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Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)

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DOI:

10.3791/53432

⸱

19 de dezembro de 2015

 ,  ,  , 
1Virologie et Immunologie Moléculaires, INRA

Neste artigo

Resumo

Um método cromatográfico de duas etapas é descrito para a purificação da proteína Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão em Escherichia coli, bem como um protocolo para fibrilar Shadoo purificado em estruturas amilóides.

Resumo

O sistema de expressão de Escherichia coli é uma ferramenta poderosa para a produção de proteínas eucarióticas recombinantes. Nós usá-lo para produzir Shadoo, uma proteína pertencente à família de prião. Um método de cromatografia para a purificação de (His) 6 tagged Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão é descrito. Os corpos de inclusão solubilizados em ureia 8 M e ligado a uma coluna de Ni 2+ -charged para realizar cromatografia de afinidade de iões. As proteínas ligadas são eluidas com um gradiente de imidazole. As fracções contendo proteína Shadoo são submetidas a cromatografia de exclusão de tamanho para obter uma proteína altamente purificada. No passo final é purificado Shadoo dessalinizada para remover os sais, ureia e imidazole. Shadoo proteína recombinante é um reagente importante para estudos bioquímicos e biofísicos de distúrbios conformação da proteína que ocorrem nas doenças de priões. Muitos relatórios demonstraram que as doenças neurodegenerativas priões são originários da deposição de facadale, ordenou fibrilas amilóides. Protocolos de exemplo que descrevem como fibrilar Shadoo em fibrilas amilóides no ácido e neutro / pHs básicos são apresentados. Os métodos de como produzir e fibrilar Shadoo pode facilitar a investigação em laboratórios que trabalham com doenças de príon, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteína de uma maneira rápida e de baixo custo.

Introdução

Doenças neurodegenerativas causadas por príons, que incluem a encefalopatia espongiforme bovina em bovinos, scrapie em ovinos ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos, são fatal e incurável. Prion doenças são caracterizadas por mudanças conformacionais da proteína príon celular composta principalmente de hélices, no-β-sheet cruz enriquecido amilóide conformer 1,2. Cross-beta-estruturas contêm densamente embalado e beta-folhas-cristalinos como altamente ordenadas estabilizado com ligações de hidrogênio 3,4. Amyloids Príon se auto-replicar devido aos beta-fios na borda crescente que fornecem um modelo para recrutar e converter uma unidade de proteína monomérica.

De acordo com a hipótese do "única proteína", o conformador de proteína amilóide prião é o agente infeccioso único. No entanto, algumas outras biomoléculas têm sido propostos como sendo essencial para distúrbios do prião. Por exemplo, as membranas celulares são pensados ​​para ser um lugar onde conversiocorre e em alguns lípidos carregados negativamente têm sido mostrados para melhorar o processo de conversão de 5,6. Além disso, algumas proteínas também podem estar envolvidos em patologias prião. Especificamente, existem dois outros membros da família de proteínas prião: Duplo e Shadoo 7,8. Doppel tem uma estrutura relativamente rígida estabilizado com pontes de di-sulfureto e não autopolimerização, e agregada para fibrilas amilóides 9. Em contraste, semelhante à da proteína do prião, Shadoo pode adoptar uma estrutura β folhas enriquecido e auto-associar-se em estruturas de fibrilas amilóides. Foi demonstrado que pode Shadoo fibrilar em condições nativas ou sobre as membranas carregadas negativamente 10,11 ligação. Conversão de Shadoo em fibras de amilóide-like pode ser associada com patologias. Com efeito, os mecanismos pelos quais as estruturas amilóides como causam a doença são mal compreendidos.

Shadoo tem um domínio hidrofóbico (HD) e uma série de conjunto Arg / Gly repete t semelhanteO a parte N-terminal da proteína do prião (Figura 1A). À medida que a parte N-terminal da proteína do prião, Shadoo é altamente carregada positivamente e parece ser uma proteína nativa desestruturado 11,12. Shadoo parece ser funcionalmente relacionados com distúrbios do prião, uma vez que se pode ligar directamente a proteína prião. Além disso, a sua expressão é regulada negativamente durante prião patologia 13,14. No entanto, o papel de Shadoo na doença do prião ainda não foi estabelecido.

Foi desenvolvido um plasmídeo que transporta a sequência de codificação do gene de rato Shadoo. O plasmídeo foi usado para transformar E. coli para a produção de N-terminal His Shadoo 6 fusão. Este sistema de expressão é bem estabelecida em nosso laboratório e é comumente usado em nossos projetos em andamento 6,15,16. Um problema importante para a expressão de Shadoo é a escolha da E. estirpe de E. coli. Enquanto BL21 competente estirpe bacteriana é geralmente utilizado para a expressão de pró recombinanteteínas Shadoo foi expressa e purificada a partir da estirpe única bacterianas transformadas com sucesso SoluBL21. SoluBL21 E. competente coli é um mutante melhorada da estirpe BL21 de acolhimento desenvolvido para a produção de proteínas cuja expressão na estirpe BL21-mãe deu nenhum produto detectável solúvel. Expressão de alto nível de Shadoo em SoluBL21 E. coli conduz a acumulação da proteína em corpos de inclusão. Como uma característica geral, quando uma proteína não nativa é altamente expressa em E. coli, esta proteína tende a acumular-se em corpos de inclusão insolúveis. Shadoo agrega provavelmente através de interacções não covalentes ou iónicas hidrofóbicas (ou uma combinação de ambos) para estruturas dinâmicas altamente enriquecidos formadas pela proteína dobrada para vários graus. Em consequência, a purificação compreende pelo menos dois passos: (i) uma separação selectiva da proteína a partir de outras biomoléculas em um meio de desnaturação, e (ii) uma renaturação da proteína purificada utilizando na dobragem in vitrotécnicas.

A separação selectiva de Shadoo foi conseguida numa solução tampão contendo ureia 8M (ou, alternativamente, 6M guanidina-HCl). A remoção da ureia e a renaturação da proteína pode ser realizada por aplicação de vários protocolos de: (i) renaturação em uma solução de pH ácido para se obter uma proteína Shadoo monomérica desestruturado, ou (ii) renaturação em uma solução de pH ≥ 7 para se obter Shadoo polimerizado em fibras de amilóide estáveis ​​com motivos característicos cross-β-folha.

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Protocolo

1. Produção de plasmídeo e Shadoo Expressão

Nota: O gene que codifica a proteína de murino Shadoo (Shadoo 25-122), foi subclonado no vector de expressão pET-28 11. Este clone foi usado para transformar E. SoluBL21 coli estirpe bacteriana, para expressar a proteína Shadoo com uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), como explicado anteriormente 11. O plasmídeo pode ser solicitado dos autores. O peso molecular calculado a partir da Shadoo sua sequência de aminoácidos é 12,243.2 Da.

Nota: Executar todas as manipulações com bactérias sob uma capela de fluxo laminal ou perto de Bunsen chama.

  1. Transformar bactérias competentes SoluBL21 com o pET-28-Sua 6 -Shadoo plasmídeo, usando um protocolo de choque térmico padrão. Para esta mistura de 1 a 5 ul do plasmídeo (tipicamente de 10 a 100 pgng) em 50 ul de as bactérias num tubo. Realizar a choque térmico a 42 ° C durante 45 seg.
  2. Cultura de bactérias transformadas a 37 ° C até 600 um de 0,5-0,7 em meio de Luria Bertani suplementado com 40 mg / ml de canamicina (Figura 1B).
  3. Shadoo induzir expressão O / N através da adição de 240 ug / ml de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido, ITPG, para a cultura. As bactérias de cultura sob agitação a 150 rpm a 37 ° C. Nota: Normalmente, cultura bacteriana alcança A 600, de 3 de O / N.
    Nota: Transformado bactérias podem ser armazenadas a -80 ° C para a produção de proteína futuro. Para isso, adicionam-se 10% -50% (v / v) de glicerol estéril em alíquotas de culturas bacterianas e congelá-las a -80 ° C.

figure-protocol-1
Figura 1. Esquema de Shadoo construção de expressão, transformação de bactérias e de indução de expressão Shadoo (tal como descrito no passo 1). (A) A construção de expressão para Shadoo codifica uma marca de hexa-histidina fundida com o N-terminal da proteína, Nt. O esquema mostra que a proteína contém repetições Shadoo básicos arginina / glicina (cilindro verde), um domínio hidrófobo (HD), e um único local de N-glicosilação (CHO), seguido por um terminal-C (TC). (B) 28 pET-6-His -Shadoo plasmídeo é transformado em bactérias SoluBL21 por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C. Bactérias transformadas são plaqueadas em placas de agar selectivo que continha 40 ug / ml de canamicina. Uma única colónia da placa é utilizada para inocular um cultura num frasco agitador de 1.000-3.000 ml. A expressão da proteína recombinante é induzida com IPTG 1 mM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Purificação de Proteínas Shadoo por Cromatografia Líquida de Baixa Pressão (LPLC)

  1. A lise celular e Emcorpos conclusão preparação
    1. Recolha a suspensão bacteriana e transferi-la para dentro de tubos de centrifugação (Figura 2).
    2. Rotação a 2.500 xg, durante 20 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante por decantação e pelotas ressuspender em 15 ml de tampão (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8, com anti-proteases) para cada sedimento derivado de 500 ml de cultura de células.
      Nota: Os sedimentos ressuspensos podem ser congeladas e armazenadas a -20 ° C durante vários dias. Congelamento facilita a lise de células bacterianas.
    3. Verifique a sobre-expressão de proteína recombinante utilizando bactérias peletes bruto por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
      1. Para isso, de centrífuga de 1 ml de cultura bacteriana para sedimentar as células. Adicionar 100 ul de solução de desnaturação de Laemmli (277,8 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% de SDS, 44,4% w / v de glicerol, 0,02% azul de bromofenol) para sedimentar e aquece-se a 100 ° C durante 5 min.
      2. Carga de 10 ul da amostra num gel de acrilamida a 12%, executar SDS-PAGE e visuAlize proteínas separado por coloração com Coomassie.
    4. Adicionar Triton X-100 a 0,5% de concentração final para o sedimento completamente ressuspenso de 2.1.2).
    5. Incubar a suspensão em banho de água a 37 ° C durante 30 min.
    6. Sonicar a suspensão durante 5 minutos a 6-12 microns amplitude pico-a-pico em água gelada para lisar células bacterianas.
    7. Transferência suspensão sonicada em 50 ml de tubos de centrifugação limpas.
    8. Tubos de centrifugação a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
    9. Remover o sobrenadante por decantação e adicionam-se 5 ml de tampão de ligação (tampão de 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M, 5 mM de imidazole) por tubo.
    10. Colocar os tubos na roda girando O / N para proteínas a partir de corpos de inclusão voltar a suspender completamente.

    figure-protocol-2
    Figura 2. Esquema de purificação de inclusãocorpos (tal como descrito no passo 2.1). transformadas que expressam Shadoo bactérias são colhidas por centrifugação e ressuspensas no tampão de lise. A suspensão é incubada a 37 ° C durante 30 min e, em seguida sonicada para romper mecanicamente células bacterianas. A sonicação é feito em gelo para evitar o aquecimento da amostra. Quebrados células são colhidas por centrifugação e ressuspensas num tampão contendo 8 M ureia para solubilizar proteínas a partir de corpos de inclusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  2. Cromatografia em Ni 2+ -affinity
    Nota: A cromatograf ia é realizada no FPLC usando um Sistema de Ni 2+ -charged, 5 ml de Sepharose quelante (Figura 3A). Todas as soluções são carregados na coluna com um caudal de 1 mL / min.
    1. Injectar 10 ml de solução 4 M Niso água de 0,2 para a coluna de Sepharose, a fim de carregá-lo-ions com Ni 2+.
    2. Equilibrar a coluna carregada com Ni 2+ -ions por injecção de 30-50 ml de tampão de ligação contendo uma baixa concentração de imidazolo (tampão de 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M, 5 mM de imidazole).
    3. Coloque as proteínas solubilizadas-ureia com um dispositivo de injecção de 50 ml.
    4. Recuperar a fracção de fluxo mediante a lavagem da coluna com 10 ml de tampão de baixa concentração de imidazole de ligação (tampão Tris-HCl a 20, pH 7,4, 0,5 M de NaCl, 8 M de ureia, mM de imidazole 5), a fim de remover um máximo de proteínas não ligadas a partir da coluna.
    5. Lava-se a coluna com 50-100 ml do tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, ureia 8 M, imidazol 80 mM) para eluir as proteínas não especificamente ligadas à coluna.
    6. Aplicar um gradiente linear de 15 min de imidazolo 80-800 mM no tampão contendo 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M. Recolher fracções de 1 ml durante a aplicação do gradiente. Nota: proteínas-His-tag são eluídos sagacidadegradiente ha de tampão contendo imidazole (utilizado como competidor).
    7. Tomar uma alíquota de 8 mL de cada fração e adicione 4 mL solução de desnaturação 4x Laemmli (ver 2.1.3.1). Soluções de aquecer a 100 ° C durante 5 min.
    8. Carga de 10 ul de marcador de tamanho de proteína e 10 ul de cada amostra para o gel de acrilamida a 12%, executar SDS-PAGE e visualizar as proteínas separadas por coloração com Coomassie. Nota: O peso molecular calculado de Shadoo formar a sua sequência de aminoácidos é 12,243.2 Da.
    9. Piscina todas as fracções contendo Shadoo.

    figure-protocol-3
    Figura 3. Procedimento de purificação (tal como descrito nos passos 2,2-2,4). (A) Ni2 + -ions pode ser coordenado por resíduos de histidina, que permite a purificação selectiva de proteínas marcadas com poli-histidina. Imidazole é utilizado para eluir a proteína, atravéssua capacidade para coordenar com o Ni 2+ -ion e deslocar a proteína ligada. (B) As proteínas de diferentes raio hidrodinâmico que foram retidas na Ni 2+ -column são separados numa coluna de exclusão de tamanho. As proteínas são eluídas a partir da maior para os mais pequenos. (C) antes de usar, as fracções contendo Shadoo são reunidas e dessalinizadas para remover a ureia, imidazol e os seus sais. Os ensaios de controlo de qualidade incluem SDS-PAGE / coloração com Coomassie, Western blotting. Purificada Shadoo pode ser liofilizado. Liofilizado Shadoo é estável durante meses, quando armazenadas a -20 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  3. A cromatografia de exclusão de tamanho
    Nota: Um segundo passo de purificação consiste na cromatografia de exclusão de tamanho que separa proteína Shadoo das outras proteínas co-eluídas no primeiro passo de purificação(Figura 3B).
    1. Equilibrar coluna Superdex de 120 ml de volume total do leito através da injecção de 250 ml de tampão de 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Ureia 8 M a uma taxa de fluxo de 1,5 ml / min.
    2. Carregar fracções reunidas contendo a partir de 2.2.9 Shadoo na coluna equilibrada. Recolher fracções de 1 ml após o volume vazio da coluna de 40 ml sobre o fluxo constante do tampão anterior.
    3. Tomar uma aliquota de 10 ul de cada fracção e realização de uma análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie, tal como descrito acima para saber quais as fracções contêm Shadoo.
    4. Piscina fracções contendo Shadoo.
  4. Dessalinização
    Nota: A dessalinização procedimento remove os sais, ureia e imidazole para se obter a proteína recombinante Shadoo num tampão adequado para estudos bioquímicos e biofísicos (Figura 3C). O mesmo resultado pode ser obtido por diálise contra o tampão de amostras.
    1. Equilibrar uma coluna de dessalinização de 53 ml com 150 mlde tampão de acetato de amónio 10 mM, pH 5, a uma taxa de fluxo de 5 ml / min.
    2. Carga reunidas fracções Shadoo na coluna. Após a injecção do tampão acetato de amónio recolher manualmente fracções que mostram um aumento do sinal a 280 nm na saída do detector de UV.
    3. Liofilizar a Shadoo dessalinizada e armazená-lo a -20 ° C.
    4. Dissolver Shadoo liofilizado num tampão adequado, o tampão de acetato de sódio tal como 10 mM, pH 5, antes da utilização.
      Nota: A etiqueta de poli-histidina pode ser removida com enteroquinase.

3. In Vitro Montagem dos Shadoo em amilóide fibrilas no pH fisiológico

Nota: Os agregados proteicos Shadoo e espontaneamente forma fibrilhas a pH ≥ 7 11.

figure-protocol-4
Figura 4. Esquema da Shadoo redobragem para fibrilas amilóides (como descricama no passo 3). Purificada Shadoo converte-se espontaneamente para fibrilas amilóides quando dissolvido em tampão de pH 7. ≥ numa solução ácida, Shadoo converte em fibrilas amilóides após incubação com 1 M Gdn-HCl enquanto se agita. Os ensaios de controlo de qualidade incluem microscopia eletrônica e coloração TT. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Diluir Shadoo para uma concentração final de 2 ^ M num tampão 20 mM Tris-HCl, pH 7,4. Medir a concentração, medindo a densidade óptica da solução a 280 nm e utilizando o coeficiente de extinção deduzida a partir da composição de aminoácidos Shadoo de 20.970.
  2. Incubar 500 ul da solução em um tubo de plástico cónico a 4 ° C durante um par de semanas, para permitir a conversão de proteína espontânea de estruturas amilóides (Figura 4).
  3. Add preparados na hora tioflavina T (TT) para um conce definitivantration de 10 uM a uma alíquota de 100 ul da solução Shadoo. Incubar a solução durante 5 min à TA. Medir emissão de fluorescência a partir de 460 a 520 nm, utilizando um comprimento de onda de excitação de 435 nm, para verificar a presença de estruturas amilóides 17.

4. In Vitro Montagem dos Shadoo para amilóide fibrilas no ácida pHs

  1. Diluir Shadoo em 1 M GdnHCl, tampão de 20 mM de acetato de Na, pH de 5 a uma concentração final de 2 ^ M.
  2. Incubar 500 ul desta solução num tubo cónico com agitação contínua a 37 ° C, durante 3-7 dias.
  3. Verifique a presença de fibrilhas amilóides por adição de TT a uma alíquota da solução como em 3.3.
  4. Dialisar suspensão obtida contra tampão de 10 mM de acetato de Na, pH 5,0, para purificar Shadoo fibrilas amilóides.
  5. Armazenar fibrilas purificada a 4 ° C.

figure-protocol-5
As fracções de proteína Figura 5. Os resultados representativos. Eluídas a partir da coluna carregada com Ni2 + quelante (A) e uma coluna de exclusão de tamanho (B) foram analisadas usando SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Identificação de Shadoo purificada foi avaliada utilizando anticorpo anti-Shadoo SPRN (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Cerca de 5-10 mg de proteína Shadoo purificado é obtido por litro de cultura bacteriana. A purificação em duas fases é necessário para obter Shadoo recombinante de elevado grau de pureza. A primeira etapa é realizada por cromatografia de afinidade com uma coluna de Ni 2+ -charged que conserva as suas-proteínas marcadas. As fracções eluídas são sujeitas a SDS-PAGE e corados com Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). As fracções que contêm proteína são reunidas e Shadoo adicionalmente purificado...

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Discussão

Um protocolo de fácil e eficiente tanto para expressão e purificação de uma grande quantidade de proteína recombinante de ratinho Shadoo é apresentado. O método descrito permite a solubilização e purificação bem sucedida de (His 6) tagged Shadoo proteína recombinante. É importante, tal como referido no título, que quando expresso em uma bactéria procariota E. Shadoo coli acumula-se em corpos de inclusão. Antes da purificação Shadoo, as bactérias têm que ser lisadas por sonicação em um tampão...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Natalie Doude e David Westerway (Universidade de Alberta) por nos fornecerem Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) pela construção de plasmídeos, Michel Brémont (INRA) por nos fornecer bactérias BL21Sol; Christine Longin (INRA) pela assistência TEM e Edith Pajot-Augy (INRA) pelos comentários e revisão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AKTA FPLC GE, Amersham# 1363
HiLoad 16/60Superdex GE Healthcare17-1069-01
HiTrap IMACGE HealthcareGE17-0920-05
HiPrep26/10 Coluna de dessalinizaçãoGE HealthcareGE17-5087-01
SoluBL21 Competente E. coliGenlantisC700200
pET-28b+Novogen69865-3
IPTGSigma-AldrichI6758
LB-Broth médioSigma-AldrichL3022
Eppendorf BiophotometarEppendorf550507804
Trito X-100Life Technologies85111
NiSO4Sigma-Aldrich656895
EDTASigma-AldrichE6758
Tris-HClSigma-AldrichRES3098T
Comprimidos de Coquetel Inibidor de ProteaseRoche4693116001
NaClSigma-Aldrich746398
ImidazolSigma-AldrichI5513
Gdn-HClSigma-AldrichG4505
marcador de tamanho de proteína Thermo Fisher Scientific26620

Referências

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Reimpressões e permissões

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