A Stroke Versátil Modelo murino de Subcortical Branco Matéria para o Estudo da axonal Degeneration e branco Matéria Neurobiology

Resumo

Aqui apresentamos metodologia para a produção de um AVC focal na substância branca murina por injeção local de um inibidor irreversível da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (L-Nio). São apresentadas duas variações estereotáxicas, traçado neuronal retrógrado e marcação e dissecção de tecidos frescos que expandem as aplicações potenciais dessa técnica.

Resumo

Acidente vascular cerebral que afecte contas de matéria branca para até 25% das apresentações clínicas acidente vascular cerebral, ocorre silenciosamente em taxas que podem ser 5-10 vezes maior, e contribui significativamente para o desenvolvimento de demência vascular. Alguns modelos de acidente vascular cerebral focal substância branca existir e esta falta de modelos apropriados tem dificultado a compreensão dos mecanismos neurobiológicos envolvidos na resposta a uma lesão e reparação após este tipo de acidente vascular cerebral. A principal limitação de outros modelos de acidente vascular cerebral subcorticais é que eles não focalmente restringir o enfarte e a substância branca ou foram validados principalmente em espécies não murinas. Isto limita a capacidade de aplicar a grande variedade de ferramentas de investigação para estudar o murino de acidente vascular cerebral neurobiologia substância branca. Aqui apresenta-se uma metodologia para a produção fiável de um acidente vascular cerebral focal em matéria branca murino utilizando uma injecção local de um inibidor de eNOS irreversível. Apresentamos também diversas variações no protocolo geral, incluindo dois estereotáxica únicavariações, traçando retrógrada neuronal, bem como de rotulagem tecido fresco e dissecação que expandir muito as potenciais aplicações desta técnica. Estas variações permitem múltiplas abordagens para analisar os efeitos neurobiológicos desta forma comum e pouco estudado de acidente vascular cerebral.

Introdução

O AVC que afeta a substância branca subcortical é uma entidade clínica comum, responsável por até 25% dos AVCs clínicos anualmente nos EUA ¹. O dano isquêmico à substância branca também ocorre silenciosamente a uma taxa significativamente maior e contribui para o desenvolvimento de demência vascular ^2,3. Atualmente, os pacientes com essa forma de isquemia cerebral têm poucas ou nenhuma opção de tratamento. Apesar da importância clínica dessa doença, existem poucos modelos animais clinicamente relevantes ^4,5.

O objetivo deste protocolo é produzir uma lesão isquêmica focal dentro da substância branca murina. Este modelo murino de doença humana permite o estudo específico da resposta da lesão axonal ao AVC e como os elementos celulares da substância branca, nomeadamente oligodendrócitos e astrócitos juntamente com axônios, respondem e se reparam após o AVC.

Relatórios anteriores descreveram um modelo de acidente vascular cerebral da substância branca subcortical usando endotelina-1 (ET-1) ⁶ que é semelhante ao descrito aqui. Várias mudanças importantes no protocolo experimental foram feitas, portanto, os usos potenciais desse modelo se expandiram ^7,8. Este protocolo fornece uma estratégia confiável e modificável para produzir um traço focal na substância branca do cérebro de camundongos.

As principais vantagens deste modelo são o uso de um inibidor químico da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitina HCl (L-Nio) ⁹ sem efeitos parácrinos conhecidos sobre elementos celulares da substância branca, que tem sido uma complicação de modelos usando endotelina-1 ¹⁰. Além disso, o direcionamento estereotáxico da substância branca no camundongo permite o uso de qualquer variedade de cepas transgênicas ou nocaute, expandindo muito as ferramentas disponíveis para determinar o efeito do derrame na substância branca do cérebro. Aqui, duas variações dessa técnica são descritas e demonstram algumas das variações adicionais que podem ser utilizadas para melhorar a compreensão dos danos axonais e da substância branca e do reparo após o AVC.

Protocolo

O uso de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pela University of California Los Angeles Animal Care e do Comitê Use.

Nota: Comece identificando a população murina alvo. Em estudos anteriores, do tipo selvagem ratinhos C57 / Bl6 machos única têm sido utilizadas, no entanto vários ratinhos transgénicos ou knockout também pode ser usado. Note-se que as coordenadas estereotáxicas baseiam-se em murganhos C57 / BL6 anatomia. Recomenda-se que cada usuário inicialmente verificar a localização do curso de substância branca.

1. Branco Matéria curso de indução - Medial Abordagem angular

1. Comece a preparação de uma pipeta de vidro removido utilizando tubo capilar 0,5 milímetros de tal modo que o diâmetro distai é entre 15-25 uM ^11.
2. Prepara-se uma alíquota de 10 ul estéril de L-NIO (N (5) - de HCl (1) -iminoethyl-L-ornitina) a 27,4 mg / ml (130 ^ M) em solução salina normal a 0,9% estéril.
3. Pré-encher a pipeta de vidro puxadocom um pequeno volume de L-NIO (2-5 ul) por meio da fixação do pipeta de vidro para a tubagem ligada a uma linha de vácuo. Deite o pipeta sobre a bancada de trabalho e inserir a extremidade puxado para dentro da solução de L-Nio.
   1. Aplicar o vácuo até pelo menos 2 mm da porção de 0,5 mm da pipeta é preenchido. Desligue o vácuo e retirar a pipeta. Colocá-lo de lado até Passo 1,12.
4. Colocar o rato numa câmara de indução e induzir anestesia do rato utilizando isoflurano padrão de 32% fluiu através de um vaporizador (5 L / min inalado com 5 L / min de oxigénio e 0,5 L / min _{de N2)} durante 1 minuto ou até profundamente anestesiados. Transferir o rato a um aparelho de estereotaxia equipado com um microscópio estereotáxica. Proporcionar a manutenção da anestesia utilizando 32% de isoflurano fluiu através de um vaporizador (2 L / min inalado com 5 L / min de oxigénio e 0,5 L / min _{de N2)} e um cone de nariz. Verifique a profundidade da anestesia com uma pitada dedo do pé.
5. Ajustar o braço de injecção para 36 °.
6. AffiXA puxado titular pipeta de vidro para a extremidade distal de um sistema de injecção de baixa pressão de volume e anexar ao braço de injecção da configuração estereotáxica.
7. Brasão bigodes do animal anestesiado com vaselina e colocar pomada lágrima artificial sobre ambos os olhos. Prepare um campo cirúrgico estéril, colocando uma cortina estéril sobre a cabeça do animal com um 5-10 cm de abertura sobre a cabeça. Prepare uma superfície cirúrgica aspetic raspando o pêlo que cobre o crânio. Limpar o couro cabeludo com a alternância de betadine e 70% compressas com álcool.
8. Adicione uma 1,5 centímetros incisão na linha média do couro cabeludo com uma tesoura fina estéreis para expor a superfície do crânio. Seca-se o crânio com uma mecha de algodão estéril e usando um microscópio de ampliação estereotáxica em 1-3X, remover qualquer tecido periostal sobrejacente usando uma ferramenta de micro ponto de estéril.
9. Marcar o bregma como ponto de referência usando um marcador de ponta fina.
10. Perfurar uma craniotomia ellipitical 2 mm, utilizando uma fina broca cirúrgica stip estéril0; começando posteriormente ao bregma e estendendo anteriormente apenas à esquerda da linha média. Retirar os fragmentos de osso e tecido mole sobrejacente de modo que o córtex cerebral pode ser visualizado.
11. Manter o campo cirúrgico e superfície cortical úmida, aplicando de forma intermitente gotas de solução salina estéril.
12. Juntar uma pipeta de vidro puxado para o braço do injector do aparelho estereotáxico. Alinhar a extremidade distal da pipeta com a bregma e zero as coordenadas estereotáxicas.
13. Avançar a pipeta para o primeiro anterior / posterior (A / P) e medial / lateral (M / L) coordenadas fornecidas na Tabela 1.
14. Avançar a pipeta para a superfície cortical e zerar o ventral (A / V D) Medição dorsal /.
15. Lentamente passar a pipeta no cérebro até atingir o primeiro D / V de coordenadas na Tabela 1.
16. Usando um sistema de injecção de baixa pressão de volume ajustado a 20 psi durante 20 pulsos ms, injectar 100 nl de L-NIO no cérebro e esperar cinco minutos para evitar o refluxoa pista pipeta.
    1. Use um retículo calibrado na ocular do microscópio estereotáxica e uma ampliação de 3X.
    2. Por conseguinte, deslocar um total de 0.100 mm ³ (comprimento com 0,5 mm de diâmetro de uma pipeta de 0,5 mm, correspondendo a 100 nl) a partir da pipeta de vidro puxado para cada conjunto de coordenadas. Usando uma bolsa, medir e padronizar uma vez que cada configurar varia dependendo da ampliação e escalas usadas.
    3. Para a medição do volume precisas durante cada injecção, a abordagem da pipeta em ângulo com o microscópio do lado de modo que o menisco hidroaéreo tem uma vista sagital. O menisco deve aparecer no mesmo plano focal de tanto a parede interior e exterior da pipeta.
17. Lentamente, retirar a pipeta e repita os passos 1.13-1.16.3 no segundo e terceiro conjunto de coordenadas fornecidas na Tabela 1.
18. Após a injecção final, remover a pipeta e colocar cera de osso suficiente para encher o local craniotomia. UMApproximate as bordas da ferida couro cabeludo e ligam-se com adesivo dérmico.
19. Injectar 0,1 mL de 0,5% Marcaine nas margens da ferida, usando uma agulha 30 G estéril para evitar a prevenir a dor associada com o local de incisão no couro cabeludo.
20. Devolver o animal para habitação e abastecimento de pós-operatório de antibióticos (0,48 mg / ml sulfametoxazoltrimetoprim, ou 0,5 mg / ml levofloxacina) na água de beber durante 5 dias.

2. Branco Matéria curso de indução - Posterior Abordagem angular

1. Execute os passos 1,1-1,12 como no protocolo de abordagem em ângulo medial, exceto ajustar o braço para injeções da configuração estereotáxica a 45 graus orientados anterior para posterior.
2. Avançar a pipeta para o primeiro A / P e M / L coordenadas fornecidas na Tabela 2.
3. Conclua as etapas restantes 1.14-1.20 como no protocolo de abordagem em ângulo lateral.

3. neuronal retrógrada Labeling

1. Prepare uma estéril 10aliquota ul de L-NIO a 54,8 mg / ml em 0,9% de solução salina normal.
2. Prepara-se uma aliquota de 20% estéril Fluororuby (ou 20% de amina dextrano biotinilado ou 2% de Fluorogold) em 0,9% de solução salina normal.
3. Dilui-se em conjunto 1: 1, para concentrações finais de 27,4 mg / ml de L-NIO e 10% Fluororuby.
4. Execute o protocolo de acidente vascular cerebral como acima nas etapas 1.3-1.23.
5. Visualizar o marcador nativamente fluorescente na secção de tecido por meio da fixação de perfusão, cryosectioning e microscopia, como descrito anteriormente ^8.

4. Processamento de tecido por imunofluorescência

1. Em um intervalo pós-AVC apropriada variando de 3 horas a 14 dias após o acidente vascular cerebral, eutanásia ratos através de overdose isoflurano ou IACUC locais procedimento aprovado.
2. Abrir a cavidade torácica com uma tesoura em ângulo e inserir uma agulha G 23 borboleta para o ventrículo esquerdo.
3. Coloque um pequeno corte no átrio direito com uma tesoura fina para permitir uma via de saída para o fluido de perfusão.
4. Transcardialmente perfundir com 30-40 ml de solução salina tamponada com fosfato fria seguido de 30-40 ml de paraformaldeído a 4% frio, a uma taxa de 10 ml / min à temperatura ambiente.
5. Decapitar o mouse e remover o cérebro usando uma tesoura esterilizada para abrir o crânio posteriormente e em seguida, remover suavemente a caveira sobreposta com uma espátula, coloque o cérebro em frio PFA 4% durante 24 h, e depois transferir para 30% de sacarose em PBS durante 48 horas .
6. Prepare secções de quarenta micron flutuante usando um criostato e executa o processamento de anticorpo, tal como anteriormente descrito ^6-8. Neste estudo, utilizar os seguintes anticorpos: (: diluição 1 500); de coelho anti-neurofilamento 200 de coelho anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); de coelho anti-Iba-1 (1: 1,000).

5. Processamento de Tecidos para a proteína ou RNA Análise

1. Em um intervalo pós-AVC apropriada variando de 3 horas a 14 dias após o acidente vascular cerebral, eutanásia através de overdose isoflurano ou IACUC locais procedimento aprovado.
2. decapitar orato e remover o cérebro usando uma tesoura esterilizada para abrir o crânio posteriormente e em seguida, remover suavemente a caveira sobreposta com uma espátula.
3. Inserir uma espátula estéril 4 milímetros na parte frontal do cérebro para cortar o bolbo olfactivo e os nervos ópticos. Suavemente levantar o cérebro para fora da calvária e colocar em tampão de dissecção gelado (Solução Salina Equilibrada de 1x Hank, 25 mM de HEPES-KOH, pH 7,4, glicose 35 mM, bicarbonato de sódio 4 mM, e 0,01 mg / ml de ciclo-hexamida).
4. Usando um bloco cérebro e novas lâminas de barbear estéreis, prepare lajes 2-3 mm contendo o curso e colocar em buffer de dissecção fria.
5. Sob um microscópio de dissecação, identificar o assunto córtex motor subjacente branca no hemisfério injetado. Em intervalos mais longos de pós-acidente vascular cerebral, a região pode ser visualmente identificado por necrose focal e palidez mielina.
   Nota: Em intervalos pós-AVC anteriores, a injecção de L-NIO misturado com 1 ul de 10% Fast Green pode permitir a identificação visual do acidente vascular cerebral ( Figura 4A).
6. Sob a orientação de um microscópio de dissecação e utilizando uma nova bisturi, dissecar cuidadosamente a região da substância branca que contém o acidente vascular cerebral, identificado por qualquer rotulagem Verde Rápido ou perda de tecido. Remover córtex sobrejacente e subjacente estriado como desejado.

Resultados

Usando o modelo apresentado, a matéria branca forelimb subjacente córtex sensório-motor confiável pode ser alvo. Este modelo de acidente vascular cerebral induzida quimicamente produz axonal focal e a perda de mielina, astrocitose e microgliose (Figura 1), como é tipicamente visto nos enfartes lacunares humanos. Usando três injeções, um modelo clinicamente útil é estabelecida com comprometimento precoce em tarefas motoras membro anterior ⁷ e uma pequena, mas s...

Discussão

Um número de modelos anteriores de acidente vascular cerebral subcorticais tenham sido descritos incluindo injecções focais de endotelina-1 para a cápsula interna, matéria branca subcortical e corpo estriado do rato ^{6,15 12-14} e rato. Modelos mais recentes de pequenos acidentes vasculares cerebrais focais têm utilizado a injeção microembolias colesterol na artéria carótida ¹⁶ e oclusão photothrombotic de um único arteríolas penetrantes ^17. Cada um destes modelos tem vantagens ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
L-N5- (1-Iminoetil) ornitina, dicloridrato	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurano	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Tubos capilares	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentação	Picospritzer II
Configuração estereotáxica	Kent Scientific	KSC51725
Extrator de pipetas	Modelo KOPF	720
Estereomicroscópio SZ51	Olympus	88-124
Tesoura fina	Fine Scientific Tools	14084-08
Fórceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Fórceps curvo	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Ferramenta de dissecação sem corte	Fine Scientific Tools	10066-15
Broca	Dremel	8220-1/28
Brocas	finas Ferramentas Científicas	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaína	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimetoprim-Sulfametaxol	STI Farmácia	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30 mg
Paraformaldeído	Fisher	O4042-500
Sacarose	Fisher	BP220-10
Criostato	Leica CM3050 S
Slides de vidro	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
	Agulha borboleta Nikon	SMZ1500
23 G	Fisher	14-840-35
10x Solução salina balanceada Hank's	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Bicarbonato de sódio	Sigma	S5761
Ciclohexaídeo	Sigma	01810