Para complicar ainda mais, os odores detectados pelo sistema nervoso dos insetos geralmente não são compostos isolados, mas misturas cuja composição e rácios de concentração variar. Isto leva a uma quantidade quase infinito de diferentes estímulos olfactivos que têm de ser avaliados pelo sistema nervoso.

Para entender quais aspectos de um estímulo odor determinar a sua avaliação pela mosca, é desejável, portanto, examinar de forma eficiente o comportamento guiado por muitos no sentido de odor odores e misturas de odores. Para se correlacionam diretamente comportamento para a atividade neuronal, o comportamento deve ser quantificada em horários similares e em condições idênticas às de estímulo em experimentos neurofisiológicos. No entanto, muitos bioensaios olfativos usados ​​atualmente em Drosophila neuroethology são bastante specialized quer no sentido da eficiência ou em direção a resolução.

Flywalk, um sistema de entrega de odor e monitoramento automatizado, preenche a lacuna entre eficiência e resolução. Ele permite a determinação de um pacote exactamente quando odor estimulada uma mosca que anda livremente, e para determinar as ANIMAL reacção comportamental dinâmica.

Introduction

A meta primordial de qualquer investigação neuroetológica é estabelecer um nexo de causalidade entre os estados de atividade de neurônios individuais ou circuitos neuronais eo comportamento de um organismo. Para alcançar este objetivo a atividade neuronal e comportamento devem ser monitorados em condições idênticas de estímulo e essas condições de estímulo deveriam idealmente ser semelhantes aos do sistema nervoso sob escrutínio evoluído para fazer sentido. Especialmente quando se trata de bioensaios comportamentais, estas exigências têm historicamente se mostrado bastante exigente em Drosophila melanogaster neuroethology olfativo.

Uma vez liberada a partir da fonte, plumas odor quebrar rapidamente se em filamentos finos com difusão turbulenta causada pelo movimento do ar é o principal determinante da distribuição odor ^1. Como resultado, um inseto navegar para atingir uma fonte de odor experimenta a estimulação intermitente com pacotes de odor intercaladas com intervalos variáveis ​​de ar limpo. ambosandando e insetos voadores - incluindo Drosophila - foram demonstradas para explorar essa regime estimulação intermitente para a navegação de afluência contra o vento em cima de encontro pluma e predominantemente movendo cross-vento na ausência de odores ^{2 - 5.} Considerando que os procedimentos de estimulação em experimentos fisiológicos imitar em grande parte aqueles um inseto pode enfrentar em seu ambiente natural, quer proporcionando puffs únicas de odores intercalados com longos períodos de ar limpo ou sequências de estimulação dinâmica ^{6 - 11,} muitas bioensaios comportamentais utilizados na Drosophila neuroethology como ensaio armadilha , arenas em campo aberto ou T-maze contar com odor gradientes ^{12 - 15.} No entanto, porque os gradientes de odor, por definição, são variáveis ​​na concentração, dependendo da distância a partir da fonte de odor, um comportamento particular não pode ser atribuída a uma concentração de odor usando preciso desses paradigmas. Além disso, a inclinação daum gradiente de odor depende criticamente sobre as propriedades físico-químicas do odorante. Um gradiente de um composto altamente volátil será mais rasa do que o criado por um composto menos volátil e, portanto, também mais difícil de controlar de um organismo depender de medição de diferenças de concentração no espaço como o único meio de navegação ^{16 - 20,} o que pode conduzir a uma interpretação incorrecta de preferências olfativas particularmente em ensaios escolha. Este efeito também é altamente prejudicial ao investigar comportamento em relação a misturas de odores, pois leva a diferentes proporções de mistura de componentes em cada ponto no espaço e, portanto, mais uma vez se opõe a uma clara correlação entre a fisiologia e comportamento.

Enquanto moscas do vinagre tendem a se agregar em fermentação de frutas, eles são solitários em sua navegação em direção a fontes de alimento e locais de oviposição. No entanto, em vez de testar animais individuais muitos paradigmas comportamentais utilizados em Drosophila neuroetholoGy examinar o comportamento guiado por odor de coortes de moscas e atração é marcado como a fracção de moscas que escolhem o odor ao longo de um estímulo controle. Estas experiências de coorte têm contribuído grandemente para a compreensão da mosca neuroethology e muitas das observações feitas por usá-los pode ser confirmada em experimentos single-mosca. No entanto, tem sido observado que voa pode influenciar cada decisão alheia ^{21 e} em casos extremos, a avaliação de um odor pode mudar de indiferença à evasão dependendo da densidade populacional ^22. Além disso, os resultados destes tipos de experimentos muitas vezes fornecem apenas o ponto final de uma sequência de decisões comportamentais ao invés de observar o que a mosca está fazendo enquanto ele estiver fazendo isso, o que seria desejável ao tentar correlacionar o comportamento com a atividade neuronal. Estas experiências de coorte, em vez de baixa resolução são contrastados por métodos de alta resolução single-mosca, como arenas de voos cativos e esteiras que permitempara uma observação directa das respostas de comportamento no momento em que o estímulo é apresentado ^20,23,24. No entanto, as experiências de coorte ainda são populares, porque eles são muito eficientes e fornecem resultados robustos, mesmo em baixo comparativamente tamanhos de amostra, porque a variabilidade inter-individual e inter-julgamento são parcialmente média para fora devido à observação de populações ao longo de períodos de tempo prolongados. Enquanto voo tethered e esteira provavelmente fornecer o padrão-ouro, relativa apresentação do estímulo e resolução temporal, as arenas utilizadas são projetados para animais individuais e por isso é necessário para obter os tamanhos de amostra para uma análise estatística demorado. Várias outras abordagens têm sido recentemente desenvolvidos para permitir uma aquisição eficiente de alta-resolução dos dados comportamentais em combinação com um regime de estímulo bem definida. Estes incluem não vigiada seguimento 3D de várias moscas do vinagre em um túnel de vento em combinação com um modelo 3D preciso da pluma de odor ⁵ , o rastreamento de vários moscas individuais em câmaras escolha fornecidas com correntes de ar de ambos os lados ^{25 e} o paradigma Flywalk ^26.

Em Flywalk, 15 moscas individuais situam-se em pequenos tubos de vidro e continuamente monitorizada por uma câmara de suspenso, sob condições de luz vermelha. Os odores são adicionados a uma corrente de ar contínua de 20 cm / seg e viajar através dos tubos de vidro a uma velocidade constante. A corrente de ar é humidificado fazendo-o passar através de 250 ml garrafas contendo água destilada (humidificadores) antes de entrar no sistema de libertação de odores. As posições flies' são registados dentro de uma região quadrado de interesse (ROI) que abrange a maior parte do comprimento dos tubos de odor (mas excluindo as bordas exteriores dos tubos (aproximadamente 5 mm de cada lado), em que as moscas não pode mover-se mais para cima ou a favor do vento) em torno do tempo de apresentação de odor (Figura 1A, B). Voar identidades são mantidas constantes pelo sistema de rastreamento de turante o experimento com base em suas posições Y (ou seja, os seus limites de tubo de vidro). Estimulação odor é conseguida usando um dispositivo de estímulo multi-componente que permite a apresentação de até 8 odores individuais possíveis e todas as suas misturas ^26,29 (Figura 1B). O curso de uma experiência é controlada por um computador de regulação do sistema de entrega e recolha de odor temperatura e humidade informações (computador 1, Figura 1C). Este computador também controla um datalogger (iniciar / parar a gravação) em um segundo computador que rastreia continuamente posições voar a 20 quadros por segundo (computador 2). Voe posições, estado da válvula odor (ou seja, ponto de tempo de abertura da válvula), odor ID, ​​temperatura e umidade em torno de ciclos de estimulação odor são registradas no computador 2. Desta forma, informações sobre odor e voar posições são sincronizados e exportados como .csv-arquivos que podem continuar a ser processados ​​e analisados ​​utilizando rotinas de análise escrito sob medida. porquetodo o sistema é controlado por computador, sem intervenção humana, é necessário durante uma sessão experimental.

Protocol

As técnicas de construção e detalhes de Flywalk foram descritos em outro ²⁶ (no caso de eventuais problemas de estabelecer esta configuração, mais informações podem ser obtidas a partir de MK). Aqui vamos nos concentrar em obter instruções detalhadas sobre o manuseio do paradigma que vai ajudar a obter resultados confiáveis.

1. Fly Manuseamento

1. Voa traseira em baixa a média densidade culturas em meio de comida ²⁷ horas sob uma luz 12: 12 horas: regime escuro a 23-25 ​​° C e 70% de umidade relativa. Para este fim, permitir 20-30 adulto recém-surgido voa para reproduzir em um grande frasco de comida para uma semana, em seguida, descartar moscas adultas e esperar por descendentes a surgir.
2. Recolha 30-40 recém-emergidas (idade <24 horas) moscas adultas e idade-los em no novo um frasco contendo meio alimentar ^{27 para} 3-5 dias.
3. Vinte e quatro horas antes do início do experimento comportamental: Transferir todos 30-40 previamente coletadas 3-5 d de idade (ver 2.2) voa para uma nova vial contendo um tampão de espuma de borracha úmida ou um lenço de papel úmido usando um aspirador.
   NOTA: Não anestesiar moscas usando CO _2.

2. Preparação do Setup Flywalk

1. Use 250 ml garrafas como umidificadores. Encha humidificadores com 100 ml de água destilada.
2. Prepare frascos de odor.
   1. Preparar 500 ul 10 ^-3 diluições dos odores puros de acetato de etilo, butirato de etilo, acetato de isopentilo e 2,3-butanodiona em óleo mineral solvente.
   2. Anexar duas válvulas de retenção bola por odor frasco. Note que o check válvulas permitem unidirecional única fluxo de ar. Por conseguinte, conectar válvulas de retenção de tal forma que o ar possa entrar no frasco de um lado e deixá-la no outro lado.
   3. Remover a tampa de um tubo de reacção de PCR de 200 uL. Pipetar 100 ul de cada diluição de odor num tubo de reacção separado e coloque os tubos em frascos separados de odor. Também preparar um frasco contendo apenas o odor oi solvente mineraleu.
   4. Firmemente selar os frascos de odor por fechá-los usando tampões de aço inoxidável e juntas de borracha.
   5. Ligar os frascos de 5 (4 odor contendo odores e 1 contendo óleo mineral) para o sistema de libertação de odores. Certifique-se de conectá-los na direção do fluxo direita. Uma conexão errada não só irá comprometer a experiência projectada, mas também podem contaminar o sistema de entrega.
3. Verifique a existência de fugas por meio de selagem da saída da câmara de mistura do dispositivo de estímulo. Certifique-se que todos os fluxos de ar antes do dispositivo de estímulo agora cair progressivamente a zero. Se não, verifique se há vazamentos que agora podem ser identificados pelo som de assobio de ar que sai do sistema.
4. Transferir cuidadosamente 15 moscas individuais para 15 tubos de vidro individuais usando um aspirador e tubos de vidro perto de ambos os lados usando os adaptadores correspondentes.
   Nota: Como o sistema deve ser hermeticamente fechado por experiências bem sucedidas, verifique se os adaptadores caber tubos de vidro hermeticamentee note que os tubos de vidro podem quebrar durante esta etapa. Tome cuidado para evitar lesões através do uso de luvas e óculos de protecção.
5. Ligue os tubos de vidro para a configuração Flywalk e, a partir de agora, espere pelo menos 15 minutos antes do início do experimento para permitir moscas para se habituar ao novo ambiente.
6. Depois de prender os tubos de vidro: verifique a leitura dos medidores de vazão a jusante digitais no computador 1 se os 16 fluxos de ar após os tubos de vidro adicionar até o fluxo de ar que entra no sistema. Além disso, verifique no computador 1, se a umidade é entre 60% e 80%.
7. Projeto do protocolo de estímulo controlar a sequência e tempo de estímulos odor apresentadas às moscas. Para obter os dados descritos por exemplo, odores e 4 apresentam o controlo (óleo mineral) isoladamente e todos ternário possível e as misturas quaternário dos odores simultaneamente para 40 vezes cada um. Definir a duração do pulso para 500 ms, com um intervalo de 90 segundos interstimulus e aleatório seqüência de estímulo.
8. Ligue o lifonte ght (LED-cluster; λ = 630). Certifique-se de fornecer luz suficiente para o acompanhamento eficiente sem aumentar a temperatura no interior dos tubos de vidro.
9. Defina-se uma região de interesse do sistema de seguimento, arrastando uma moldura em frente da área a ser monitorizada, de tal modo que todos os 15 tubos de vidro estão incluídos e aproximadamente 5 mm das extremidades dos tubos são excluídos.
10. Configure 14 linhas de separação entre tubos paralelos individuais no sistema de rastreamento alterando suas posições Y no script correspondente para manter indivíduo identificável moscas durante todo o experimento. Certifique-se de posicioná-los de tal forma que há sempre um tubo de vidro entre duas dessas linhas separadoras, porque apenas uma mosca serão rastreadas entre qualquer conjunto de duas linhas.
11. Certifique-se de definir os parâmetros da câmara de tal forma que as moscas são controladas de forma confiável ao longo dos tubos de vidro. Se moscas são perdidos nas extremidades da região de interesse, aumentar o brilho ou o ganho de seguimento software. Evite vibrações mecânicas do sistema de rastreamento. Acompanhe utilizando software comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
12. Iniciar a experiência, iniciando o protocolo de estímulo. Grave flies' XY coordenadas a 20 fps (frames por segundo) e log em combinação com o estado da válvula odor em arquivos de texto.

Análise 3. Dados

NOTA: Os passos seguintes na análise de dados são automatizadas utilizando rotinas escritas personalizados programados em R. Porque estes passos são cruciais para a obtenção de resultados significativos na análise irá, todavia, ser apresentados em uma maneira passo-a-passo. Os dados brutos para a análise são-arquivos .csv que contêm informações sobre o estado sincronizado válvula odor, número de pulsos no experimento e 15 posições mosca-x em cm em um eixo de tempo comum para um ciclo de estimulação odor. Código personalizado para análise de dados podem ser fornecidos mediante solicitação.

1. Open-arquivo .csv, encontrar tempo ponto de abertura da válvula indicado por um chaESL na coluna que representa o estado da válvula.
2. Calcula-se a função linear da posição da forma de odor
   F (t) = s * t + i
   onde t é o tempo no ciclo de estimulação, s é a velocidade do vento (aqui 20 cm / seg) e a intersecção i pode ser calculado usando o ponto de tempo entra o odor dos tubos na posição 0 (abertura da válvula mais atraso).
3. Encontre o ponto de tempo em que o odor e voar x-posição cruzam para cada voar e definir esse ponto de tempo para 0. Nota: Esta maneira posições mosca estão alinhados para cada individual's encontro com o odor.
4. Excluir moscas sentadas nas próprias bordas da região de interesse.
5. Calcular a velocidade de X-posições, dividindo o deslocamento ao longo do eixo x por o intervalo de tempo (100 msec) e repetir o procedimento para cada ciclo de estimulação.
6. Para acelerar o tempo de obtenção de pratos, como mostrado na Figura 2E calcular curso de tempo da velocidade média para cada mosca e de odor e aqueles do curso de tempo significativo para um determinado odor.
7. Para obter o deslocamento líquido, tal como mostrado na Figura 3C calcular o deslocamento de líquido dentro de 4 segundos após o pulso de odor para cada evento de controle e, depois, o deslocamento líquido médio por mosca e odor.

4. Procedimento de Limpeza

1. Limpe o vidro Tubes
   1. Remover moscas e adaptadores de tubos de vidro e tubos de vidro de molho com detergente.
   2. Lavar tubos de vidro em água corrente destilada e seque-as usando ar pressurizado.
   3. Tubos de vidro térmico a 200 ° C durante 8 h.
2. Limpe Odor Delivery System
   1. Remove todos os frascos de odor e a tubagem da câmara de mistura central.
   2. Remover adaptadores de tubos a partir da câmara de mistura.
   3. Câmara de mistura limpa, lavando-o com solução de limpeza de laboratório e solventes (por exemplo, etanol, acetona). Execute estas etapas sob o capô laboratório.
   4. Câmara de mistura a seco usando ar sob pressão e aquecer a 200 ° C durante 8 h.
3. Limpe Odor Frascos e Válvulas de retenção
   1. Remova o plugue de aço (junta de borracha de descarte) e válvulas de retenção de frascos de odor e aproveitar todos os componentes na solução de limpeza de laboratório.
   2. Componentes sonicate em um banho de ultra-som e lavá-los com água destilada.
   3. Limpe todos os componentes, exceto válvulas de retenção com etanol e acetona. Execute estas etapas sob o capô laboratório.
   4. Componentes secos que utilizam ar pressurizado e aquecê-los a 200 ° C durante 8 h.
   5. Válvulas de retenção limpo por dentro por rubor-los com etanol e acetona, utilizando uma seringa (considere direção do fluxo). Execute estas etapas sob o capô laboratório usando óculos de laboratório. Porque acetona ataca peças de borracha, imediatamente válvulas de retenção secas por rubor-los com ar pressurizado.
   6. Remover os odores residuais pulsando ar através de válvulas de retenção por vários dias. Utilize uma incubadora a 60 ° C e de 1 seg no ar / 1 seg de ar fora regime para este passo de limpeza.

Results

Como as moscas são autorizadas a distribuir livremente nos seus tubos de vidro entre os pulsos de odor e o pulso de odor viaja através dos tubos de vidro a uma velocidade constante moscas encontrar o odor em momentos diferentes, dependendo da sua posição-x, no momento da estimulação. Como resultado, os inícios das trajectórias de fluxo ascendente evocados por um pulso de 500 ms de um atraente 10 ^-3 diluição de acetato de etilo são atrasadas em cerca de 1 segundo para as moscas na extremidade a jusante da seus...

Discussion

Embora o sistema Flywalk parece bastante sofisticado, à primeira vista, uma vez configurado e funcionando, é fácil de usar e produz resultados muito robustos. Para enfatizar a consistência dos resultados produzidos com o bioensaio pode-se dizer que os resultados representativos mostrados aqui foram obtidos quase 2 anos depois alguns dos resultados apresentados em estudo anterior ²⁹ com uma configuração modificada usando um novo software de rastreamento e fonte de luz. No entanto, as respostas são atractivas -...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Configuração do Flywalk	personalizados		disponíveis mediante solicitação
Dispositivo de estímulo	personalizados		disponíveis mediante solicitação
Cluster de LEDs	personalizados		disponíveis mediante solicitação
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Suíça
2 Computadores
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Software Labview 11.0	National Instruments, Austin, TX
Comida padrão para moscas	Personalizado
Frascos para moscas padrão	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha
Frascos para moscas padrão	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha
Aspirador	personalizado
óleo mineral	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µ l Tubos de reação PCR	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Alemanha