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Artigo de método

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

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DOI:

10.3791/53417

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25 de fevereiro de 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Resumo

Embora as mitocôndrias possuam sua própria maquinaria transcricional, apenas 1% das proteínas mitocondriais são sintetizadas dentro da organela. As proteínas codificadas no núcleo são transportadas para as mitocôndrias guiadas por suas sequências de direcionamento de mitocôndrias (MTS); no entanto, a maioria das proteínas localizadas mitocondriais não possui um MTS identificável. No entanto, o fato de que o MTS pode instruir proteínas a entrar na mitocôndria fornece uma ferramenta valiosa para estudar as funções mitocondriais de proteínas normalmente nucleares e / ou citoplasmáticas. Recentemente, identificamos o complexo quinase do ciclo celular CyclinB1 / Cdk1 nas mitocôndrias. Para estudar especificamente as funções mitocondriais desse complexo, a superexpressão mitocondrial e o knock-down desse complexo sem interferir em suas funções nucleares ou citoplasmáticas foram essenciais. Ao marcar CyclinB1 / Cdk1 com MTS, fomos capazes de alcançar a superexpressão mitocondrial deste complexo para estudar seus alvos mitocondriais, bem como funções. Por meio da marcação de Cdk1 dominante-negativo com MTS, a inibição da atividade de Cdk1 foi realizada particularmente nas mitocôndrias. Potenciais alvos mitocondriais do complexo CyclinB1 / Cdk1 foram identificados usando uma abordagem proteômica baseada em gel. Ao contrário da análise tradicional de gel 2D, empregamos a tecnologia de eletroforese em gel de diferença bidimensional (2D-DIGE) seguida de coloração de fosfoproteína para marcar fluorescentemente proteínas diferencialmente fosforiladas em células mitocondriais que expressam Cdk1. A identificação de manchas de fosfoproteína que foram alteradas no tipo selvagem versus mitocôndrias com Cdk1 negativo dominante revelou a identidade de alvos mitocondriais de Cdk1. Finalmente, para determinar o efeito da localização mitocondrial de CyclinB1 / Cdk1 na progressão do ciclo celular, um ensaio de proliferação celular usando um análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) foi usado para monitorar as células à medida que passam pelo ciclo celular e replicam seu DNA. Ao todo, demonstramos uma variedade de abordagens disponíveis para estudar a localização mitocondrial e a atividade de uma quinase do ciclo celular. Estes são métodos avançados, mas fáceis de seguir, que serão benéficos para muitos pesquisadores de biologia celular.

Introdução

Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) 1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose 3 e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados 4.

Em proliferação de células de mamíferos, mitocondrial de ATP é gerado através da fosforilação oxidativa (FOX) construção (cadeia de transporte de electrões), o qual é composto por 5 complexos de multi-subunidades; Complexo I - V complexo (CI-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): oxidorredutase ubiquinona ou complexo I (CI) é a maior e menos compreendido dos cinco complexos de 5. O complexo Consists de 45 subunidades, das quais 14 formam o núcleo catalítico. Uma vez montado, o complexo assume uma estrutura em forma de L com um braço saliente na matriz e o outro braço incorporado na membrana interna 6,7. Mutações em subunidades de IC são a causa de uma variedade de doenças mitocondriais 8. Um IC funcionalmente eficiente em OXPHOS é necessário não só para a respiração mitocondrial geral 9, mas também para a progressão do ciclo celular bem sucedida 10. Unravelling os mecanismos subjacentes ao funcionamento deste complexo de enzima ligada à membrana na saúde e na doença pode permitir o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e estratégias terapêuticas avançadas. Em um estudo recente, verificou-se que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria na / (mitose) fase M (Gap 2) G2 e fosforila subunidades CI para aumentar a produção de energia mitocondrial, potencialmente, para compensar o aumento das necessidades energéticas das células durante celular ciclo de 11. Aqui nós showcase procedimentos experimentais e estratégias que podem ser usados ​​para estudar a translocação mitocondrial de cinases em contrário nucleares / citoplasmáticas, os seus substratos mitocondriais, bem como consequências funcionais da sua localização mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como um exemplo.

A constatação de que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria, quando necessário solicitado os estudos de sobre-expressão específicas de mitocôndrias e knockdown deste complexo. Para conseguir a expressão específica de mitocôndrias de proteínas, pode-se adicionar uma sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) no N-terminal da proteína de interesse. Mitocôndrias alvo sequências permitem a ordenação das proteínas mitocondriais na mitocôndria onde eles residem normalmente 12. Temos usado uma sequência de direccionamento 87 mitocôndrias de base derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) e clonado-lo em Green Fluorescent Protein (GFP) tagged CyclinB1 ou vermelho fluorescenteProtein (RFP) tagged Cdk1 contendo plasmídeos no quadro. Este método permitiu-nos atingir CyclinB1 e Cdk1 na mitocôndria, que alterou a expressão mitocondrial destas proteínas sem afetar sua piscina nuclear. Por fluorescente marcação destas proteínas, fomos capazes de monitorar a sua localização em tempo real. Da mesma forma, nós introduzimos MTS em um plasmídeo contendo marcado-RFP dominante negativo Cdk1, o que nos permitiu bater especificamente para baixo a expressão mitocondrial e funções de Cdk1. É essencial para distinguir entre as funções mitocondriais e nucleares das quinases que têm localizações dupla como Cdk1. Engenharia MTS para o N-terminal destas cinases funcionais duais oferece uma grande estratégia que é fácil de ser utilizado e eficaz.

Desde Cdk1 é uma quinase do ciclo celular, que é fundamental para determinar a progressão do ciclo celular quando Cdk1 está localizada dentro da mitocôndria. Para conseguir isso, nós utilizamos uma nova metod para monitorizar o conteúdo em ADN em células. Os métodos tradicionais incluem a utilização de BrdU (bromodesoxiuridina), um análogo da timidina sintética, que incorpora-se no ADN sintetizado de novo durante a fase S do ciclo celular para substituir timidina. Em seguida, as células que estão a replicar o seu DNA activamente pode ser detectada utilizando anticorpos anti-BrdU. Uma desvantagem deste método é que ele exige a desnaturação de ADN para fornecer acesso para o anticorpo BrdU por métodos agressivos como tratamento com ácido ou calor, o que pode resultar em inconsistência entre os resultados 13,14. Alternativamente, utilizou-se uma abordagem semelhante para monitorar as células que se dividem activamente com um análogo da timidina diferente, EdU. detecção EdU não requer desnaturação DNA dura como o tratamento detergente suave permite que o reagente de detecção para acessar o EdU no DNA recém-sintetizado. O método EdU provou ser mais confiável, consistente e com potencial para a análise de alto rendimento 15.

Finalmente, to determinar os substratos mitocondriais de Cdk1, usamos uma ferramenta proteômica chamado 2D DIGE, que é uma versão avançada do eletroforese em gel clássico bidimensional. Electroforese bidimensional separa as proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na primeira dimensão e o peso molecular na segunda. Uma vez que as modificações pós-traducionais, tais como fosforilação afectar o ponto isoeléctrico e o peso molecular das proteínas, géis 2D podem detectar diferenças entre os estados de fosforilação de proteínas nas amostras diferentes. O tamanho (área e intensidade) de proteína acaba alterações com o nível de expressão de proteínas, permitindo a comparação quantitativa entre múltiplas amostras. Usando este método, fomos capazes de diferenciar as proteínas fosforiladas no tipo selvagem contra células que expressam CDK1 segmentada por mitocôndrias mutantes. Os spots de proteínas específicas que mostraram no tipo selvagem, mas estavam faltando no mutante preparação Cdk1 segmentada por mitocôndrias foram isoladas eidentificado através de espectrometria de massa.

Nos geles 2D tradicionais, corantes de trifenilmetano são utilizados para visualizar as proteínas no gel. 2D DIGE usa rótulos proteína fluorescente com um efeito mínimo sobre a mobilidade eletroforética de proteínas. Diferentes amostras de proteínas podem ser marcados com diferentes corantes fluorescentes, misturados entre si e separadas por os géis idênticos, permitindo que a co-electroforese de amostras múltiplas com uma única gel 16. Isto minimiza as variações de gel-a-gel, o que é um problema crítico nos estudos proteómica à base de gel.

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Protocolo

1. Isolamento de mitocôndrias de células de cultura

  1. Preparação de tampão de isolamento de células (IBC) Tampão
    1. Prepare 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N-morfolino) propanossulfónico): Dissolver 12,1 g de Tris em 800 ml de água destilada, ajustar o pH a 7,4 usando MOPS pó, adicionar água destilada até um total volume de 1 L e armazenar a 4 o C.
    2. Prepare a 0,1 M de EGTA (etileno glicol bis (éter 2-aminoetil) tetra-acético) / Tris: Dissolve-se 38,1 g de EGTA em 800 ml de água destilada, ajustar o pH para 7,4 utilizando Tris pó, adicionar água destilada até um volume total de 1 L e armazenar a 4 ° C.
    3. Prepare 1 M de sacarose: Dissolver 34,23 g de sacarose em 100 ml de água destilada, fazer 20 ml alíquotas e armazenar a -20 o C.
    4. Preparar tampão c IB: preparar 100 ml de tampão de IB C por adição de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS e 1 ml de 0,1 M de EGTA / Tris a 20 ml; De 1 M de sacarose. Adiciona-se água destilada até um volume total de 100 ml. Ajustar o pH para 7,4.
  2. Preparação de tampão de lise celular
    1. Preparar o tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM (etileno diamino tetra-acético), 1 mM de EGTA, 1% de Triton-X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β- glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio. Adicionar inibidores de proteinase 1 ug / mL de leupeptina e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) imediatamente antes da utilização.
  3. Isolamento de mitocôndrias
    1. Colheita 3 x 10 7 células com gelo frio 1x PBS (Tampão fosfato salino), pH 7,4 e centrifugação as células a 600 xg durante 10 minutos a 4 o C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão c IB gelada.
    2. Homogeneizar as células usando um moedor de tecido de vidro / vidro por cerca de 10 min. Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min a 4 o C. Para mitocôndrias funcionais, usar acoplamento vidro / Teflon, pois é menos prejudicial para as mitocôndrias do que o triturador de tecidos de vidro / vidro.
    3. Recolhe-se o sobrenadante para tubos de 1,5 ml e centrifugar a 7000 xg durante 10 minutos a 4 o C. Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml e guardar a proteína citosol.
    4. Lava-se a pelete (mitocôndria) duas vezes com tampão de IB c arrefecida em gelo de 200 mL e centrifugação a 7000 xg durante 10 minutos a 4 o C.
    5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de lise de células e usar imediatamente ou armazenar a -80 ° C para uso futuro. Se forem necessários mitocôndrias funcionais, re-suspender o sedimento no tampão remanescente após o descarte do sobrenadante. Diluir a fracção mitocondrial ainda pode resultar na perda da função das mitocôndrias. Armazenar no gelo e utilize a preparação em 1-3 horas para obter melhores resultados.
    6. Sonicar a pelota foi ressuspensa por trinta rajadas 3-sec numabanho de gelo, centrifugar a 10000 xg durante 5 min, e guardar o sobrenadante como a fracção mitocondrial.

2. Co-imunocoramento Cdk1, CyclinB1 e COXIV, uma proteína mitocondrial Residente

  1. Cresça 5 x 10 4 células em lamelas em placas de 24 cavidades O / N ou até 70% de confluência. Aspirar o meio e lava-se as células duas vezes com 500 mL de gelo frio 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fixar as células com 500 uL gelada 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 10 min. Aspirar a solução fixadora e lavam as células com 500 ul de 1 x PBS 3 vezes, 5 minutos cada, com agitação suave à temperatura ambiente.
  3. Permeabilizar as células com 0,2% de Triton X-100 em 500 ul de PBS durante 5 min à TA. Aspirar a solução e lava-se as células 3 vezes, 5 minutos cada um com 500 ul de PBS. Adicionar a solução de bloqueio (500 ul, 1% de BSA (Albumina de Soro Bovino) em PBS contendo 1% de Tween 20) durante 30 min à TA.
  4. Dilui-se os anticorpos primários 1: 250 (v: v) em 5001; L de solução bloqueadora e incubar as células com anticorpos primários desejados levantadas em espécies diferentes para evitar a sinalização transversal (CyclinB1 (rato) e COXIV (coelho) ou Cdk1 (rato) e COXIV (coelho) à temperatura ambiente durante 30 - 60 min ou O / N a 4 o C.
  5. Lavam-se as lamelas com 500 ul de 1 x PBS 3 vezes, 5 min cada, e depois incubar com anticorpo secundário diluído 1: 1000 em 500 ul de solução à TA durante 1 h, seguida de lavagem com 500 ul de PBS 3 vezes, 5 min cada bloqueio.
  6. Montar as lamelas com 20 l de solução de montagem anti-fade e selar as lâminas com unha polonês. Imagem os slides usando um microscópio de fluorescência imediatamente ou manter no escuro a 4 ° C para 1 - 2 semanas.

3. Extracção de sódio Carbonato de mitocôndrias intactas

  1. Crescer aproximadamente 20 x 10 7 células, colheita, lavar uma vez com PBS e isolar mitocôndrias como descrito na seção 1. mitocondrial Divide isola em dois parTS antes da última centrifugação para sedimentar as mitocôndrias (antes do passo 1.3.4); salvo meio para ser utilizado como a mitocôndria total (passo 3.2), utilizar a outra metade para a extracção de carbonato de sódio (3,3-3,6 seguintes passos) para separar as proteínas ligadas membrana e solúveis.
  2. Lisar as mitocôndrias total de aglomerados com 30 ul de tampão de lise celular e armazenar o lisado a -80 ° C até serem usadas em imunotransferência.
  3. Adicionar 250 uL de 0,1 M de Na 2 CO 3 (carbonato de sódio), pH 11,0, para a outra metade do sedimento mitocondrial e incubar em gelo durante 30 min.
  4. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.5. Lyse o sedimento utilizando 30 ul de tampão de lise celular e sonicado como no passo 1.3.6. Armazenar a -80 ° C até ser usado em immunoblotting.
  5. Adicionar um volume igual de 20% de ácido tricloroacético acabado de fazer (TCA) para o sobrenadante, para precipitar as proteínas e manter em gelo durante 30 min.
  6. CentrifUGE a 15000 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante, dissolve-se o sedimento em 80 ul de tampão de lise celular e armazenar a -80 ° C até serem usadas em imunotransferência.

4. Separação de interior e exterior membranas das mitocôndrias (Isolamento de Mitoplasts)

  1. Crescer aproximadamente 20 x 10 7 células, colheita, lavar uma vez com PBS e isolar mitocôndrias tal como descrito na secção 1. Separam-se as fracções mitocondriais em 10 porções iguais antes da última centrifugação para sedimentar as mitocôndrias (antes do passo 1.3.4).
  2. Dissolve-se cada pelete em 30 ul da concentração indicada de tampão de sacarose hipotónico (1 mM de EDTA, 10 mM de MOPS / KOH (hidróxido de potássio), pH 7,2; concentração de sacarose que varia 25-200 mM) com ou sem 50 ug / ml de tripsina ( ver Tabela 1) e incubar 30 minutos em gelo.
  3. Adicionar 3 mL de PMSF 10 mM (para atingir uma concentração final de 1 mM de PMSF), para a tripsina contendo frascos T para pararele digestão com tripsina e incubar em gelo durante 10 min.
  4. Centrifuga-se a 14000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, lisar o granulado em 30 ul de tampão de lise celular, sonicado como no passo 1.3.6, e armazenar a -80 o C.

5. Construção de mitocôndrias-alvo GFP / CyclinB1 marcado-RFP / Cdk1 vetores e confirmação da sua localização mitocondrial

  1. Clonar as mitocôndrias sequência de direccionamento (MTS; derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) entre os nucleótidos 76 - 161) na moldura para o terminal N de GFP ou RFP nos locais NheI e BamHI do pEGFP-N1 ou pERFP vectores -N1 utilizando técnicas convencionais de clonagem molecular.
  2. Ao conceber iniciadores de PCR para os genes CyclinB1 e CDK1, adicionar locais BamHI de reconhecimento de enzimas de restrição (negrito) para a 5 'dos ​​iniciadores de PCR.
    Adiante Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Reverter Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Adiante CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Reverter CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Amplificar os genes CDK1 e CyclinB1 utilizando estes iniciadores seguindo as técnicas convencionais. Digerir o produto de PCR com 1 ul de enzima de restrição BamHI a 37 ° C durante 2 h. Executar os produtos de digestão num gel de agarose 1%. Usando uma lâmina de barbear, cortar os fragmentos de ADN -sized correctas para fora e purifica-se o ADN a partir do gel utilizando um kit de extracção de gel.
  4. Digerir 1 ug de MTS-pEGFP-N1 e plasmídeos MTS-pERFP-N1 com 1 ul de enzima BamHI a 37 ° C durante 2 h. Adicionar 1 ml de Calf-IntesTiNAl fosfatase alcalina (CIP) durante 30 min a 37 ° C. Executar os produtos de digestão num gel de agarose 1% e purifica-se os plasmídeos lineares de gel como no passo 5.3.
  5. Defina-se uma reacção de ligação por adição de 1 ul de plasmídeo a partir do Passo 5.4 e 5 ul de Cdk1 ou CyclinB1 do Passo 5.3 a 3 ul de tampão ligase, 0,5 ul de ligase de T4, e 20,5 uL de dH2O Incubar O / N a 4 ° C.
  6. Transformar Escherichia coli DH5a competentes células com 10 uL da mistura de ligação de acordo com técnicas padrão e crescer as bactérias em 10 mg / ml de canamicina contendo agar LB placas de O / N a 37 ° C para se obter colónias.
  7. Escolher uma colónia de O / N placas crescidos utilizando uma ponta de pipeta estéril, insira a ponta a 5 ml de canamicina-LB contendo tubo e incubar O / N. Isolar o plasmídeo utilizando kits miniprep de acordo com o protocolo do fabricante, e a sequência do plasmídeo usando técnicas padrão.
  8. Transfectar exponencialmente crescente MCF1Células 0A (1,5 x 10 4 células semeadas em placas de 96 poços) com MTS-Cdk1-RFP ou MTS-CyclinB1-GFP plasmídeos a partir do Passo 5.7, preparando uma razão de reagente de plasmídeo / transfecção de 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 ul) no sérica de 100 mL e meio sem antibiótico.
  9. Incubar as células em plasmídeo mistura / reagente durante 48 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 com controlo de humidade (5% de CO2, 95% de humidade relativa).
  10. Preparar solução de reserva 1 mM de corantes fluorescentes vermelho e verde mitocondriais por dissolução de 50 g de pó em 100 ul de DMSO. Dilui-se a soluções de 1: 400 em PBS 1X para se obter 2,5 uM soluções de trabalho. As soluções de reserva pode ser armazenado a -20 ° C durante um ano.
  11. Misturar 2 ul de 2,5 uM de corante vermelho com 98 ul de meio de cultura para preparar uma concentração final de 50 nM.
  12. Substituir o meio de cultura de células de CyclinB1-GFP rolamento células MCF10A (gerados no passo 5.8) com corante vermelho contendo meio durante 2 min. Repita omesmo procedimento com corante verde para células MCF10A rolamento Cdk1-RFP.
  13. Lave duas vezes com 100 mL 1 x PBS para se livrar da solução de coloração em excesso, adicione 100 mL 1x PBS à placa de 96 poços.
  14. Visualizar a mitocôndria e CyclinB1-GFP (por excitação a 488 nm e emissão a 494-536 nm) e Cdk1-RFP (excitação por 560 nm e emissão a 565-620 nm) em placas de 96 poços sob o microscópio de fluorescência a 40x de ampliação.

6. Identificação de fosforiladas Proteínas diferencialmente através 2D-DIGE

  1. Preparação de amostra
    1. Isolar mitocôndrias e lisar frações mitocondriais como no Passo 1.3. Adicionar um volume igual de 20% de TCA (ácido tricloroacético em água) a cada amostra e vortex durante 15 seg. Incubar as amostras em gelo durante 30 min como as proteínas precipitar para fora da solução.
    2. Centrifugar as amostras a 9300 xg, a 4 ° C durante 5 minutos, remover o sobrenadante e adicionar 60 ul de acetona fria (100%) seguido porcentrifugação a 9300 xg, a 4 ° C durante 5 min.
    3. Repetir o passo de lavagem com acetona (Passo 6.1.2) mais uma hora, remover o sobrenadante e suspender novamente as amostras em 50 uL de tampão de rotulagem DIGE (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Prepare o corantes fluorescentes
    1. Preparar a solução de estoque: Dissolve-se corantes (5 nmol) em 5 mL de formamida de dimetilo fresco (DMF) a uma concentração final de 1 nmol / l. Guardar a solução estoque de corantes à temperatura de -20 ° C até à sua utilização por alguns meses.
    2. Preparar solução de trabalho: Permitir corantes para definir à TA durante 5 min. Dilui-se 1 ul de corante com 4 mL de DMF a uma concentração final de 200 pmoles / ul. Manter em gelo durante o uso. Nota: A solução de trabalho pode ser mantida a -20 ° C durante 3 semanas.
  3. Proteínas de etiqueta
    1. Misturar 1 uL de solução de trabalho de corante por 12,5 mg de proteína. Intensificar conforme necessário. Para os padrões combinados, adicione 61; L de solução de trabalho Cy2 a 300 ug de proteína reunidas.
    2. Vortex durante 30 segundos e centrifugar a 4 ° C durante 30 segundos a 12.000 x g. Incubar em gelo no escuro durante 30 min. Pare a rotulagem através da adição de 1 ml de lisina 10 mM por 1 mL de solução de trabalho utilizados. Misturar bem e incubar em gelo no escuro durante 10 min.
    3. Piscina rotulados individualmente amostras e misturar-se com tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, azul de bromofenol). O volume total será de 125 ul.
    4. amostras vortex durante 30 seg e permitir que as amostras para definir a TA durante 30 min. Carga de 125 l de amostras sobre sete centímetros pH 4-9, focagem isoeléctrica (IEF) Tiras.
  4. Electroforese primeira dimensão
    1. Coloque os titulares Strip (caixões) na placa de eletrodo, certificando-se os titulares de tiras são completamente limpos e secos. Pipetar 125 amostras ul em um caixão, espalhando uniformemente em todo o caixão.
    2. usando tweezers, pegar a tira IEF, retire cuidadosamente a tampa protectora de plástico e coloque-o (lado gel para baixo) no tampão caixão / reidratação. Evite bolhas de interceptação. Lentamente encher caixão (1 - 1,5 ml) com óleo mineral e colocar o caixão cobre sobre os caixões.
    3. Comece a focagem isoeléctrica seguindo o protocolo da Tabela 2:
      Nota: Uma vez que o prazo é completa, as tiras podem ser armazenadas em tubos de plástico a -80 ° C ou diretamente mudou-se para o equilíbrio e a segunda dimensão.
  5. Segunda dimensão - dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida de electroforese (SDS-PAGE)
    1. Equilíbrio
      1. Descongelar tampão de equilíbrio de SDS (8 ml por tira, 6 M de ureia, 30% glicerol, 2% SDS). Pesar ditiotreitol (DTT; 10 mg de DTT por 1 ml de tampão de equilíbrio SDS). Dissolve-se TDT em 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS.
      2. Pesar IAA (iodoacetamida, 25 mg de IAA por 1 ml de tampão de equilíbrio SDS).Dissolver IAA em 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS.
      3. Melt 1 ml de solução de agarose de vedação em um banho de água para uso posterior.
      4. Se as tiras foram congelados, permitir-lhes para descongelar completamente. Coloque tiras lado gel-se na bandeja de reswelling. Adicionar 4 ml de tampão de equilíbrio de SDS com DTT a cada tira e incubar durante 15 min com agitação suave.
      5. Deitar fora todo o tampão de equilíbrio SDS com a TDT. Adicionar 4 ml de tampão de equilíbrio com IAA SDS a cada tira e incubar durante mais 15 min com agitação suave. Após o equilíbrio com o tampão de IAA, derrame do tampão de equilíbrio de SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Desembrulhar mini-géis, retire o pente e lavar o gel e os poços com DDH 2 O. Remover a fita branca na parte inferior do gel antes de executar. Orientar a tira no gel corretamente, orientação gel é fundamental para o corte local.
      2. Coloque o plano gel no contador com a pequena placa de cima e de cima gel de frente experimenter. Colocar a tira sobre a placa de extremidade de altura com anódica (++ terminar com o código de barras) voltado para o lado esquerdo do gel. Usando uma régua, empurrar lentamente a tira para baixo na superfície gel. Evite bolhas de interceptação entre a tira eo gel. Suportar o gel em uma posição placa de vidro.
      3. Adicionar 1 ml de solução de agarose quente para selagem da abertura da cassete. Certifique-se de todas as bolhas de ar são pressionadas para fora usando uma régua plana. Montar o aparelho de funcionar e o gel a uma constante de 125 V durante 90 min.
      4. Quando o gel termina a execução, coloque o gel em um imager biomolecular com 2 ml DDH 2 O e digitalizar o gel em modo de aquisição de fluorescência com 635 nm laser de excitação e 665 filtro de emissão nm.
    3. fosfoproteína coloração
      1. Corrigir o gel com 50% de metanol e 10% de mistura de ácido acético (10 ml) durante 30 min, duas vezes. Lava-se com 10 ml de água durante 10 minutos e três vezes com 10 ml de mancha fosfoproteína mancha por 60 - 90 min, seguido peladescoloração com 10 ml destain solução para 30 min três vezes.
      2. Lavar com 10 ml de água a 5 min duas vezes e imagem do gel com um scanner de gel de laser a 532 nm / 560 nm excitação / emissão.
    4. Proteína Digestão e Identificação
      1. Especial de consumo de todos os pontos de proteínas diferencialmente expressas a partir do gel em poços de microplacas utilizando um local-robot de recolha de acordo com as especificações do fabricante, e adicionar bicarbonato de amónio 100 mM (2 mL) durante 1 hora à TA a Destain os pedaços de gel. Desidratar com 2 ml de 100% de acetonitrilo lavar duas vezes e seco num concentrador de vácuo durante 30 min.
      2. Re-hidratar os pedaços de gel com 100 ul de 13 ng / mL de tripsina porcina modificado em bicarbonato de amónio 50 mM durante 16 horas a 37 ° C. Recolhe-se os sobrenadantes e extrai-se ainda mais as proteínas com 100 ul de ácido trifluoroacético a 5% em 50% de acetonitrilo durante 30 min.
      3. Concentra-se os péptidos para baixo para 5 ul por centrifugação de vácuo concentrador e analisar com Matrix Assisted Laser dessorção de ionização - Time of Flight - tandem análise de espectrometria de massa (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro Ensaio de Quinase

  1. Preparação de Substratos
    1. Sub-clone de complexo I (CI) subunidades (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, e NDUFA12), que são identificados como alvos diferencialmente fosforilados CDK1, em pGEX-5X-1 para gerar vector de glutationa-S-transferase (GST) tagged plasmídeos de expressão bacteriana 11. Purifica-se subunidades CI Utilizando as colunas de afinidade de glutationa alta seguindo o protocolo abaixo.
      1. Cultura de GST-tagged subunidade CI contendo Escherichia coli estirpe BL-21 em caldo com 50 ug / ml de ampicilina num agitador a 37 ° C de Luria-Bertani (LB) até uma densidade óptica (DO) de 0,6 foi atingido. Adicionar isopropil-BD-tio-galactopiranósido (IPTG) ao cultoure, a uma concentração final de 0,1 mM, e incubar durante mais 3 horas.
      2. Centrifuga-se a 600 xg durante 10 minutos para recolher as bactérias e re-suspensão em 5 ml de tampão 1 x PBS contendo 5 mM de DTT, 1 x cocktail inibidor de proteinase, e 0,1% de lisozima. Lisar as células por sonicação durante 5 s vinte rajadas, e remover os restos celulares por centrifugação a 600 xg durante 10 min.
      3. Recolhe-se o sobrenadante e incubar com 4B de glutationa-agarose em uma proporção em volume de 4: 1 (sobrenadante: grânulo) durante 1 h à TA.
      4. Elui-se as proteínas de fusão com GST a partir dos grânulos com 3 ml de tampão de glutationa de eluição (10 mM de glutationa reduzida em mM Tris-HCl, pH 8,0 a 50) e sujeitar as proteínas eluidas a diálise em tubo de membrana porosa molecular (cut-off de peso molecular 12 -14 quilodaltons) com EDTA 1 x PBS / 1 mM. Armazenar as proteínas purificadas a - 80 o C.
  2. Cdk1 Kinase Assay
    1. Antes de iniciar o rabo quinaseay, definir blocos de aquecimento a 30 ° C e 100 ° C. Thaw CyclinB1 / complexo comercial enzima Cdk1 e substratos no gelo.
    2. Preparar a mistura de reacção em gelo. Desde 32 P ATP isótopo está envolvido, preparar todas as misturas de reacção em tubos de 1,5 ml da amostra com tampas de rosca contendo um anel O para evitar a disseminação da radioatividade.
      Cuidado: Siga as regras de protecção de material radioativo. Use um de 8 mm de espessura Plexiglas Blindagem e de trabalho, pelo menos, à distância de um braço. Limpe qualquer área contaminada com água.
    3. Preparar um tampão de reacção de 30 ul contendo 1 x tampão de Cdk1 (Tris-HCl 50, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM de ATP frio, 0,1 uCi de 32 P ATP, 2 unidades de CyclinB1 / Cdk1 e 6 ug de proteína de substrato. Ajuste o volume para 30 mL com DDH 2 O. Por reacção de controlo positiva, substituir o substrato com 0,01 mM histona H1, um CyclinB1 / substrato Cdk1 bem conhecido.
      1. Para contro negativoreacções l, (1) substituir o substrato, com apenas proteína GST e (2) substituir o substrato com 0,01 mM de Histona H1 + 0,5 fiM RO-3306, um inibidor selectivo Cdk1.
    4. Misturar bem com pipeta e centrifugar para levar o líquido para o fundo do tubo, minimizando o risco de contaminação. Incubar a 30 ° C durante 60 min.
    5. Adicionar 6 ul de tampão de amostra de SDS 5x para parar a reacção e desnaturar a 100 o C durante 10 min. Executar amostras em gel de SDS-PAGE a 10% a 160 V durante 2 horas, ou até a frente do corante atingiu a extremidade do gel. Transferir gel num papel de cromatografia e embrulhe com filme plástico.
      Atenção: Todos os líquidos em contacto com radioisótopos devem ser tratados como resíduos radioactivos e eliminados de um garrafão de 5 litros poli fornecida pelos serviços de saúde e de segurança ambiental conforme as diretrizes institucionais.
    6. Expor o gel a película de raios X durante 1 dia ou até uma semana à temperatura de -20 ° C, dependendo da actividade específica do radioisótopo usadoe a enzima.

8. mutagénese dirigida para gerar Dominante Cdk1 Negativo (D146N)

  1. primers projeto mutagênese; dois iniciadores, complementares uns aos outros, contendo o sítio mutante (L será substituído por um nucleótido de codificar para N em vez de D aminoácido) flanqueada por 20 bases de cada lado 11.
  2. Prepara-se uma 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) de uma mistura contendo 1x tampão de reacção, dNTP 2,5 mM, 10 uM de iniciadores (tanto para a frente e para trás), 40 ng do modelo, e ddH 2 O. Adicionar 2,5 L de polimerase de ADN na reacção.
  3. Executar o seguinte programa de PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 seg, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 ciclos (Nota: 68 ° C tempo de incubação é determinado pelo tamanho do DNA 1 min / kb é necessário para ADN ≤ 10 kB para o ADN maior, 2 min / kb, mais 10 segundos por ciclo..). Siga pela 68 ° C 7 min e mantenha a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
  4. Adicionar2 ul da enzima de restrição Dpnl (10 U / ul) e 5,7 ul de tampão Dpnl, misturar bem com toque suave com o dedo e incubar a reacção a 37 ° C durante 1 h.
  5. Transferir 10 uL Dpnl-tratados produtos de PCR em 50 ul de células competentes DH5a para transformação. Incubar em gelo durante 30 min, seguido por 45 segundos de choque térmico a 42 ° C e 5 min em gelo. Adicionar 500 mL de LB e agitar a 37 ° C durante 1 hora antes do plaqueamento em placas de LB-agar. Incubar O / N a 37 o C.
  6. Escolha uma colônia do O / N crescido placas de agar utilizando uma ponta de pipeta amarela estéril, gota a ponta para um tubo contendo 5 ml de LB, e crescer O / N em um C shaker 37 o. Isolar o plasmídeo utilizando um kit de miniprep e a sequência do plasmídeo para confirmar a mutação de acordo com o protocolo do fabricante.

9. Determinação da Fase do Ciclo Celular comprimentos com EdU Ensaio de Incorporação

  1. Separação celular
    1. Transfect 2 x 10 5 células com vectores indicados (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-RFP ou MTS-Cdk1-DN-RFP) numa placa de 6 poços utilizando 1: 2 (w: v , 2,5 g: 5 ul) proporção de DNA: Transfection Reagent mistura preparada em 2,5 ml sérica e antibiótico meios de cultura livre para 48 horas. células de ordenação ao vivo expressando estavelmente as proteínas CyclinB1-GFP marcado Cdk1 e marcou-RFP através de citometria de fluxo.
      1. Lavar as células com 1 x PBS, adicionar 100 uL de tripsina para o prato e incubar a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 2 ml de meio de cultura para recolher as células e passá-los através de um filtro de 70 | iM para gerar uma suspensão de célula única. Lava-se a suspensão de células individuais com 500 ul de 1% de soro fetal de vitela em PBS (FCS / PBS) antes de colocá-los no citómetro de fluxo.
      2. Configurar os parâmetros de classificação seguintes protocolos estabelecidos 18 gating para células duplamente positivas coradas com ambos GFP e RFP. Recolher as células ordenadas saindo do citômetro em um tubo contaimédio e cultura de células ning usar essas células para análise da progressão do ciclo celular com rotulagem EdU pulse-chase como no protocolo 9.2.
  2. Medição da duração do ciclo celular utilizando o ensaio de citometria de fluxo EdU Etiquetagem
    1. Semear as células classificados em placas de 6 poços a uma densidade de 2,5 x 10 5 células por poço e cultura O / N a 37 ° C numa incubadora com CO 2. Adicionar EdU para o meio de cultura a uma concentração final de 25 uM. Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO 2 durante 1 h.
    2. Lavar as células com 1% de BSA em 500 ul de PBS e recolhê-las em um tubo de 1,5 mL em intervalos de 2 horas para um total de 10 - 12 h.
    3. centrifugar células a 350 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante. Desalojar o sedimento através da adição de 100 ul de solução de fixação (fornecida pelo fabricante, com o kit de marcação de EdU) durante 15 min à temperatura ambiente e misture bem.
    4. Lavar as células com 1 ml de 1% de BSA em PBS três vezes. corrigir océlulas de novo com 0,5 ml de etanol a 70% O / N a 4 o C.
      Nota: fixação Etanol é fundamental para extinguir a fluorescência da GFP / RFP interna devido à expressão da proteína recombinante marcado.
    5. Centrifugar as células novamente em 350 xg durante 5 min e lava-se a pelete com 1 ml de 1% de BSA em PBS uma vez. Re-suspender as células em 1 ml de tampão de permeabilização (0,1% de Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml de RNase A em PBS) durante 20 min à TA.
    6. Lavar as células com 1 ml de 1% de BSA em PBS uma vez. Adicionar 0,5 ml de mistura de reacção em cada tubo e misturar bem. Incubar mistura reaccional à TA durante 30 min no escuro.
    7. Lava-se com 1 ml de BSA a 1% em PBS e uma vez com ADN mancha 50 ug / mL de iodeto de propídio (PI) em 1 ml de 1% de BSA em PBS.
    8. Analisar as células por citometria de fluxo a seguir a população EDU-positiva. gráfico de dispersão de pontos presente de células EDU-rotulados coradas para conteúdo de DNA (coloração PI, eixo X) e Edu (Alexa 647 de coloração, eixo Y).
      1. Use canal APC para Alexa647-EDU utilizando um filtro de passagem de banda 670/30 com todos os presentes luz inferior a 685 nm atingir esse filtro; e ficoeritrina (PE) para o canal de PI com um filtro passa-banda de 581/15 em frente do mesmo com toda a luz presente menos do que 600 nm atingir esse filtro.
      2. Insira as primeiras células do tubo contendo na citometria de fluxo e usar uma estratégia de gating padrão para aquisição: Lote FSC-Area X SSC-área para a morfologia seguido de PI (canal PE) X Alexa647-EDU (canal APC) para a coloração celular. Gravar dados para todos os tubos, um por um aquisição de 10.000 eventos por amostra.
      3. Determinar a distribuição de fases do ciclo celular das células e comprimentos de fase utilizando um software de análise de citometria de fluxo de dados de acordo com protocolos estabelecidos 11,30.

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Resultados

Localização sub-mitocondrial de CyclinB1 e Cdk1

extracção de carbonato de sódio é usado para determinar se uma proteína está localizada no interior da mitocôndria ou na superfície exterior, ou seja, da membrana externa. Uma vez que uma proteína é mostrada para localizar dentro da mitocôndria, nova determinação da localização sub-mitocondrial pode ser feita através de mitoplasting combinado com digestão com pro...

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Discussão

Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem 21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para proteínas alvo e...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH CA133402, CA152313 e Departamento de Energia Office of Science DE-SC0001271. Agradecemos ao Laboratório de Recursos Compartilhados de Citometria de Fluxo da Universidade da Califórnia Davis com financiamento do NCI P30 CA0933730 e subsídios de 026825 NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 e S10 RR e com assistência técnica da Sra. Bridget McLaughlin e do Sr. Jonathan Van Dyke por sua ajuda com os experimentos de citometria de fluxo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Anticorpo secundário anti-camundongoInvitrogen A-11003Alexa-546 anticorpo
secundário anti-coelhoInvitrogen A11029Alexa-488 conjugado
ATPResearch Organics1166APara ensaio de quinase in vitro
Anticorpo Cdk1Tecnologia de sinalização celular9112
Tampão de quinase Cdk1 NewEngland BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imagemLife TechnologiesC10337Para análise do ciclo celular com marcação EdU
Tecnologia de sinalização celular4844Spara imunocoloração mitocondrial
Anticorpo Ciclina B1Santa Cruz Biotechsc-752
Complexo enzimático CyclinB1 / Cdk1 NewEngland BiolabsP6020SEvite congelar / descongelar
Kit de rotulagem de flúor CyDye DIGEGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel e kit tampão DIGEGE Ciências da Vida em Saúde28-9480-26 AA
Dimetilformamida Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Para mutagênese dirigida ao local
Dpn I enzimaStratagene200519-53Para mutagênese dirigida
ao local Fluido de cobertura de tira secaGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Usado como óleo mineral
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13Usado como concentrador de centrífuga a vácuo
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Solução de montagem anti-desbotamento
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908Para ciclo celular análise com marcação EdU
Histona H1Calbiochem382150Para ensaio de quinase in vitro
Kit de extração de gel QIAquickQiagen28704Para purificar fragmentos de DNA de géis de agarose
Géis Immobiline DryStripGE Healthcare Life Sciences18-1016-61Tiras IEF (foco isoelétrico)
Glutationa imobilizadaThermo Scientific15160Grânulos de glutationa-agarose
IodoacetamidaSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 Unidade de Foco IsoelétricoGE Healthcare Life Sciences11-0033-64Suportes de tira IPGphor
Isopropil-b-D-tio-galactopiranosídeo RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinaSigma AldrichL9783Para tampão de lise celular
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Reagente de transfecção
LisinaSigma AldrichL5501Para rotulagem CyDye
LisozimaEMD Chemicals5960
Mitoctracker Vermelho/VerdeInvitrogen M7512/M7514Corantes fluorescentes mitocondriais
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1Vetor que expressa GFP
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53
Fluoreto de fenilmetilsulfonilShelton ScientificIB01090PMSF
Solução salina tamponada com fosfatoLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 tubos de diáliseSpectrum Labs132700como tubo de membrana porosa para diálise
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300Para coloração de fosfoproteínas em géis 2D
Coquetel de inibidor de proteinaseCalbiochem539134Para tampão de lise celular
Kit de mutagênese dirigida ao local QuikChangeKit Stratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit de isolamentoplasmídeoQiagen27104
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Inibidor de Cdk1
RotenonaMP Biomedicals150154Inibidor do Complexo I
Carbonato de sódioFisher ScientificS93359
Cloreto de sódioEMD ChemicalsSX0420-5Para tampão de lise celular
Ortovanadatode sódio MP Biomedicals159664Para tampão de lise celular
Pirofosfato de sódio decahidratadoAlfa Aesar33385Para tampão de lise celular
Sódio β-glicerofosfatoAlfa AesarL03425Para tampão de lise celular
SpectraMax M2e Molecular DevicesM2EMicroplate reader
SucroseFisher Scientific57-50-1
Tissue Grinder pilãoKimble Chase885301-0007Para isolamento de mitocôndrias
Tubo de triturador de tecidosKimble Chase885303-0007Para isolamento de mitocôndrias
Solução de ácido tricloroacéticoSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TripsinaCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Scanner de gel a laser para 2D-DIGE
UbiquinonaSigma AldrichC7956
conjugado de anticorpo COX IV vetor que expressa GST de MiniPrep

Referências

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