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Summary

Este manuscrito descreve um método simples e de alto rendimento para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos que é base de emulsões de água-em-óleo. Demonstramos a eficácia do método na montagem de clorofilas nativas com quatro variantes de água-solúvel em clorofila recombinante proteínas de ligação (WSCPs) de plantas Brassica expressos em E. coli.

Abstract

Clorofilas (CHLS) e bacteriochlorophylls (Bchls) são os principais co-fatores que realizam a colheita de luz da fotossíntese e de transporte de elétrons. Sua funcionalidade depende criticamente sobre a sua organização específica dentro grandes complexos de proteínas e elaborados múltiplas subunidades transmembrana. A fim de compreender a nível molecular destes complexos como facilitar a conversão da energia solar, que é essencial para compreender proteína de pigmento, e interacções pigmento de pigmento, e o seu efeito sobre a dinâmica excitados. Uma maneira de ganhar tal entendimento é através da construção e estudar complexos de Chis com proteínas recombinantes solúveis em água simples. No entanto, a incorporação dos Chis e Bchls lipofílicos em proteínas solúveis em água, é difícil. Além disso, não existe um método geral que pode ser utilizado para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui, demonstramos um sistema de transferência simples e alta à base de emulsões de água-em-óleo, o qual permite burroembly de proteínas solúveis em água com Chis hidrofóbicos. O novo método foi validado por reunião de versões recombinantes da proteína de ligação à clorofila solúvel em água de plantas Brassicaceae (WSCP) com Chl a. Nós demonstramos a montagem bem-sucedida de Chl A utilizando lisados ​​impuros de WSCP expressando E. célula de E. coli, que podem ser utilizados para o desenvolvimento de um sistema de tela genética para as proteínas de ligação Chl-solúveis em água novos, e para estudos de interacções proteína-Chl e processos de montagem.

Introduction

pigmentos hidrofóbicos, tais como clorofilas (CHLS), bacteriochlorophylls (Bchls) e carotenóides são os principais cofatores na centros de reação fotossintética e proteínas de colheita de luz que realizam transporte de elétrons, e captura de energia de luz e transferência. Os centros de reação e a maior parte dos complexos de colheita de luz Chl-ligação são proteínas transmembrana. A proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de não oxigênicos bactérias fotossintéticas-enxofre verde ^1,2 e a proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados ³ são exemplos excepcionais de proteínas de colheita de luz solúveis em água. A ligação de clorofila proteínas solúveis em água (WSCPs) de Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae e plantas Amaranthaceae ^{4, 5} são outro exemplo único, mas em contraste com FMO e PCP, estes não são nem envolvidos na captura de luz nem em qualquer um dos reacção fotossintética primária e sua phy precisafunções fisiológi- são ainda incerto ^5-8. A sua afinidade de ligação a Chl elevada conduziram a uma função sugerida como transportadores transientes de Chis e derivados de Chi ^9,10. Alternativamente, se a hipótese de que WSCP desempenha um papel importante na limpeza Chis em células danificadas e protege contra danos induzidos photooxidative-Chl ^7,11-13. Mais recentemente, sugeriu-se que as funções de WSCP como um inibidor de protease e desempenha um papel na resistência herbívoros assim regula a morte celular durante o desenvolvimento da flor ^14. WSCPs são divididos em duas classes principais de acordo com as suas propriedades fotofísicas. A primeira classe (classe I, por exemplo. De Chenopodium album) pode sofrer fotoconversão sobre iluminação. Classe WSCPs II de plantas Brassica, que não se submetem a fotoconversão ^5,10, estão subdivididos em classes IIa (ex., A partir de Brassica oleracea, Raphanus sativus) e IIb (por exemplo., De Lepidium virginicum </em>). A estrutura da classe IIb WSCP de Lepidium virginicum foi resolvida por cristalografia de raios-X em resolução de 2.0 a ^8. Ela revela um homotetrâmero simétrica em que as subunidades da proteína formar um núcleo hidrofóbico. Cada subunidade se liga a um único Chl o que resulta em um arranjo apertado de quatro Chis estreitamente empacotadas dentro das core.This simples arranjo todos Chl faz WSCPs um sistema modelo potencialmente útil para o estudo de ligação e montagem de complexos de Chl-proteína, e os efeitos da vizinha Chis e ambientes de proteína sobre as propriedades espectrais e eletrônicas de Chis individuais. Além disso, pode fornecer modelos para a construção de proteínas Chl vinculativos artificiais que podem ser utilizados para os módulos de luz de colheita em dispositivos fotossintéticos artificiais.

Estudos rigorosos de WSCPs nativas não são viáveis ​​porque os complexos purificados a partir de plantas contêm sempre uma mistura heterogénea de tetrâmeros com diferentes combinações de Chl ae Chl b ^9. Assim, um método para a montagem de WSCPs expressos de forma recombinante com Chis in vitro é necessário. Este é desafiada pela solubilidade em água desprezável de Chis que faz com que seja impossível montar o complexo in vitro misturando simplesmente as apoproteínas solúveis em água com pigmentos em soluções aquosas. Montagem in vitro misturando as apoproteínas com membranas de tilacóides ¹⁵ foi demonstrada, mas este método é limitado à Chis nativa presente nos tilacóides. Schmidt et ai. informou sobre a montagem de vários derivados de Chi e de Bchl com WSCP de couve-flor (CaWSCP), expressando de forma recombinante uma proteína marcada com histidina em E. coli imobilizando-o sobre uma coluna de Ni-afinidade e a introdução de derivados de Chi solubilizados em detergentes ^11. Com sucesso reconstituição do WSCPs recombinantes de A. thaliana ^6, e couves de Bruxelas (BoWSCP), nabo japonês (RshWSCP) umd Virgínia pepperweed (LvWSCP) por um método semelhante foram também relatados.

Aqui, apresentamos um romance, método geral, direto para a montagem de Chis com WSCP que não requerem marcação ou imobilizar as proteínas. Baseia-se na preparação de emulsões de suas soluções aquosas dos apoproteínas solúveis em água, em óleo mineral. As proteínas são assim encapsulados em água-em-óleo (W / O) microgotículas com superficial muito elevada em relação ao volume ^{de 16.} Os cofactores hidrofóbicos são, em seguida, dissolvido no óleo e são facilmente introduzidos nas gotículas da fase oleosa. Relatamos usando o método para a montagem de diversas variantes de apoproteínas WSCP recombinante expressos em E. coli com Chl a. Nós demonstramos a montagem a partir de lisados ​​em bruto de bactérias que sobre-expressam WSCP que podem ser utilizados como um sistema de rastreio para o desenvolvimento de novas proteínas de ligação de Chl.

Protocol

1. Preparar Chl um estoque Solutions Passo crítico: executar todos os passos de preparação de clorofila numa hote química, sob luz verde (520 nm) ou, no escuro, a fim de minimizar o fotoenvelhecimento. Sempre adicionar azoto ou árgon antes de congelar os pigmentos para armazenamento. Assegurar que todos os solventes são grau analítico. Pesar cerca de 5 mg de células Spirulina platensis liofilizadas ou outras células contendo apenas cianobactéria Chl a em tilacóides e esmagá-lo usando um almofariz e pilão. Carregar células trituradas numa coluna de vidro e lava-se com cerca de 50-100 ml de acetona a 100%, a fim de remover os carotenóides. Descarte a fração laranja / verde eluída. Nota: Se a fracção de laranja não é eluída com 100 ml de acetona continuar a lavagem das células com acetona até fracção verde começa a eluir. Acetona Exchange com 100% de metanol e recolher a fracção verde contendo Chl a. O volume de eluído fractião pode variar entre 50-100 ml. No início, a fracção eluida tem uma cor verde escuro, que muda para verde pálido na extremidade de eluição. Quando a cor da fraco elua se transforma em verde pálido parar a eluição. Evapora-se o metanol utilizando um evaporador rotativo até que o extracto é completamente seca. Não aplique calor para a solução; assegurar que a temperatura do banho de água do evaporador não exceda 30 ° C. Nota: O tempo de evaporação depende do volume da fracção de metanol a ser evaporado e pode variar entre 10-60 min. É importante secar o extracto completamente. Dissolve-se os pigmentos do extracto seco num pequeno volume de éter dietílico (cerca de 5-10 ml), e filtrar através de lã de algodão. Certifique-se de que os pigmentos são completamente dissolvido em éter, antes de filtrar. Evapora-se o éter dietílico até os pigmentos estarem completamente secos (10-30 min). Nota: Os pigmentos secos pode ser purgado com e mantido sob atmosfera de azoto ou árgon a -20 ° C, no escuro, até processamento posterior. Dissolve-se os pigmentos secos no menor volume possível de 100% de metanol (cerca de 1 ml), mesmo se não tudo está completamente suspenso. Adicionar 4 ml de acetona à solução, e agite suavemente o vidro, a fim de dissolver completamente os pigmentos. Usando uma pipeta de Pasteur, carregar a amostra suavemente sobre uma coluna de DEAE Sepharose equilibrada em 100% de acetona. carotenóides eluir (uma tira amarelo-laranja), com 100% de acetona. Então, eluir Chl a (faixa verde) com mistura 3: 1 v / v de acetona / metanol. Nota: O volume de acetona e mistura de acetona / metanol é aproximadamente equivalente ao volume de DEAE Sepharose carregada na coluna. Verifique Chl a pureza por cromatograf ia em camada fina utilizando uma 68: (v / v) de uma mistura 2 de diclorometano / n-hexano / isopropanol / metanol como eluente 17: 25: 5. Evapora-se o solvente usando um evaporador rotativo até que a Chl a é completamente seco (10-60 min). Nota: O Chl seco a pode ser purgado com azoto ou árgon e armazenados sob atmosfera de árgon à temperatura de -20 ° C no escuro. Prepare uma solução estoque Chl por re-dissolução do Chl a seco em 2-4 ml de etanol a 100%. Nota: O coeficiente de extinção de um Chl em 663 nm é 74.400 cm -1 m -1 (83,3 cm-1 (mg / mL) -1) em etanol. Uma solução de estoque típico deve ter uma DO de 1860 que corresponde a uma concentração de 25 mM (23 mg / ml). A adição de 20 ul desta lingua a uma emulsão contendo 5 ml de fase orgânica, e 1 mg de WSCP em 1 ml de resultados fase aquosa, de uma mistura com um excesso molar de 10 vezes de uma Chl vs. WSCP. 2. Preparar fase orgânica da emulsão Nota: A fase orgânica da emulsão é composta de óleo mineral contendo 4,5% (v / v) de Span 80 e 0,4% (v / v) de Tween 80. Pesa-se um tubo de 50 ml de 0,2 g de tween 80, 1,8 g de Span 80, e 38 g de óleo mineral. Misture bem todos os componentes e arrefecer no gelo. Nota: A fase orgânica pode ser armazenado em 4 ° C até uma semana. 3. Preparação da fase aquosa da emulsão Nota: A fase aquosa da emulsão pode ser composta de qualquer WSCP purificada ou extracto em bruto de bactérias que sobre-expressam WSCP. Preparar uma fase aquosa contendo WSCP purificada. Crescer as bactérias E. coli BL21 contendo o plasmídeo WSCP 12 em 1 L de meio LB a 37 ° C até à DO de 0,3-0,6. Induzir a expressão da proteína por adição de IPTG 1 mM. Após a indução crescer as bactérias a 30 ° C durante 12-16 hr. Colheita bactérias por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Dissolver o sedimento em tampão e sonicate vinculativo sobre gelo (30 seg on, 15 seg off, cinco vezes). Utilizar 10 ml de tampão para o sedimento, obtido pela centrifugação de 250 ml demeio LB com células que sobreexpressam a proteína. Nota: Dependendo do método de purificação, o tampão de ligação pode ser composta de 100 mM de tampão fosfato, pH 7,2 ou 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 5 mM de EDTA. Girar o lisado celular a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Purifica-se por cromatografia de afinidade WSCP. Dependendo da tag fundido com WSCP, purificar as proteínas recombinantes utilizando o sistema de cromatografia de afinidade comercialmente disponível adequado para a purificação de proteínas, seguindo as instruções do fabricante. Para a preparação da emulsão, utilizar WSCP purificada em tampão fosfato 50 mM, pH 7,8. Certifique-se de que a quantidade final de proteína utilizada para a reconstituição é de 0,5-1,0 mg por 1 ml de tampão. Preparar uma fase aquosa contendo lisado bacteriano em bruto com WSCP. Crescer as células de E. coli BL21 contendo WSCP-expressando plasmídeo em 250 ml de meio LB a 37 ° C até 0,3-0,6 OD. Induzem a expressão de proteínas com1 mM de IPTG e bactérias crescem durante a noite a 30 ° C. Colheita de células bacterianas por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Dissolve-se o sedimento em 1-2 ml de 50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,8, sonicar (30 seg ligado, 15 segundos desligado, três vezes) e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Preparar a fase aquosa da emulsão por mistura de 0,125 ml de sobrenadante com 0,875 mL de 50 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,8. 4. Montagem de WSCP com Chl a em Emulsão Transferência de 5 ml de mistura de óleo-agente tensioactivo para um frasco de vidro e arrefecer em gelo. Antes de pipetagem, verificar que todos os componentes da fase orgânica são muito bem misturados e não existe separação de fases entre tensioactivos e óleo mineral. Adicionar 1 ml de fase aquosa gelada preparadas como no ponto 3 a 5 mL de fase orgânica. Misturar ambas as fases, utilizando um homogeneizador de tecidos durante 2 min a 9500 rpm em gelo. ETAPA CRÍTICA: A partir dessa etapa, executar todas as medidas adicionais sob luz verde (520 nm), a fim de minimizar o fotoenvelhecimento. Adicionar 20 ul de 25 mM de Chl uma solução de estoque (ver secção 1.13) à emulsão. Dispersar sacudindo e invertendo o frasco de vidro. Certifique-se de que a Chl é distribuída uniformemente na emulsão. Incubar a emulsão durante 1-2 horas em gelo no escuro. A fim de quebrar a emulsão de gotas de água e separadas da fase orgânica transferir a emulsão para tubos de 1,5 ml de plástico e centrifugar a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: Se o conjunto é bem sucedido, a fase aquosa inferior deve ter uma cor verde. Descarte a fase de óleo superior e adicionar 1 ml de óleo mineral. Misture bem o óleo mineral com a emulsão sedimentado por vortex ou lançando o tubo completamente. Girar a amostra a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Repita este passo até um menisco clara separando o aquoso e mineiroal fases de óleo, sem qualquer emulsão intermédia é obtida. Execute esta etapa em uma capa química. Após as fases de óleo e aquosas minerais estão claramente separados, remover o óleo mineral e adicionar 1 ml de éter dietílico saturado com água. Vortex e girar a amostra a 14000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Repita esta etapa duas vezes. Após a segunda centrifugação, remover o éter dietílico e deixar os tubos abertos durante 5-20 minutos na capa. Finalmente, carregar a fase aquosa contendo o WSCP / Chl um complexo sobre uma coluna de dessalinização e elui-se com tampão apropriado para outras experiências. Nota: A proteína é estável em tampões de fosfatos e tris em uma ampla gama de pH (6,0-7,5). A amostra pode ser armazenada a 4 ° C protegida da luz até um mês.

Representative Results

Apoproteínas WSCP recombinantes foram montados com um Chl em emulsões / O w de acordo com o protocolo descrito na secção anterior. O protocolo foi implementado utilizando fases aquosas contendo os WSCPs puros, ou lisados ​​de células de E. coli que sobre-expressam WSCP (Figura 1). O protocolo é simples, rápida e não requer qualquer equipamento especial, exceto um homogeneizador de tecidos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-…

Discussion

O nosso objectivo foi desenvolver um novo sistema para a montagem geral de proteínas de ligação a clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui mostra-se que o novo sistema de reconstituição com base em W / O emulsão é uma abordagem geral comprovada para o trabalho para a montagem de apoproteínas WSCP de couves de Bruxelas, couve-flor, rabanete japonês e Virginia pepperweed recombinante expressos em E. coli. Aqui os resultados são apresentados a partir de reconstituição de 1 mg de W…

Materials

Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification