Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Resumo

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Resumo

A camada externa de grânulo cerebelar (EGL) é o local de maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento, e um excelente modelo para estudar a proliferação e diferenciação neuronal. Além disso, as modificações evolutivas da sua capacidade proliferativa ter sido responsável pela dramática expansão do tamanho do cerebelo nas amniotes, tornando o cerebelo um excelente modelo para estudos evo-devo do cérebro dos vertebrados. As células constituintes da EGL, progenitores de grânulos de cerebelo, também representam um celular significativa de origem para meduloblastoma, o tumor neuronal pediátrica mais prevalente. A seguir à amplificação de trânsito, os precursores de grânulos migrar radialmente para dentro da camada granular interna do cerebelo, onde eles representam a maior população de neurónios no cérebro de mamíferos madura. Em pintainho, o pico de proliferação EGL ocorre no final da segunda semana de gestação. A fim de direccionar a modificação genética para esta camada emo pico de proliferação, temos desenvolvido um método para a manipulação genética ex vivo através de electroporação de fatias do cerebelo a partir do Dia 14 embriões de pintos embrionários. Este método recapitula vários aspectos importantes da in vivo de grânulos desenvolvimento neuronal e será útil para gerar uma compreensão completa da proliferação de células granulares do cerebelo e diferenciação, e, portanto, do desenvolvimento do cerebelo, e a evolução da doença.

Introdução

O cerebelo fica no final anterior da parte posterior do cérebro e é responsável pela integração do processamento sensorial e motor no cérebro maduro, bem como regulando processos cognitivos superiores ^1. Nos mamíferos e aves, que possui uma morfologia elaborada e é fortemente foliados, um produto de grande amplificação trânsito de progenitores durante o desenvolvimento, que produz mais de metade dos neurónios no cérebro adulto. O cerebelo tem sido um tema de estudo para os neurobiólogos durante séculos e na era molecular recebeu igualmente uma atenção significativa. Isto diz respeito não só à sua biologia inerentemente interessante, mas também ao fato de q....

Protocolo

Nota: Todas as experiências foram realizadas com acordo de Kings College London, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office.

1. Dissecção da e14 Cerebelo

1. Incubar ovos de galinha fertilizados marrom a 38 ° C para o dia 14 embrionário.
2. Usando uma tesoura de ovos decapitam embrião de galinha in ovo e remover a cabeça para uma placa de Petri contendo PBS gelado (Figura 1A).
3. Utilizando uma pinça standard, fazer incisões atrás de cada olho todo o caminho através do tecido, remover os olhos e maxilar superior. Adicione uma segunda incisão todo o caminho através da f....

Resultados

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos utilizando eletroporação fatia e cultura de cerebelo de embrionário Dia 14 do pintinho. A dissecção do cerebelo é ilustrada na Figura 1 e a câmara de electroporação configuração é mostrado na Figura 2. Nós mostramos que é possível electroporate e com sucesso fatias de cerebelo de cultura, que retêm a sua estrutura e morfologias celulares in vitro

Discussão

O protocolo aqui relatado descreve um método para a dissecação, electroporating e cultura de fatias de embrionário do dia 14 a partir do cerebelo de pinto. Este protocolo permite a segmentação de eletroporação para pequenas regiões focais do EGL, incluindo isolado direcionamento dos lóbulos do cerebelo individuais. Ele permite a análise genética e de imagem com uma resolução elevada e conveniência, e de baixo custo em comparação com técnicas estabelecidas em roedores ^43-47. Essa análise não é possível in .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Helicóptero de tecidos McIlwain	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cortado em 300 μ m para melhores resultados.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamina	Sigma	G7513
penicilina/estreptomicina	Sigma	P4333
0.4 μ inserto de cultura m	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use pulsos de 3 x 10 V, 10 ms para eletroporação.