Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Resumo

A ligação bacteriana às células hospedeiras é uma etapa fundamental durante a colonização e infecção do hospedeiro. Este protocolo descreve a geração de adesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiais biomiméticos que permitem a análise da contribuição de adesinas individuais para esses processos, independentemente de outros fatores bacterianos.

Resumo

A ligação bacteriana às células hospedeiras é um dos primeiros eventos durante a colonização bacteriana dos tecidos do hospedeiro e, portanto, uma etapa fundamental durante a infecção. A caracterização bioquímica e funcional das adesinas que medeiam essas interações iniciais bactéria-hospedeiro é frequentemente comprometida pela presença de outros fatores bacterianos, como componentes da parede celular ou moléculas secretadas, que interferem na análise. Este protocolo descreve a produção e o uso de materiais biomiméticos, consistindo em adesinas recombinantes puras quimicamente acopladas a esferas de poliestireno funcionalizadas disponíveis comercialmente, que têm sido usadas com sucesso para dissecar as interações bioquímicas e funcionais entre adesinas bacterianas individuais e receptores de células hospedeiras. Protocolos para diferentes químicas de acoplamento, permitindo a imobilização direcional de adesinas recombinantes em scaffolds poliméricos, e para avaliação da eficiência de acoplamento dos materiais "bacteriomiméticos" resultantes também são discutidos. Descrevemos ainda como esses materiais podem ser usados como uma ferramenta para inibir a citotoxicidade mediada por patógenos e discutimos o escopo, as limitações e outras aplicações dessa abordagem no estudo das interações bactéria-hospedeiro.

Introdução

Dissecar as interações entre adesinas bacterianas e receptores de superfície do hospedeiro na interface patógeno-hospedeiro é um passo essencial para nossa compreensão dos mecanismos subjacentes que impulsionam a adesão bacteriana. Em última análise, isso nos ajudará a identificar estratégias para interferir nesses processos durante as infecções. Na realização de tais estudos, muitas vezes enfrentamos um dilema: a análise bioquímica e biofísica dos mecanismos moleculares de ligação à adesina requer sua separação de outros componentes da parede celular, o que pode interferir nos eventos de adesão. Por outro lado, o uso de proteínas solúveis recombinantes simplifica demais o evento de adesão, desconsiderando a ancoragem da proteína na parede celular bacteriana e a multivalência da ligação alcançada por meio da exibição da superfície bacteriana. Da mesma forma, do ponto de vista da célula hospedeira, encontrar e se ligar a moléculas únicas de adesina nem sempre tem o mesmo impacto em termos de organização da membrana plasmática, fluidez da membrana e agrupamento de receptores¹ e isso, em última análise, dificulta a avaliação do impacto da adesão na sinalização celular do hospedeiro e o resultado das interações bactéria-hospedeiro.

Recentemente, foi desenvolvido um método pelo qual adesinas purificadas recombinantes ou fragmentos de adesina são acoplados direcional e covalentemente a partículas de polímero semelhantes em tamanho às bactérias, imitando assim a exibição da superfície bacteriana. Essa abordagem tem sido usada em uma variedade de adesinas diferentes, desde moléculas de adesão multivalente Gram-negativas (MAMs)^{2, 3}, até adesinas Gram-positivas, incluindo a proteína de ligação à fibronectina Staphylococcus aureus (FnBPA)^{4, 5} e Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Esse método permitiu a dissecação de fragmentos de adesina importantes para a ligação da célula hospedeira, a identificação dos receptores da superfície do hospedeiro e a determinação de seu comportamento na superfície da célula hospedeira, levando em consideração a afinidade e a avidez de ligação ^{1, 8}. Além disso, essa abordagem tem sido usada para investigar a eficácia de adesinas e derivados imobilizados como inibidores das interações patógeno-hospedeiro ^{8, 9}. Foi demonstrado que derivados acoplados à superfície da Molécula de Adesão Multivalente Vibrio parahaemolyticus (MAM) 7 podem ser usados para atenuar uma série de infecções bacterianas in vitro, incluindo aquelas causadas por patógenos multirresistentes, como Acinetobacter baumannii e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) ^{7, 9}.

Aqui, descrevemos diferentes produtos químicos que podem ser usados para imobilizar adesinas a partículas de poliestireno funcionalizadas disponíveis comercialmente. Devido à ampla gama de funcionalidades de superfície disponíveis, rótulos e tamanhos de partículas, estes são um andaime útil para a produção de materiais bacteriomimiméticos para investigar as interações adesina-hospedeiro. Descrevemos ainda métodos para a caracterização inicial da reação de acoplamento e para o cálculo de propriedades importantes dos materiais resultantes. Finalmente, o uso de adesinas acopladas a esferas como inibidores competitivos de infecções bacterianas in vitro é discutido como um exemplo de sua aplicação, bem como o escopo futuro e as limitações dessa abordagem.

Protocolo

1. O acoplamento químico de proteínas a polímeros Grânulos

1. Tiol-amina acoplamento direccional
   Nota: Este protocolo é adequada para o acoplamento de proteínas contendo cisteína a amina funcionalizada pérolas de polímero, usando sulfosuccinimidil 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulação (Figura 1).
   
   Figura 1. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-amina das proteínas de pérolas de polímero. Amina-esferas de poliestireno modificadas são activados com Sulfo-SMPB. A maleimida reage com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
   1. Preparação de reagentes:
      1. Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave.
      Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS) de TCEP (Tris (2-carboxietil) fosfina) imediatamente antes da utilização.
   2. Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em _dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização.
   3. Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente antes da utilização.
2. Ativação Bead:
   1. Misture a suspensão de pérolas, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0.
   2. Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg).
   3. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem. Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS.
   4. Adicionar 200 ml de 10 mM preparada de fresco Sulfo-SMPB, para dar um final de concentração de 2 mM.
   5. Incubar a suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa.
3. Redução da proteína:
   1. Durante o período de incubação da etapa de activação, se preparar a proteína para o seguinte passo de acoplamento para que possa ser imediatamente adicionado às esferas activadas.
      Nota: Embora este passo de redução não é sempre necessária para GST (glutationa S-transferase) proteínas de fusão, recomenda-se a assegurar uma alta eficiência de acoplamento.
      1. Verifique a concentração de proteína, e ajustá-lo para a concentração final necessária para a reacção de acoplamento. Nota: proteína 6 mM em PBS, e um volume de 1 ml são normalmente utilizados.
      2. Adicionar da TCEP para dar uma concentração final de 5 mM. Incubar a solução durante 30 min à TA.
         Nota: A mistura de reacção pode ser utilizado directamente para a seguinte reacção de acoplamento.
      3. Reter uma pequena quantidade (alguns ml) da solução de proteína para determinar o pró tein concentração e cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2).
4. Proteína passo de acoplamento:
   1. Agregar as esferas activadas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga), e lava-se a pelota uma vez em 1 ml de PBS estéril fresco.
   2. Ressuspender o sedimento em solução de proteína preparada (por exemplo, 1 ml), para dar a concentração de proteína desejada.
      Nota: A concentração de proteína durante o passo de acoplamento vai depender da eficiência média de acoplamento (ver secção 2 para a determinação da eficiência de acoplamento) e densidade de acoplamento desejado (tal como calculados em 1.1.4.3). A eficácia é de cerca de 85% e a concentração final desejada em 5 mM de 10x a suspensão do grânulo, de modo que a concentração de proteína durante o passo de acoplamento deve ser de aproximadamente 6 mm.
   3. Calcula-se a densidade de acoplamento utilizando a seguinte fórmula:
      jpg "/> onde
      ρ _c densidade de acoplamento [número de moléculas de proteína / nm ^2],
      proteína concentração de proteína conc [mg / ml],
      proteína M _w peso molecular da proteína [Da],
      talão conc concentração talão [número de contas / L],
      diâmetro do grânulo d [nm ^2]
      O número de Avogadro
   4. Utilizar a densidade de acoplamento para o cálculo do espaçamento médio ligando:
      
   5. Incubar a suspensão de proteína de grânulo durante 2 horas a 25 ° C numa roda rotativa.
      Nota: Algunsproteínas pode não ser estável à temperatura ambiente. Nestes casos, a reacção pode ser levada a cabo a 4 ° CO / N.
   6. Desactivar restantes grupos activados sobre os grânulos por adição de estoque de cisteína até uma concentração final de 50 mM e incuba-se a suspensão durante 30 min a 25 ° C numa roda rotativa. Sedimentar as pérolas por centrifugação (2 minutos, 16.000 xg numa microcentrífuga).
   7. Manter o sobrenadante para a determinação da concentração de proteína e o cálculo da eficiência de acoplamento (ver secção 2).
   8. Lava-se a pelete duas vezes com talão 1 ml de PBS e ressuspender em 1 ml de PBS fresco para dar o produto final.
      Nota: O protocolo acima irá tipicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a uma concentração final de proteína de 5 mm, o que pode ser usado como um estoque 10x para experiências subsequentes (ver secção 3).
   9. Para prosseguir com a secção 3 do protocolo, trabalhar com 100 ml / ml de estoque de talão ou a uma concentração final de 500 nM de proteína. Nota: Um bom ponto de partida para este Procedure será de 2 × 10 ¹² contas / ml, resultando numa densidade média de acoplamento de 3 x 10 ^-4 proteínas / nm ² ou um espaçamento médio de 57 nm sobre um grânulo de 2 mm de diâmetro.

Acoplamento direccional tiol-carboxi
Nota: Este protocolo é adequado para o acoplamento de cisteína contendo proteínas para esferas de poliestireno funcionalizado-carboxilo. O radical carboxilo é primeiro activado usando 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxissuccinimida (NHS), e, em seguida, amina modificada reticulada usando Sulfo-SMPB (Figura 2).

Figura 2. A reticulação estratégia utilizada para acoplamento direccional tiol-carboxilo de proteínas com pérolas de polímero de poliestireno carboxilado. Grânulos são primeiro activado com EDC e modificadas com NHS para formar um semi-estável de NHS-éster. Subsequente amina-acoplamento de ethylenediResultados da amina num grupo amina livre, a qual reage com Sulfo-SMPB. Maleimida ativado grânulos podem então reagir com cisteínas livres para direcionalmente proteínas par de pérolas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de reagentes:
   1. Prepare PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave.
   2. Prepara-se uma 100X (0,5 M ou 287 mg / ml em PBS), de TCEP imediatamente antes da utilização.
   3. Prepara-se uma 10x estoque (20 mM, ou 4 mg / ml em PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) imediatamente antes da utilização.
   4. Prepara-se uma 10x estoque (50 mM, ou 6 mg / ml em PBS) de NHS (N-hidroxissuccinimida) imediatamente antes da utilização.
   5. Prepara-se uma lingua 5x (10 mM ou 4,58 mg / ml em _dH2O) de Sulfo-SMPB imediatamente antes da utilização.
   6. Prepara-se uma lingua 10x (500 mM ou 88 mg / ml em PBS, pH 7,0) de cisteína imediatamente bntes de uso.
2. Ativação Bead:
   1. Misture a suspensão do grânulo, invertendo suavemente e transferir a quantidade necessária de suspensão de esferas (por exemplo, 12 ml) para um tubo de 1,5 ml estéril contendo 1 ml de PBS estéril, pH 7,0.
   2. Pipeta suavemente para cima e para baixo para lavar as contas e pellet por centrifugação numa microcentrífuga (2 min a 16.000 xg).
   3. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte.
   4. Ressuspender o sedimento do grânulo em 1 ml de PBS estéril fresco e repetir o passo de lavagem.
   5. Ressuspender o sedimento em 0,8 ml de talão de PBS.
   6. Adicionar 100 ml de 10x da EDC (2 mM de concentração final) e imediatamente 100 ml de solução de reserva 10x de NHS (5 mM de concentração final) para a suspensão do grânulo.
   7. Incubar a suspensão de esferas durante 30 minutos a 25 ° C numa roda rotativa.
   8. Lavar grânulos uma vez em 1 ml de PBS e ressuspender em 0,8 ml de PBS estéril fresco.
   9. Adicione 200 ml de etilenodiamina, e incUbate da suspensão de esferas durante 1 hora a 25 ° C numa roda rotativa.
   10. Lavar grânulos uma vez com 1 ml de PBS e ressuspender as contas em 0,8 ml de PBS fresco.
   11. Proceda da secção 1.1.2.4 (ativação talão com Sulfo-SMPB) conforme descrito no ponto 1.1.2 e siga o resto do protocolo descrito na secção 1.1 (acoplamento direcional Tiol-amina). Realizar a preparação de proteínas e acoplamento de proteínas passos de um modo idêntico ao descrito na secção 1.1.
       Nota: A eficiência de acoplamento típico usando este protocolo é ligeiramente inferior em comparação com a secção 1.1, portanto, ajustar a concentração de proteína inicial em conformidade para atingir a mesma densidade de acoplamento (75% aprox.).

2. Determinação da eficiência de acoplamento

Nota: Para determinar a concentração de proteína, utilizar Bradford Reagente ¹⁰ e ensaios colorimétricos como se segue:

1. Inverta suavemente Reagente Bradford para e Nsure homogeneidade do reagente.
2. Usando um ml de solução concentrada a 10 mg / BSA, preparar padrões de proteína cobrindo concentrações entre 0,1 e 1,5 mg / ml de BSA em tampão.
3. Adicionar 250 ml de reagente de Bradford para poços de uma placa de 96 poços. Prepare poços suficientes para todas as amostras, padrões de proteínas e controles negativos (apenas tampão).
4. Adicionar 5 ml de amostra de proteína (padrões proteicos ou tampão, para o controlo negativo) ao reagente na placa de 96 poços.
5. Incubar a placa num agitador orbital à temperatura ambiente durante 10 min.
6. Medir a absorvância a 595 nm utilizando um leitor de placas.
7. Gerar uma curva padrão de concentração BSA contra A595 nm e usar isso para determinar concentrações de proteínas em amostras iniciais e sobrenadante.
8. Calcula-se a concentração de proteína acoplada como se segue:
   
9. Calcula-se a eficiência de acoplamento como:
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3. Utilização de Bead-acoplado Adesinas em ensaios de competição

1. Preparação:
   1. Semente de 1 ml por poço de células HeLa, a uma concentração de 150.000 células / ml numa placa de 24 poços um dia antes do ensaio de competição, para permitir que as células a atingir aproximadamente 80% de confluência, antes de se iniciar o experimento.
   2. Configure cada condição experimental em triplicado. Incluir poços para controlos negativos (sem bactérias adicionados durante ensaios de competição), controlos positivos (esferas de controlo acoplados a fusão-tag só acrescentou durante ensaios de competição) e controles de lise (para experiências de citotoxicidade).
   3. Inocular um LB (MLB) cultura de 5 ml marinho com uma nova colônia de V. parahaemolyticus e crescer O / N a 30 ° C, agitando.
   4. Prepare suficiente MAM-coupled talão, como descrito na seção 1. (Coupling). Permitir para 100 ml de 10x estoque talão por poço.
2. Ensaio de competição:
   1. No dia do competitexperimento de iões, medir a _DO600 da cultura bacteriana.
   2. Prepare meio de infecção por diluição de culturas bacterianas em meio DMEM incolor sem aditivos, pré-aquecido a 37 ° C, contendo 10% de suspensão v / v grânulo (ou pérolas ou grânulos de controlo acoplado a adesina), para se obter um MOI de 10. Preparar 1 mL / bem e 10-20% de excesso de volume por amostra. Nota: Para as condições acima mencionadas (placa de 24 poços, V. parahaemolyticus, MOI 10), o volume necessário de cultura D / N para ser adicionado por poço (ml / ml) é calculada como 3 / _DO600 da cultura. Por exemplo, 1 ml de meio de infecção conterão tipicamente 100 ml de suspensão de esferas, com alguns ml de cultura bacteriana e ser formadas até 1 ml com incolor, DMEM sem suplementos.
   3. Remover o meio velho dos poços e lavar as células HeLa em cultura através da adição de 1 ml de PBS estéril, pré-aquecido a 37 ° C a cada poço.
   4. Remover PBS e adicionar 1 ml de meio de infecção por poço. Também configurar os controles, adicionando soluções containing esferas de controlo e bactérias (controlo positivo) ou grânulos de adesina e sem bactérias (controlos negativos), ou DMEM contendo 0,1% de Triton X-100 (controlo, só é necessária para as medições de citotoxicidade de lise).
   5. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante o período de tempo desejado (por exemplo, 4 horas para medições de citotoxicidade ou 1 h durante as medições de adesão).
      Nota: A aderência bacteriana e citotoxicidade em células hospedeiras podem ser utilizadas como limite de leitura para a eficácia da inibição. Se os pontos de tempo de citotoxicidade e de adesão medições coincidem, ambos os ensaios podem ser realizados utilizando amostras a partir do mesmo poço, uma vez que a citotoxicidade é determinada usando o sobrenadante da cultura e ensaios de ligação utilizar amostras derivadas a partir da camada de células remanescente.
3. Medições Citotoxicidade:
   1. Nos pontos de tempo indicados (por exemplo, 4 horas após a infecção), remover três vezes 200 ml de cada um de 24 poços e a transferênciauma placa de 96 poços.
   2. Rotação placas de 96 poços a 1500 xg, 5 min e de transferência de 100 ml de cada cavidade para uma nova placa de 96 poços. Adiciona-se 100 ml de meio utilizado durante as experiências de infecção para poços frescas da placa de 96 poços em triplicado (estes vão ser usados ​​como espaços em branco).
   3. Levar a cabo o ensaio de desidrogenase (LDH), libertação de lactato, utilizando um kit de detecção da LDH citotoxicidade e seguindo as instruções do fabricante.
      1. Resumidamente, calcular a quantidade de reagente necessários em incrementos de 25 (por exemplo, se 62 amostras estão a ser medido, compõem mistura reagente suficiente para 75 etc.).
      2. Por exemplo, por 100 amostras, misturar 11,25 ml de reagente A com 250 ul de reagente B. Inverter, não vortex para evitar a formação de espuma.
      3. Coloque a mistura em um reservatório para ser capaz de pipetar com uma pipeta multi-canal. Adiciona-se 100 ul de mistura reagente a cada amostra.
      4. Incubar a placa a temperatura ambiente e ler a absorvância a 490 nm num leitor de placas a 10, 20, 30 min.
      Analisar o conjunto de dados para o qual a absorvância da amostra de controlo de lise é elevada, mas ainda dentro da gama linear do leitor de placas (geralmente, 2-3 unidades de absorvância).
   4. Expresso de resultados como% de citotoxicidade, usando a seguinte fórmula de conversão:
      

Medição de adesão bacteriana:

1. Em pontos de tempo indicados (por exemplo, 1 hr de infecção pós), remova a mídia da camada de células.
2. Lave completamente a camada de células com estéril, PBS pré-aquecido (pelo menos 3-4 lavagens de 1 ml de PBS de cada) para remover quaisquer células un-ligado.
3. As células hospedeiras de Lise por adição de 1 ml de uma solução estéril a 1% v / v de Triton X-100 em PBS por poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 5 min.
4. Pipetar cada amostra cima e para baixo várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada poço para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 diluições em série de amostrasem PBS estéril (por exemplo, utilizar 100 ml de amostra e 900 ml de PBS).
5. Placa de 100 ml de cada amostra em agar MLB e espalhado utilizando um espalhador de célula. Otimizar que diluições ao prato dependendo das estirpes bacterianas e ponto de tempo. Nota: Para a montagem experimental descrita, 10 ⁵ ou 10 ⁶ diluições dar um número adequado de UFCs.
6. Incubar as placas a 37 ° CO / N e enumerar as bactérias por contagem de colónias.

Resultados

O V. parahaemolyticus adesina MAM7 contém sete em tandem entrada de células de mamíferos (MCE) domínios envolvidos em reconhecimento de receptores de superfície de acolhimento. Utilizou-se esferas de poliestireno acoplado a recombinante, fragmentos purificados englobando tanto todos os domínios de sete em tandem (MCE MAM7) ou apenas o primeiro domínio de MCE (MAM1) para testar a capacidade destes materiais para competir com V. parahaemolyticus para ligação da célula hospedeira e a eficácia resultante destes materiais como inibidores da adesão. As células HeLa foram infectadas com V. parahaemolyticus estirpe POR1, e a citotoxicidade resultante da infecção in vitro foi avaliada após 4 horas (Figura 3). O tratamento de células HeLa com 0,1% de Triton X-100 (testemunha lise positiva) resultou em lise das células completas, células não infectadas apresentado níveis muito baixos de citotoxicidade. In vitro, a infecção de células não tratadas com POR1 resultou em níveis muito elevados de lise celular, e este foi inibida por co-MAM7upled grânulos mas não MAM1 acoplado ou grânulos de controlo acoplados à GST (Figura 3).

Figura 3. Caracterização de Vibrio parahaemolyticus citotoxicidade induzida em células epiteliais durante ensaios de competição. As células foram tratadas com V. parahaemolyticus (Vp), indicadas com (+), ou a presença de bactérias (-) na presença de diferentes entidades concorrentes (comp.), como indicado. Estes incluíram tanto no comp. (-), Grânulos (MAM7 MAM7), grânulos (MAM1 MAM1) ou grânulos de controlo de GST (GST). Como controlos, as células foram tratadas com Triton X-100 (Triton, controlo de lise), ou para a esquerda não infectado (uninf). Liberação de LDH após 4 horas foi medida como descrito no capítulo 3, e os resultados normalizados para controles Triton (100%) e brancos (0%) como descrito acima. Os resultados são médias ± SEM de ensaios em triplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enumeração de V. parahaemolyticus ligado ou a células não tratadas ou células HeLa, incubadas com MAM7-, MAM1-, ou grânulos de controlo de GST, revelou que MAM7-grânulos, mas não MAM1- ou grânulos de controlo GST outcompete V. parahaemolyticus para ligação a receptores da superfície celular (Figura 4).

Figura 4. Caracterização de fixação bacteriana durante experimentos de competição. Células Hela foram infectados com V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), na ausência (-) ou na presença de entidades competir como se segue: Grânulos MAM7 (MAM7), grânulos (MAM1 MAM1) ou grânulos de controlo de GST (GST) (comp.). Adesão bacteriana foi medida após 1 hora, como descrito na secção 3. Os resultados são médias ± SEM de ensaios em triplicado. Meios (FLTR em UFC / ml) são 2,3010 ^{6, 5} 1,5310, 2,0510 ^6, 2,1210 ^6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Adesinas acoplados a gotas marcadas com fluoróforos resultar na geração de materiais que imitam a adesão bacteriana às células hospedeiras e são ferramentas poderosas para imagiologia celular (Figura 5). Usando contas azuis fluorescentes MAM7 acoplados, que caracterizou o processo de fixação MAM7 mediada para células epiteliais. A ligação de MAM7 a células hospedeiras que resultou na formação de actina e rearranjos de fibras de stress, que foram co-visualizada usando rodamina-faloidina para corar para F-actina (Figura 5B).

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Figura 5. Preparação e utilização de fluoróforo marcado grânulos biomiméticos para fins de imagem. (A) Suspensão de pérolas fluorescentes azuis biomiméticos (tubo direito, 10x estoque) e tampão de controlo (tubo de esquerda). (B) Penhora de contas de MAM7 acoplados a Hela células resulta em rearranjos de actina e formação de fibras de stress. Penhora de contas azuis fluorescentes e resultante de estresse actina fibras (vermelho, manchado com rodamina-faloidina) foram fotografadas por microscopia. Bar, a 10 uM. Imagens no painel B foram adaptados de Lim et al. ¹ e reproduzida sob a licença Creative Commons Attribution. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Descrevemos dois protocolos, que podem ser usados ​​para proteínas contendo tiol par de amine- ou esferas de poliestireno modificado por carboxilato de etilo, respectivamente. Devido à facilidade do processo, o acoplamento tiol-amina é preferível, mas dependendo da especificação grânulo desejado (diâmetro, propriedades de fluorescência), a utilização de grânulos funcionalizado com amina pode não ser possível e que têm, portanto, incluído um protocolo que vai converter o carboxilato - em um grupo amina para dar o pesquisador a maior flexibilidade possível na escolha de andaime. Embora ambos tiol-amina e tiol-carboxilo trabalho de acoplamento para qualquer cisteína contendo proteína, acoplamento direccional (por exemplo, a imobilização da proteína por seu N-terminal, que imita a exposição de superfície) requer uma proteína sem resíduos de cisteína, que é produzido como uma fusão de GST proteínas, ou que contém um resíduo de cisteína terminal único introduzido por mutagénese dirigida ao local. Se várias cisteínas reactivos estão contidosdentro da proteína, isto levará a imobilização aleatório que pode impedir a função da proteína. Muitos adesinas bacterianas não contêm cisteínas naturalmente. Para outros, estes podem ser removidos por mutagénese dirigida, embora isso exigiria ensaios extensivos para garantir que a estrutura e função nativa são retidos no mutante. Para as proteínas de fusão GST, GST-tag purificada acoplado a esferas pode ser utilizado como um controlo negativo adequado. Usando contas de desacoplados como um controle deve ser evitado, uma vez que estes muitas vezes têm uma maior tendência a se aglutinarem ou aderir a células não-especificamente. Uma versão simplificada do protocolo 1.2., Utilizando apenas EDC, pode ser utilizado para proteínas par de pérolas de polímero funcionalizado com carboxilo, no entanto, neste caso, o acoplamento ocorre através de aminas primárias na proteína e, portanto, não garante o acoplamento direccional.

TCEP como um agente redutor não deve ser substituído por outros agentes de redução comercialmente disponíveis e vulgarmente utilizados, tais como dithiothreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol (BME), como os tióis contidos dentro delas irá competir com acoplamento de proteína no passo de acoplamento tiol-maleimida. PBS pode ser substituído com outros tampões, mas com as seguintes considerações: Os tampões não pode conter aminas primárias (SO-Tris contendo tampões não são adequados). O uso de tampões contendo concentrações de sal muito baixos (<10 mm) leva a talão aglomeração e também devem ser evitados. A pureza da proteína é também um factor importante a considerar durante o procedimento, e para a obtenção de dados de elevada qualidade, as proteínas devem ser usados ​​puros. Rotineiramente purificar proteínas em vários passos, incluindo pelo menos um passo de purificação por afinidade e filtração em gel, mas em alguns casos, cromatografia de permuta iónica é realizada como um terceiro passo. Como resultado, a pureza das proteínas utilizadas para o acoplamento é geralmente de 90% ou superior, tal como avaliado por SDS-PAGE.

Recomenda-se para determinar concentrações de proteína, tanto na mistura reaccional inicial, bem como de the sobrenadante após a conclusão da reacção. Isto irá ajudar a determinar a concentração de proteína acoplada aparente-grânulo, e assim a densidade de acoplamento. Determinação de ambos os valores também irá permitir o cálculo da eficiência de acoplamento. Esta pode ser tida em conta quando se prepara a solução de proteína inicial em reacções subsequentes, para obter a densidade e concentração de acoplamento final desejado. Bradford reagente é particularmente adequado para a determinação da concentração de proteína antes e após a reacção de acoplamento, uma vez que nenhuma das substâncias na reacção interfere com a formação de complexos de corante nas concentrações utilizadas. Se as concentrações de proteína inferiores são para ser usado, este método pode ter de ser substituído por um método de detecção mais sensível, porém, a atenção tem de ser pago para o facto de que tem que ser compatível com as substâncias contidas no interior da reacção de acoplamento. Também é recomendado usar reagentes recém-preparados e lidar com reagentes em pó com cuidado (por exemplo, lojasem um recipiente fechado e usá-grânulos de sílica, a fim de evitar os reagentes desenho humidade) desde a qualidade dos reagentes irão influenciar a eficiência de acoplamento. Se a eficiência de acoplamento é menor do que o esperado, possíveis soluções incluem o aumento da concentração inicial de contas e de proteína. Se estão a ser usadas concentrações mais elevadas, a concentração dos reagentes de acoplamento tem de ser aumentada proporcionalmente para garantir um excesso molar suficiente. Modificando concentrações talão / proteína é geralmente um melhor passo para a otimização em vez de aumentar os tempos de reação. Dado que os protocolos de acoplamento grânulo são longos, que vulgarmente se preparar um lote grande de material. Alíquotas da suspensão podem ser congeladas em azoto líquido e armazenado a -20 ° C durante vários meses. Descongeladas aliquotas não deve ser novamente congelada e deve ser mantida a 4 ° C e usadas dentro de 1-2 dias. No entanto, isto pode variar com a natureza e a estabilidade da proteína usada como deve ser testado em um pequeno lote inicialmente.

adesinas Bead-acopladas podem ser usadas para muitas aplicações, tal como discutido abaixo. Este protocolo descrito um ensaio que é utilizada para medir a inibição da citotoxicidade mediada por ligação e agente patogénico em células hospedeiras. O ensaio é normalmente realizada para medir a capacidade de MAMs acoplado com pérolas para inibir competitivamente a infecção de células epiteliais HeLa com o marisco microrganismos patogénicos Vibrio parahaemolyticus, utilizando quer uma diminuição na fixação bacteriana às células hospedeiras ou reduzida citotoxicidade como uma leitura . Em ambos os casos, a preparação e ensaios de competição seguem o mesmo protocolo. Dependendo da leitura, diferentes estirpes de V. parahaemolyticus estão sendo usadas: a estirpe citotóxica POR1 é usado para as medições de citotoxicidade, ao passo que a estirpe não-citotóxica POR2 é usado para medir a adesão bacteriana, uma vez que a morte celular e destacamento celular compromete o procedimento para quantificar bactérias aderidas.

Inicialmente, compeexperimentos foram concor- configurado como um protocolo de passo a passo, em que as células hospedeiras são primeiro pré-incubadas com os grânulos antes da adição de bactérias. Para V. parahaemolyticus e as especificações do talão (2 uM utilizados grânulos acoplados a MAM7), ambos os grânulos e as bactérias podem ser adicionados ao mesmo tempo, sem alterações na citotoxicidade resultante. Ou seja, neste sistema experimental, grânulos outcompete bactérias para a ligação da célula hospedeira. Dependendo da espécie bacteriana e talão geometria utilizada, pode haver boas razões para manter a adesão do grânulo e infecção bacteriana como dois passos separados. Por exemplo, para infectar as células com as bactérias não móveis, as placas são centrifugadas geralmente após a adição do meio de infecção. No entanto, a centrifugação das placas contendo suspensões talão deve ser evitado, uma vez que isto conduz a uma distribuição altamente irregular de pérolas sobre a camada de células. Se estão a ser utilizados tamanhos de partícula mais pequenos, grânulos levará mais tempo para resolver sobre a superfície da célula, no caso em que suficiente tempo deve ser permitida para fixação talão antes da infecção. Quando a aderência de bactérias é usado como um lido, as amostras devem ser tomadas em pontos de tempo em que as células hospedeiras não são significativamente danificados pela estirpe infectante, como descolamento celular e lise pode comprometer a quantificação de bactérias aderidas.

Em vez de enumerar adesão bacteriana por diluição em placas, as amostras podem, alternativamente, ser processado para a imagem latente (Figura 5). Neste caso, as células de cultura de tecidos deve ser semeadas em lamelas de vidro, em vez de directamente em poços. Além disso, podem ser usadas pérolas fluorescentes e bactérias que expressam uma proteína fluorescente, juntamente com marcadores de células hospedeiras específicas da infecção. Por exemplo, experiências de competição são comumente fotografada usando vermelho fluorescente rodamina-faloidina para corar o citoesqueleto de actina das células hospedeiras e avaliar as alterações morfológicas resultantes de infecção, em conjunto com os grânulos azuis fluorescentes e fluorescenteverde (GFP expressando ou SYTO18 manchado) bactérias.

Uma variedade de adesinas acoplado-grânulo, incluindo o Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 MID e Vibrio parahaemolyticus MAM, têm sido utilizados como materiais biomiméticos para estudar a adesão, a inibição da adesão e a contribuição de adesão ao mediada por patogénio citotoxicidade ^{1, 7, 8.} Uma das vantagens da utilização desta abordagem é a facilidade de visualização de eventos de fixação, uma vez que as pérolas de polímero utilizadas como suportes estão disponíveis numa larga gama de cores (por exemplo, azul, vermelho fluorescente, azul, verde, laranja). Assim, a marcação directa de proteínas, a qual pode interferir com a função, pode ser evitada. Além disso, a superfície de acoplamento imita o visor multivalente de adesinas na superfície bacteriana, o que reflecte uma conformação mais fisiologicamente relevante em comparação com proteínas solúveis.

Em comparação com estudos utilizando bactérias intactas ou bacterial mutantes, a abordagem grânulo contorna os problemas associados com o crescimento bacteriano. Por exemplo, a longo prazo (por exemplo, O / N) os estudos de adesão bacteriana às células hospedeiras utilizando bactérias intactas são frequentemente comprometida por fenómenos que acompanham o crescimento bacteriano - acidificação da depleção de meio de crescimento e nutrientes afectar negativamente células hospedeiras e replicação bacteriana, eventualmente, compromete qualidade de imagem.

Mais recentemente, o uso de adesinas-coupled talão foi estendido para incluir o seu uso como ferramentas para purificações afinidade de acolhimento celular fatores envolvidos em processos a jusante de fixação bacteriana sinalização. V. parahaemolyticus MAM7, através da ligação a ácidos fosfatídicos na membrana da célula hospedeira, provoca a activação RhoA e actina rearranjos ^{1, 3.} grânulos acoplado-MAM estão a ser usadas para purificar e identificar proteínas envolvidas nas plataformas de sinalização montados como uma consequência da célula MAM-hospedeiro obrigatório. Uma vez que os grânulos podefacilmente ser separados do sobrenadante por um passo de centrifugação curta, e a proteína de interesse é covalentemente acoplado, este é um bom método para conseguir a separação de proteínas contaminantes e enriquecer os complexos de proteína em causa, o qual pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a proteómica ou Western mata-borrão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)	Sigma	646547	Perigo; corrosivo < br / > pode ser comprado como solução ou
recém preparado Sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirato (Sulfo-SMPB)	Fisher	PN22317	Perigo;
tóxico L-cisteína	Sigma	30089	Perigo; tóxico
Contas de látex, poliestireno modificado com amina, azul fluorescente - suspensão aquosa, 2.0  μ m tamanho médio de partícula	Sigma	L0280	nocivo; uma variedade de tamanhos e cores de partículas alternativos está disponível
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)	Thermo scientific	22980
N-hidroxisuccinimida (NHS)	Thermo scientific	24500
Grânulos de poliestireno modificados com carboxilato	Sigma	CLB9	prejudicial; uma variedade de tamanhos e cores de partículas alternativos está disponível
Etilenodiamina	Sigma	E26266	Perigo; inflamável, corrosivo, tóxico, sensibilizante
Albumina de soro bovino (BSA)	Promega	W3841
Bradford reagente	Sigma	B6916	Perigo; corrosivo e tóxico
Dulbecco' s Águia Modificada' s Glicose média - alta - Com 4.500 mg/L de glicose e bicarbonato de sódio, sem  L-glutamina, piruvato de sódio e vermelho de fenol, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células	Sigma	D1145	para experimentos de infecção
DMEM	Sigma	D6429	para manutenção de células hospedeiras cultivadas
Soro fetal bovino, suplemento Sigma		F9665	para meio
de cultura de tecidosPenicilina-Estreptomicina - Solução estabilizada, com 10.000 unidades de penicilina e 10  mg estreptomicina/mL, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células	Suplemento Sigma	F9665	para meio de cultura de tecidos
PBS	Sigma	D8537
LDH Kit de detecção de citotoxicidade	Takara	MK401
Reservatórios de reagentes
	Greiner	662160
Placas de 96 poços	Greiner	655182
Equipamento
hemocitômetro
microcentrífuga
leitor
instalações			de cultura de tecidos
pipeta