Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

Summary

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Abstract

Embora as mitocôndrias possuam sua própria maquinaria transcricional, apenas 1% das proteínas mitocondriais são sintetizadas dentro da organela. As proteínas codificadas no núcleo são transportadas para as mitocôndrias guiadas por suas sequências de direcionamento de mitocôndrias (MTS); no entanto, a maioria das proteínas localizadas mitocondriais não possui um MTS identificável. No entanto, o fato de que o MTS pode instruir proteínas a entrar na mitocôndria fornece uma ferramenta valiosa para estudar as funções mitocondriais de proteínas normalmente nucleares e / ou citoplasmáticas. Recentemente, identificamos o complexo quinase do ciclo celular CyclinB1 / Cdk1 nas mitocôndrias. Para estudar especificamente as funções mitocondriais desse complexo, a superexpressão mitocondrial e o knock-down desse complexo sem interferir em suas funções nucleares ou citoplasmáticas foram essenciais. Ao marcar CyclinB1 / Cdk1 com MTS, fomos capazes de alcançar a superexpressão mitocondrial deste complexo para estudar seus alvos mitocondriais, bem como funções. Por meio da marcação de Cdk1 dominante-negativo com MTS, a inibição da atividade de Cdk1 foi realizada particularmente nas mitocôndrias. Potenciais alvos mitocondriais do complexo CyclinB1 / Cdk1 foram identificados usando uma abordagem proteômica baseada em gel. Ao contrário da análise tradicional de gel 2D, empregamos a tecnologia de eletroforese em gel de diferença bidimensional (2D-DIGE) seguida de coloração de fosfoproteína para marcar fluorescentemente proteínas diferencialmente fosforiladas em células mitocondriais que expressam Cdk1. A identificação de manchas de fosfoproteína que foram alteradas no tipo selvagem versus mitocôndrias com Cdk1 negativo dominante revelou a identidade de alvos mitocondriais de Cdk1. Finalmente, para determinar o efeito da localização mitocondrial de CyclinB1 / Cdk1 na progressão do ciclo celular, um ensaio de proliferação celular usando um análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) foi usado para monitorar as células à medida que passam pelo ciclo celular e replicam seu DNA. Ao todo, demonstramos uma variedade de abordagens disponíveis para estudar a localização mitocondrial e a atividade de uma quinase do ciclo celular. Estes são métodos avançados, mas fáceis de seguir, que serão benéficos para muitos pesquisadores de biologia celular.

Introduction

Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) ^1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma ^2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose ³ e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados ^4.

Em proliferação de células de mamíferos, mito....

Protocol

1. Isolamento de mitocôndrias de células de cultura

1. Preparação de tampão de isolamento de células (IBC) Tampão
   1. Prepare 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N-morfolino) propanossulfónico): Dissolver 12,1 g de Tris em 800 ml de água destilada, ajustar o pH a 7,4 usando MOPS pó, adicionar água destilada até um total volume de 1 L e armazenar a 4 ^o C.
   2. Prepare a 0,1 M de EGTA (etileno glicol bis (éter 2-aminoetil) tetra-acético) / Tris: Dissolve-se 38,1 g de EGTA em 800 ml de água destilada, ajustar o pH para 7,4 utilizando Tris pó, adicionar água destilada até um volume total de 1 L e....

Results

Localização sub-mitocondrial de CyclinB1 e Cdk1

extracção de carbonato de sódio é usado para determinar se uma proteína está localizada no interior da mitocôndria ou na superfície exterior, ou seja, da membrana externa. Uma vez que uma proteína é mostrada para localizar dentro da mitocôndria, nova determinação da localização sub-mitocondrial pode ser feita através de mitoplasting combinado com digestão com pro.......

Discussion

Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem ^21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para proteínas alvo e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anticorpo secundário anti-camundongo	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 anticorpo
secundário anti-coelho	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugado
ATP	Research Organics	1166A	Para ensaio de quinase in vitro
Anticorpo Cdk1	Tecnologia de sinalização celular	9112
Tampão de quinase Cdk1 New	England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imagem	Life Technologies	C10337	Para análise do ciclo celular com marcação EdU
	Tecnologia de sinalização celular	4844S	para imunocoloração mitocondrial
Anticorpo Ciclina B1	Santa Cruz Biotech	sc-752
Complexo enzimático CyclinB1 / Cdk1 New	England Biolabs	P6020S	Evite congelar / descongelar
Kit de rotulagem de flúor CyDye DIGE	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel e kit tampão DIGE	GE Ciências da Vida em Saúde	28-9480-26 AA
Dimetilformamida	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	Para mutagênese dirigida ao local
Dpn I enzima	Stratagene	200519-53	Para mutagênese dirigida
ao local Fluido de cobertura de tira seca	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Usado como óleo mineral
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Usado como concentrador de centrífuga a vácuo
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Solução de montagem anti-desbotamento
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	Para ciclo celular análise com marcação EdU
Histona H1	Calbiochem	382150	Para ensaio de quinase in vitro
Kit de extração de gel QIAquick	Qiagen	28704	Para purificar fragmentos de DNA de géis de agarose
Géis Immobiline DryStrip	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	Tiras IEF (foco isoelétrico)
Glutationa imobilizada	Thermo Scientific	15160	Grânulos de glutationa-agarose
Iodoacetamida	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Unidade de Foco Isoelétrico	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	Suportes de tira IPGphor
Isopropil-b-D-tio-galactopiranosídeo	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptina	Sigma Aldrich	L9783	Para tampão de lise celular
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Reagente de transfecção
Lisina	Sigma Aldrich	L5501	Para rotulagem CyDye
Lisozima	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Vermelho/Verde	Invitrogen	M7512/M7514	Corantes fluorescentes mitocondriais
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	Vetor que expressa GFP
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53
Fluoreto de fenilmetilsulfonil	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 tubos de diálise	Spectrum Labs	132700	como tubo de membrana porosa para diálise
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	Para coloração de fosfoproteínas em géis 2D
Coquetel de inibidor de proteinase	Calbiochem	539134	Para tampão de lise celular
Kit de mutagênese dirigida ao local QuikChange	Kit Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit de isolamento	plasmídeo	Qiagen	27104
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Inibidor de Cdk1
Rotenona	MP Biomedicals	150154	Inibidor do Complexo I
Carbonato de sódio	Fisher Scientific	S93359
Cloreto de sódio	EMD Chemicals	SX0420-5	Para tampão de lise celular
Ortovanadato	de sódio MP Biomedicals	159664	Para tampão de lise celular
Pirofosfato de sódio decahidratado	Alfa Aesar	33385	Para tampão de lise celular
Sódio β-glicerofosfato	Alfa Aesar	L03425	Para tampão de lise celular
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pilão	Kimble Chase	885301-0007	Para isolamento de mitocôndrias
Tubo de triturador de tecidos	Kimble Chase	885303-0007	Para isolamento de mitocôndrias
Solução de ácido tricloroacético	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Tripsina	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Scanner de gel a laser para 2D-DIGE
Ubiquinona	Sigma Aldrich	C7956