Artigo de método

Melhoria Geração de Induced Cardiomyocytes utilizando uma construção policistrónico Expressando proporção ideal de GATA4, MEF2C e Tbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

13 de novembro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos aqui um protocolo para a geração de iCMs usando entrega mediada por retrovírus de Gata4, Tbx5 e Mef2c em uma construção policistrônica. Este protocolo produz uma população relativamente homogênea de células reprogramadas com eficiência e qualidade aprimoradas e é valioso para estudos futuros de reprogramação de iCM.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conversão directa de fibroblastos cardíacos (CFS) em cardiomiócitos induzida (ICMS) tem um grande potencial para a medicina regenerativa, oferecendo estratégias alternativas para o tratamento de doenças cardíacas. Esta conversão foi conseguida através da expressão forçada de factores tais como definidos GATA4 (L), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradicionalmente, iCMS são gerados por um cocktail de vírus que expressam esses factores individuais. No entanto, a eficiência da reprogramação é relativamente baixa e a maior parte do in vitro, G, M, T transduzidas fibroblastos não se tornem totalmente reprogramado, o que torna difícil estudar os mecanismos de reprogramação. Recentemente, têm mostrado que a estequiometria de L, M, T, é crucial para a eficiente reprogramação MIC. Um estequiometria óptima de G, M, T com alto nível relativo de M e baixos níveis de G e T obtidos usando nosso vetor MGT policistrónico (doravante referida como MGT) aumentou significativamente a eficiência de reprogramação e melhoria da qualidade iCM in vitro. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para gerar ICMS com MGT construção de fibroblastos cardíacos. Isolamento de fibroblastos cardíacos, geração de vírus de reprogramação e avaliação do processo de reprogramação também estão incluídos para fornecer uma plataforma para a geração eficiente e reprodutível de ICMS.

Introdução

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As doenças cardiovasculares continuam sendo a principal causa de morte em todo o mundo, sendo responsáveis por 17,3 milhões de mortes por ano1. A perda de cardiomiócitos decorrente de infarto do miocárdio (IM) ou insuficiência cardíaca progressiva é uma das principais causas de morbidade e mortalidade2. Devido à capacidade regenerativa limitada, os corações de mamíferos adultos geralmente sofrem de função de bomba prejudicada e insuficiência cardíaca após lesão3-6. Como tal, a (re)geração eficiente de cardiomiócitos in vivo e in vitro para o tratamento de doenças cardíacas e para a modelagem de doenças é uma questão crítica que precisa ser abordada.

O desenvolvimento recente da reprogramação direta, que reprograma diretamente as células de um fenótipo diferenciado para outro sem fazer a transição para o estado pluripotente, oferece uma abordagem alternativa promissora para a medicina regenerativa. O coração de mamíferos contém abundantes fibroblastos cardíacos (FCs), que representam aproximadamente metade das células do coração e proliferam maciçamente após a lesão7-9. Assim, o vasto conjunto de FCs poderia servir como uma fonte endógena de novos CMs para terapia regenerativa se eles pudessem ser reprogramados diretamente em CMs funcionais. Foi demonstrado que uma combinação de fatores de transcrição, como Gata4 (G), Mef2c (M) e Tbx5 (T), com ou sem microRNAs ou pequenas moléculas, pode reprogramar fibroblastos em iCMs10-26. É importante ressaltar que essa conversão também pode ser induzida in vivo e resulta em melhora da função cardíaca e redução do tamanho da cicatriz em um coração infartado16,27-29. Esses estudos indicam que a reprogramação cardíaca direta pode ser um caminho potencial para curar um coração ferido. No entanto, a baixa eficiência da reprogramação do iCM tornou-se um grande obstáculo para estudos mecanicistas futuros. Além disso, a reprodutibilidade da reprogramação cardíaca é outra questão controversa dessa tecnologia11,30,31.

Muito recentemente, geramos um conjunto completo de construções policistrônicas que codificam G,M,T em todas as ordens de splicing possíveis com sequências 2A idênticas em um único mRNA. Essas construções policistrônicas produziram níveis variados de expressão das proteínas G, M e T, o que levou a uma eficiência de reprogramação significativamente diferente25. A construção mais eficiente, denominada MGT, que apresentou Mef2c relativamente alta e baixa expressão de Gata4 e Tbx5, melhorou significativamente a eficiência de reprogramação e produziu grandes quantidades de iCMs com expressão de marcadores CM, oscilação robusta de cálcio e batimentos espontâneos25. Além disso, ao usar a construção policistrônica MGT, nosso estudo evitou o uso de múltiplos vetores e gerou células com proporção de expressão homogênea de G,M,T, fornecendo assim uma plataforma aprimorada para a pesquisa de reprogramação cardíaca. Para aumentar a reprodutibilidade experimental, aqui descrevemos em detalhes como isolar fibroblastos, produzir MGT portador de retrovírus, gerar iCMs e avaliar a eficiência da reprogramação.

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Protocolo

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O protocolo descrito aqui utiliza camundongos recém-nascidos. Cuidados com os animais e as experiências sejam realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pela Divisão de Laboratório de Medicina Animal (DLAM) na Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill.

1. Preparação de amortecedores e Mídia

  1. Prepare de fibroblastos (FB) forma: Suplemento 500 ml de meio IMDM com 100 ml Soro Fetal Bovino (FBS) e 6 ml de penicilina / estreptomicina.
  2. Prepare médio iCM: Suplemento 400 ml meio DMEM com 100 ml de mídia M199 e 50 ml FBS.
  3. Prepare meio B27: Suplemento 490 ml de mídia RPMI1640 com 10 ml de meio B27.
  4. Prepare Plat-E meio de cultura: 500 mL de Suplemento meio DMEM com 50 ml de FBS, 5 ml penicilina / estreptomicina e 5 ml de aminoácidos não-essenciais.
  5. Prepare Plat-E meio de transfecção: Suplemento 500 ml meio DMEM com FBS a 50 ml e 5 ml de aminoácidos não-essenciais.
  6. Prepare revestidos com gelatina placa de 24 poços: Adicionar 0,5 ml de solução de gelatina a 0,1% para um poço de placa de 24 poços, incubar a 37 ° C durante pelo menos 10 min e aspirado imediatamente antes da utilização.
  7. Preparar tampão de marcação FACS: Suplemento 500 ml de DPBS com FBS a 10 ml e 2 ml de EDTA (0,5 M) até atingir uma concentração final de 2 mM. Filtrar através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
  8. Preparar tampão de triagem MACS: Suplemento 500 ml de DPBS com 2,5 g de BSA e 2 ml de EDTA (0,5 M) até atingir uma concentração final de 2 mM. Filtrar através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
  9. Preparar tampão HBS 2x para a transfecção: Suplemento 500 ml de tampão HEPES (50 mM) com NaCl 280 mM (8,1816 g), 10 mM de KCl (0,37275 g), 1,5 mM de Na 2 HPO 4 (0,10647 g), Glicose 12 mM (1,08096 g ). Adicionar cerca de 650 ul de NaOH 10 N para ajustar o pH a 7,05-7,12. Filtrar através de um filtro de 0,22? M de poro e armazenar a 4 ° C.
  10. Prepare 2,5 M CaCl 2 solução para a transfecção: Adicione 18,376 g CaCl 2 a 50 ml de ddH 2 O. Filtrar através de um filtro de 0,22? M de poro e armazenar a 4 ° C.
  11. Prepare TPI (imunocitoquímica) tampão de fixação: Adicionar 5 ml de paraformaldeído (PFA, 32%) a 35 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 4%.
  12. Preparar tampão de permeabilização ICC: Adicionar 0,1 mL de Triton a 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 0,1%.
  13. Preparar um tampão de bloqueio ICC: Adicionar 5 g de albumina de soro bovino (BSA) a 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 5%.
  14. Preparar tampão de coloração ICC: Adicionar 1 g de BSA para 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 1%.

2. Geração de Neonatais mouse fibroblastos cardíacos

  1. Gerar fibroblastos cardíacos de método de cultura de explante
    1. Limpe neonatal αMHC-GFP camundongo transgênico (P1 a P2) com etanol 75%. Cortar a cabeça com uma tesoura esterilizada. Em seguida, faça uma incisão horizontal debaixo de uma axila para o outro. Use um estérilfórceps sem corte e dobrados para dissecar o coração e colocá-lo em um poço da placa de 24 poços contendo tampão PBS gelado.
      1. Alternativamente, espremer o coração após a incisão horizontal.
    2. Verifique expressão da GFP no coração por microscópio de fluorescência. Uma vez que a expressão da GFP é accionado por αMHC promotor que é um promotor específico cardíaco, o coração de ratinho transgénico deve ser em verde 15, enquanto o coração é negativa fraca em qualquer fluorescência.
    3. Tome 3-4 GFP corações positivos em 60 mm centro bem prato de cultura e pique-os em pedaços pequenos menos de 1 mm 3 em tamanho por tesouras e pinças esterilizadas.
    4. Coloque 3-4 corações picada em uma placa de 10 cm com 2 ml de mídia FB. Deixe os tecidos se estabelecer durante 3 horas.
    5. Lentamente, adicionar 8 ml de mídia FB pré-aquecido para os pratos que contenham tecidos cardíacos. Não perturbe os tecidos por três dias.
    6. Substitua o material a cada três dias.
    7. No dia 7, ASPIRcomeu o meio de cultura e lavar as células com DPBS. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina a cada placa e digerir a 37 ° C durante 5 min.
    8. Adicionar 5 ml de mídia FB para saciar a tripsina. Suavemente separar as células com um raspador de células. Pipetar os meios de comunicação cima e para baixo para dissociar ainda mais mecanicamente o tecido.
    9. Recolher as células e filtrar através de filtros de 40 uM de células para evitar a contaminação de fragmentos de tecido do coração, e, em seguida, peletizar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min.
    10. Lave as células uma vez com MACS tampão e células estão prontas para a classificação.
  2. Gerar fibroblastos cardíacos de método de digestão enzimática
    1. Colheita GFP corações positivos como 2.1.1. Transferir todos os corações em uma placa de 10 cm com 10 ml DPBS geladas.
    2. Esprema ventrículos com uma pinça estéril para remover o sangue e lavar uma vez com DPBS geladas.
    3. Apare os corações para ser livre de outros tecidos e gordura.
    4. Corte cada coração em cerca de 4 peças que ainda são frouxamente ligados.
    5. Se menos de 20 corações, transferir os corações em um tubo de 15 ml com 8 ml quente 0,05% de tripsina-EDTA, e incuba-se a 37 ° C durante 15 min.
      1. Se houver 20-30 corações, transferir os corações em um tubo de 50 ml com 10 ml quente 0,05% de tripsina-EDTA, e incuba-se a 37 ° C durante 15 min.
    6. Descartar a tripsina e adicionam-se 5 ml (para menos de 20 corações) ou (10 ml) durante 20-30 corações quente colagenase tipo II (0,5 mg / ml) em HBSS.
    7. Vortex o tubo em vortex durante 1 min a um nível de velocidade de cerca de 4 a 6 (se o líquido não se levantar para a tampa, em seguida, a velocidade é fina).
    8. Incubar o tubo 37 ° C em banho de água durante 3-5 min.
    9. Vortex o tubo durante 1 min.
    10. Sedimento durante 1 min por gravidade até que os pedaços de tecido sossegar, recolher o líquido em um novo tubo contendo 5 ml de meio FB frio.
    11. Repita os passos 3-5 2.2.6-2.2.10 vezes.
    12. Combine todas as coleções, filtrando através de 40 um filtro de célulaspara fazer a suspensão de célula única.
    13. Centrifuga-se a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    14. Ressuspender as células em 10 ml de tampão MACS, e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
    15. Opcional: Se há um grande número de células do sangue, Ressuspender as células com 1 ml de tampão de lise de RBC (150 mM de NH4Cl, 10 KHCO 3 mM, e EDTA 0,1 mM), manter em gelo durante 1 min, em seguida, dilui-se com 10 ml MACS tampão e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Lave mais uma vez com tampão de MACS.
  3. Isolamento de fibroblastos THY1.2 + por MACS (triagem magnética-activada de células)
    1. Determinar o número de células viáveis ​​através de coloração azul de tripano.
      1. Tome 10 células ul a partir de suspensão de células 10 ml na etapa 2.2.14. Misturá-lo com solução de azul de 10 mL de 0,4% tripano.
      2. Adicione a mistura para um hemocitômetro. Deixe-a repousar durante 3-5 minutos e depois examinar imediatamente sob um microscópio. As células mortas são manchadas em células azuis e viáveis ​​são imaculado.
      3. Conte todas as células viáveis ​​em quatro quadrados 1 milímetro de canto do hemocitômetro. Determinar o número de células viáveis: a contagem média por metro quadrado x 2 (factor de diluição) x 10 4 x 10 (volume total de suspensão de células).
    2. Por menos de 1 x 10 7 células, as células ressuspender com 10 ul microbeads THY1.2 em 90 ul refrigerados tampão MACS. Adicionar mais grânulos proporcionalmente se houver mais do que 1 x 10 7 células. Misturar bem e incubar num frigorífico (2-8 ° C) durante 30 min.
    3. Adicionar 10 ml de tampão e MACS amostras de rotação a 200 g durante 5 min; lavar uma vez com tampão de MACS 10 ml e centrifugar novamente.
    4. Levar o volume a 2 ml em tampão MACS.
    5. Configurar uma Separator MACS na capa. Inserir uma coluna LS para o separador. Aplicar 3 ml MACS tampão para a coluna para equilibrar isso.
    6. Passar a suspensão de células através da coluna LS equilibrada.
    7. Lavar 3 vezes com 2 ml de tampão de MACS cada vez.
    8. Tome a coluna LS fora tSeparador ele e elui-se 3 vezes com 2 ml de tampão MACS para um novo tubo de 50 ml.
    9. Gire a 200 xg durante 5 min.
    10. Ressuspender as células em 10 ml de mídia FB, contar as células e sementes em placas a densidade adequada. Para fibroblastos gerados a partir de método de cultura de explante, a densidade de sementeira de células poderia ser de cerca de 2-3 x 10 4 células / poço de placa de 24 poços. Para fibroblastos gerados a partir de método de digestão enzimática, a densidade de células poderá ser cerca de 4-5 x 10 4 células / poço de placa de 24 poços.

3. Geração de Retrovirus para iCM Reprogramação

Nota: Execute as seguintes etapas em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica em condições estéreis. O descarte adequado de células transfectadas, pontas para pipetas e tubos é recomendado para evitar o risco de riscos ambientais e de saúde.

  1. Manter células Plat-E em meio Plat-E suplementado com 1 ug / ml de puromicina e 10 ug / mL blasticidin a 37 ° C com 5% de CO 2.
  2. No dia 2, substituir o meio por Plat-E meio de cultura sem puromicina e blasticidina.
  3. No dia 0, dividir células Plat-E em placas de 10 cm no dia antes da transfecção, aproximadamente 4-5 x 10 6 culas por placa. As células devem ser ~ 80-90% confluentes no dia da transfecção.
  4. No dia 1, os meios para mudança de cultura meio de transfecção em células dentro de 1 h antes da transfecção. Procedimento de transfecção é o seguinte:
    1. A transfecção usando kits comerciais
      1. Misturar 20 ul de reagente de transfecção (por exemplo, de Lipofectamine) e 500 ul de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM). Adiciona-se 10 ug do plasmídeo retroviral para mais 500 ul de meio de soro reduzido. Incubar cada mistura à temperatura ambiente (TA) durante 5 min.
      2. Adiciona-se lentamente a mistura de plasmídeo a mistura de transfecção. Esta etapa pode demorar 15-30 segundos. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente (solução pode aspecto turvo).
      3. Adicionar gota mistura sábia para as células.
      4. Incubar durante a noite numa incubadora a 37 ° C.
    2. A transfecção com fosfato de cálcio.
      1. Misturar 40 ul de 2,5 M de CaCl2 e 440 uL ddH2O, em seguida, adiciona-se 20 ug do plasmídeo retroviral (ajustar a quantidade de ddH2O modo que o volume total seja de 500 uL).
      2. Adicionar 500 mL 2x HBS a um tubo de 15 ml.
      3. Vortex da HBS e, entretanto, adicione a mistura de cálcio-ADN para a HBS gota a gota. Esta etapa demora cerca de 30 segundos para cada amostra. Assim maximamente fazer 3-4 amostras simultaneamente.
      4. Incubar à temperatura ambiente durante 3 minutos de incubação por mais tempo leva a maior precipitado e menos células vai ocupar o precipitado.
      5. Adicione a mistura gota a gota às células e observar ao microscópio 20X. Precipitados finos (um monte de pequenos são bons, mas alguns grandes não são bons) deve ser visto.
      6. Incubar durante a noite a 37 ° C incubadora.
  5. No dia 2, mudar meios sobre as células, com 8 ml de meio de cultura previamente aquecido. Incubar durante 24 h.
  6. No dia 3 e no dia 4, recolher o sobrenadante da cultura a partir das placas, utilizando uma seringa descartável de 10 ml estéril, filtrando-a através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 um de tamanho de poro, e transferir para um tubo de 50 ml. Adicionar 2 ml de solução de precipitação de retrovírus para cada sobrenadante contendo vírus de 8 ml. Suavemente misturá-lo e incubar durante a noite a 4 ° C.
  7. No dia 5, a mistura viral girar a 1.500 x g a 4 ° C durante 30 min. As partículas virais devem aparecer no sedimento branco no fundo do tubo.
  8. Desprezar o sobrenadante. Girar solução residual por centrifugação a 1500 × g durante 5 min. Remover todos os vestígios de líquido por aspiração, tomando muito cuidado para não perturbar as partículas retrovirais precipitados em pelota.
  9. Ressuspender retrovirais peletes com tampão de DPBS 100 uL para cada 8 ml de sobrenadante viral. Alíquotao vírus em gelo. Utilizar imediatamente ou armazenar a -80 ° C.

4. A reprogramação de fibroblastos cardíacos

  1. Adicione 4 ml de solução polibrene 10 mg / ml para o meio iCM 10 ml, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. A concentração final de polibreno é de 4 ug / ml.
  2. Adicionar 500 ul de meios iCM contendo polibreno a cada poço da placa de 24 poços semeada com fibroblastos.
  3. Adicionar 10 ul a cada poço retrovírus contendo os 2-3 x 10 4 células de cultura de explante ou 4-5 x 10 células de 4 método de digestão enzimática. A quantidade de vírus deve ser aumentada proporcionalmente com o aumento do número de células em placas de cultura ou diferentes pratos. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 24-48 h, para permitir que a infecção virai. A linha do tempo para a reprogramação cardíaca é mostrado na Figura 1.
  4. Depois de transdução viral, substitua vírus contendo mídia com 500 mL de mídia regulares iCM.
  5. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Para a selecção positiva de células transduzidas virais, adicionar ICM meios suplementados com puromicina a 2 ug / ml para as células alvo. Mantê-lo por três dias. Depois disso, manter a puromicina na forma iCM na concentração de 1 ug / ml.
  6. Três dias após a infecção virai, tomar a placa para fora da incubadora e colocá-lo sob um microscópio de fluorescência invertido (20X) para observar a expressão da GFP.
    Nota: Dez dias após a infecção virai, as células podem ser colhidas para análise FACS e análise ICC para determinar a eficiência de reprogramação (no passo 5 e 6).
  7. Quatorze dias após a infecção viral, substituir a mídia iCM com a mídia B27. Mudança de mídia a cada três dias. Batimento espontâneo loci célula pode aparecer a partir de três células (método de digestão enzimática) ou quatro (células de cultura método explante) semanas após a transdução virai.

5. Immunocytochemical Análise de Eficiência Reprogramação

  1. Células de enxágüecom PBS gelado três vezes; remover o excesso de solução.
  2. Adicionar 0,5 ml de tampão de fixação ICC para cada poço de placas de 24 poços. Fixar as células à temperatura ambiente durante 15-20 min.
  3. Enxaguar as células três vezes com PBS.
  4. Adicionar 0,5 ml de tampão de permeabilização ICC para cada poço das placas de poços 24. Permeabilizar as células à TA durante 15 min.
  5. Enxaguar as células três vezes com PBS.
  6. Adicionar 0,5 ml de ICC tampão de bloqueio a cada poço da placa de 24 poços, incubar à TA durante 1 h.
  7. Anticorpos primários diluídos com tampão de coloração TPI. Adicionar 200 ul de soluções de anticorpo a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C. Os factores de diluição de anticorpo estão listados em materiais.
  8. No dia seguinte, lavar as células com PBS três vezes.
  9. Adicionar 200 ul de soluções de anticorpo secundário para as células e incuba-se durante 1 h à TA em escuro.
  10. Lavar as células com PBS três vezes.
  11. Adicionar 150 ul de solução contendo DAPI para cada cavidade de montagem. Permitir que a mancha núcleos durante 1 min. Entãocobrir cada poço com rodada tampa de vidro deslizante e pressione suavemente o deslizamento contra a superfície inferior com uma pinça para remover bolhas de ar.
  12. Aspirar o excesso de solução e as amostras estão prontas para imagiologia. As imagens representativas que mostram as células que expressam o marcador reprogramadas cardíaca e TnT αActinin em D14 são mostrados na Figura 2B.

6. FACS análise da eficiência Reprogramação

  1. Lave as células uma vez com DPBS. Adicionar 0,3 ml de tripsina (0,05%) a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 5 min.
  2. Bata suavemente na placa para facilitar o levantamento das células. Verifique o desprendimento de células ao microscópio. Adicionar 1 mL de tampão de FACS a cada poço quando a maioria das células são dissociadas. Pipeta-se para baixo e para dissociar mais mecanicamente as células.
  3. Transferir as células na placa de 24 poços para uma placa de 96 poços poço profundo poço a poço. Rotação a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para recolher as células.
  4. Lavar as células uma vez comTampão FACS.
  5. Adicionar soluções de fixação 100 / ul permeabilização para ressuspender as células durante 20 min a 4 ° C.
  6. Lave as células duas vezes com solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
  7. Prepare solução de anticorpo primário contra GFP e cTnT em tampão de lavagem 1x. Ressuspender cuidadosamente cada uma das amostras com uma solução de anticorpo de 50 ul e incubar a 4 ° C durante 30 min.
  8. Lave as células uma vez em solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
  9. Adicionar 50 ul de solução de anticorpo secundário contendo Alexa Fluor 488 conjugado de IgG de burro anti-coelho Alexa Fluor 647 e burro conjugado anti-IgG de ratinho a cada amostra. Incubar a 4 ° C durante 30 min no escuro.
  10. Lave as células uma vez em solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
  11. Ressuspender as células em tampão 400 ul de fixação (DPBS com 1% de PFA). Transferência de células para dentro do tubo FACS com tampa de filtro de células. As amostras estão prontos para a detecção de FACS. A análise FACS representante de reprogramação eficy usando pMxs-puromicina-construção MGT com ou sem puromicina selecção é mostrado na Figura 2A.

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Resultados

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Os passos de reprogramação são resumidos por esquemática na Figura 1. Após a transdução MGT, a expressão da GFP em células reprogramação pode ser detectada tão cedo como o dia 3. A puromicina selecção de células transduzidas é iniciado a partir do dia 3 e é mantida durante as duas primeiras semanas, se pMX-puro constructo -MGT é usado. Por volta do dia 10 até ao dia 14, a expressão dos marcadores cardíacos como TnT e αActinin poderia ser detectado por ambos TPI (Figura 2B,

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Discussão

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Para a geração iCM bem sucedido ao usar este protocolo, existem vários fatores importantes que têm um impacto sobre a eficiência global. Particularmente as condições de fibroblastos de partida e da qualidade de codificação retrovírus MGT pode afetar consideravelmente a eficiência de reprogramação.

É importante para gerar fibroblastos tão fresco e saudável possível. Para o método de cultura de explante, os fibroblastos podem ser usadas antes de sete dias depois de os explantes foram plaqueada...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a assistência técnica especializada do Núcleo de Citometria de Fluxo da UNC e do Núcleo de Microscopia da UNC. Agradecemos aos membros do laboratório Qian e do laboratório Liu pelas discussões úteis e revisões críticas do manuscrito. Este estudo foi apoiado pelo NIH/NHLBI R00 HL109079 concessão ao Dr. Liu e American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 e Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 ao Dr. Qian.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
troponina anti-cardíaca TThermo ScientificMS-295-PO1:200 para FACS e 1:400 para ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 para FACS e ICC
anti-aActininSigma-AldrichA78111:500 para FACS e ICC
anti-Conexina43Sigma-AldrichC62191:500 para  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 para ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 para ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 para ICC
Alexa Fluor 488- burro conjugado anti-coelho IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 para FACS e ICC
Alexa Fluor 647: burro conjugado anti-rato IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 para FACS e ICC
Kit Cytofix/Cytoperm para coloração intracelularBD Biosciences554722
Rhod-3 Kit de imagem de cálcioLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microesferasMiltenyi Biotec130-049-101
Solução Vectashield com DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Tripsina-EDTA (0,05%)Corning25-052
PRMI1640 médioLife Technologies11875-093
B27 suplementoLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Soro Reduzido MédioLife Technologies31985-070
M199 MédioLife Technologies10-060
DMEM, glicose altaLife Technologies10-013
Penicilina-estreptomicinaCorning30-002
Aminoácidos não essenciaisLife Technologies11130-050
Lipofectamina 2000Life Technologies11668500
blasticidinaLife TechnologiesA11139-03
puromicinaLife TechnologiesA11138-03
Colagenase IIWorthingtonLS004176
polibrenoMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< sub>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlicoseSigma-AldrichG6152
Albumina de soro bovinoFisher9048-46-8
paraformaldeídoEMS15714
Solução de precipitação de retrovírusALSTEMVC-200
0,4% Solução de azul de tripanoSigma-AldrichT8154
gelatinaSigma-AldrichG1393
PBS de Dulbecco sem CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS colunaMiltenyi Biotec130-042-401
0,45 μ M Filtro de Acetato de CelulosePlacas de
de
central de 60 mm 172958Thermo Scientific
   Corning3260
96 Bem Transparente V-Bottom 2 ml Polipropileno Placa de Poço ProfundoDenville ScientificP9639
Tubos de poliestireno de fundo redondo com tampa de filtro de células BD Biosciences352235
CentrífugaEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Sistema de Imagem de Célula AutomáticaLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Separador MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Lamínula de cobertura de vidro redondaElectron Microscopy Sciences72195-15
24 poços Corning 3524 de 10 cm da Thermo Scientific 190-2545 Placas cultura de tecidos Prato de cultura de poço da

Referências

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