Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

Summary

O objetivo deste protocolo é para demonstrar como controlar a dinâmica da proteína fluorescente marcadas nas superfícies das células da planta com microscopia de epifluorescência de ângulo variável, mostrando pontos de PATROL1 marcadas com GFP, uma proteína tráfico membrana piscando, no córtex celular do complexo estomático em Arabidopsis thaliana.

Abstract

A superfície celular de uma planta é sua interface para perceber pistas ambientais; ela responde com mudanças biológicas celulares, como tráfego de membrana e rearranjo do citoesqueleto. A análise de imagens em tempo real e de alta resolução de tais eventos intracelulares aumentará a compreensão da biologia celular vegetal em nível molecular. A microscopia de epifluorescência de ângulo variável (VAEM) é uma técnica emergente que fornece imagens de lapso de tempo de alta qualidade de proteínas marcadas com fluorescência na superfície da célula vegetal. Neste artigo, são descritos procedimentos práticos para preparação de amostras do VAEM, ajuste do sistema óptico do VAEM, captura de filmes e análise de imagens. Como exemplo de observação do VAEM, são apresentados resultados representativos sobre a dinâmica da PATROL1. Esta é uma proteína essencial para o movimento estomático, que se acredita estar envolvida na entrega da bomba de prótons às membranas plasmáticas no complexo estomático de Arabidopsis thaliana. A observação em tempo real do VAEM de células-guarda e células subsidiárias em cotilédones de A. thaliana mostrou que PATROL1 marcadas com fluorescência apareceram como estruturas semelhantes a pontos nas membranas plasmáticas por vários segundos e depois desapareceram. A análise do quimiograma dos dados do filme VAEM determinou a distribuição temporal da presença (denominada 'tempo de residência') das estruturas semelhantes a pontos. O uso do VAEM é discutido no contexto deste exemplo.

Introduction

A superfície da célula vegetal, incluindo a membrana plasmática e seu citoplasma imediatamente adjacente, é a principal região da percepção e integração de uma célula vegetal de pistas bióticas e abióticas do ambiente extracelular. Em resposta a essas pistas, os componentes da superfície celular, incluindo proteínas da membrana plasmática e o citoesqueleto cortical, sofrem mudanças dinâmicas, em uma escala de tempo de segundos a minutos^1-4. Assim, a imagem em tempo real e de alta resolução de proteínas fluorescentes na superfície celular pode iluminar as respostas de uma planta a pistas ambientais no nível molecular.

A microscopia confocal de varredura a laser é uma ferramenta poderosa para determinação da localização de proteínas marcadas com fluorescência³, no entanto, muitas vezes é difícil monitorar a dinâmica da proteína em tempo real devido aos seus tempos de captura relativamente longos. Uma técnica emergente para monitoramento em tempo real de proteínas na célula vegetal é a microscopia de epifluorescência de ângulo variável (VAEM), que é uma adaptação de equipamentos usualmente utilizados para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Na microscopia TIRF, a fonte de luz de fluorescência-excitação é um campo de luz evanescente que é gerado quando o ângulo de entrada do laser é raso o suficiente para refletir totalmente internamente a luz na interface vidro-água. A profundidade de penetração do campo de luz evanescente é de cerca de 100 nm. A microscopia TIRF é uma excelente ferramenta para imagens de molécula única, como a detecção de exocitose em células animais⁵. No entanto, a luz evanescente não pode atingir as membranas plasmáticas ou o citoplasma cortical nas células vegetais, porque elas têm paredes celulares espessas. Recentemente, o equipamento de microscopia TIRF foi adaptado por biólogos de células vegetais, observando que um laser, se inclinado um pouco mais profundamente do que quando usado para induzir fenômenos de reflexão interna total, poderia excitar a superfície de amostras de células vegetais, resultando em imagens de células vegetais de alta qualidade^6,7. A profundidade da iluminação de excitação é variada ajustando o ângulo de entrada do laser; portanto, essa técnica é descrita como VAEM. Esse sistema óptico também é chamado de microscopia TIRF de ângulo variável (VA-TIRFM) porque existe a possibilidade de que a reflexão total possa ocorrer na interface parede celular-periplasma⁷, no entanto, o termo VAEM é usado neste artigo, conforme o primeiro relato em plantas⁶.

O objetivo deste protocolo é demonstrar procedimentos práticos para usar o VAEM para visualizar a dinâmica de proteínas marcadas com fluorescência em superfícies de células vegetais. Além disso, um protocolo de análise de imagens para quantificar o tempo de residência (duração da presença) das moléculas é descrito para análise de filmes VAEM. O ponto GFP-PATROL1 piscando em células do complexo estomático em cotilédones de Arabidopsis thaliana é usado como exemplo. PATROL1 foi identificado por abordagens genéticas diretas como um gene causal de um mutante de defeito de resposta estomática em A. thaliana⁸. PATROL1 é um homólogo vegetal do MUNC-13, que é um fator de priming na exocitose da vesícula sinapse⁸. Em resposta a estímulos ambientais, como luz ou umidade, acredita-se que PATROL1 regula reversivelmente a entrega de uma bomba de prótons às membranas plasmáticas no complexo estomático. Cada complexo estomático compreende um par de células-guarda⁸ e células subsidiárias⁹, e requerem uma bomba de prótons para o movimento estomático. Nessas células, o PATROL1 marcado com GFP localiza-se em estruturas semelhantes a pontos que permanecem na membrana plasmática por menos de 1 min⁹.

Protocol

1. Preparação de Mudas

1. Esterilizar as sementes.
   1. Preparar a solução de esterilização por adição de 500 ul de NaClO (cloro disponível: 5,0%) e 1 ul de 10% de Triton X-100 a 500 ul de água estéril.
   2. Local ca. 10 transgénica A. thaliana sementes que transportam GFP-PATROL1 ⁸ para um tubo de 1,5 ml.
   3. Adicionar 1 ml de solução de etanol a 70% e misturar bem por inversão cinco vezes. Deixe por 1 min.
   4. Observar as sementes afundam para o fundo do tubo. Em um gabinete de fluxo laminar limpo, remova cuidadosamente a 70% de etanol utilizando uma micropipeta, e adicionar 1 ml de solução de esterilização. Misturar bem invertendo cinco vezes e deixar durante 5 min.
   5. Lavam-se as sementes. Ainda trabalhando sob condições assépticas em uma bancada limpa, retire suavemente a solução utilizando uma micropipeta, e adicionar 1 ml de água estéril. Repita isso cinco vezes. As sementes esterilizadas podem ser armazenados em água estéril a 4 ° C durante 2 dias.
2. assimw as sementes esterilizadas em um 0,5% gellan solidificou-gum 1/2 Murashige e Skoog placa de meio (pH 5,8) ^9. Tape o tampa sobre a placa utilizando duas camadas de fita cirúrgica.
3. Incubar a placa no escuro a 4 ° C, com uma câmara de armazenamento frio, S / N.
4. Transferir a placa em uma câmara de crescimento fixada em 23,5 ° C com uma 12-h / 12 horas de luz-escuridão ciclo utilizando 100 umol m ^-2 s ^-1 luzes brancas, e incubar durante 7 dias. As plântulas com cotilédones de cerca de 1 mm de comprimento pode então ser colhida.

2. Céu Gota de montagem de Cotilédone Amostras

NOTA: Um fator importante na preparação de amostras para observação VAEM é evitar a inclusão de bolhas de ar entre a amostra ea tampa de vidro. Bolhas reduzir significativamente a qualidade da imagem de VAEM por causar diferenças no índice de refracção. Um método simples, a que chamamos «céu gota 'de montagem, pode ser usado para evitar bolhasentre a A. cotilédones thaliana e a tampa de vidro. Isto deve ser feito imediatamente antes da observação.

1. Colocar 30 mL de tampão basal [5 mM de 2- (N-morfolino) etanossulfónico ácido-Tris (MES-Tris) a pH 6,5, KCl 50 mM, 100 uM de CaCl _2] no centro de uma lâmina de vidro (tamanho: 76 × 26 mm, espessura: 1,0-1,2 mm).
2. Remover um cotilédones de uma muda de 7 dias de idade usando tesouras de dissecção. Flutuador o cotilédone com a observação lateral virado para cima sobre a gota de tampão basal (Figura 1, passo 1).
3. Colocar 30 mL de tampão basal no centro de uma tampa de vidro (tamanho: 18 × 18 mm, espessura: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, passo 2). Vire a tampa de vidro de cabeça para baixo suavemente. Tensão superficial impedirá a queda tampão de cair. Segure a tampa de vidro com uma pinça em uma extremidade. Coloque a borda oposta sobre a lâmina de vidro, de modo que a queda de tampão é de cerca de cima do cotilédone.
4. Com a extremidade de tampa de vidro ainda no slide, e ainda com a extremidade oposta, com uma pinça, ajustar a posição do tampão de gota sob o vidro de cobertura de modo a que seja directamente por cima da amostra de cotilédones (Figura 1, passo 3). Deixe de lado a tampa de vidro. Montar uma gota sobre a amostra resultante em uma preparação sem bolhas de ar.
5. Limpe o excesso de buffer usando tecidos que não soltem fiapos. Observe a preparação de imediato (ver passo 3).
   NOTA: Não há nenhuma necessidade para selar as amostras.

3. VAEM Observação e Aquisição de filme

NOTA: O sistema de microscópio TIRF ⁹ utilizada no presente estudo é descrito como se segue: Um microscópio invertido está equipado com uma unidade de TIRF e uma lente objectiva TIRF com uma abertura numérica de 1,49. Para o controle informatizado do ângulo de entrada de laser, uma caixa de controle é usado. A proteína fluorescente verde (GFP) está animado com a 488 nm laser semicondutor de bombeamento óptico, e tele fluorescência é detectada através de um filtro passa-banda para impedir a 510-550 nm a partir de cloroplastos autofluorescência. O valor máximo medido de potência de saída de fibra é 13,0-13,5 mW. Para a detecção, um elétron multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM-CCD) Sistema de cabeça de câmera e uma unidade de mudança de ampliação da câmera C-mount são usados.

1. Calibra-se o laser de centragem e de focagem de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Este passo é crucial para observações VAEM precisos. É altamente recomendável que as verificações periódicas dos procedimentos de ajuste de caminho laser, apropriado para o seu microscópio, são realizadas.
   1. Determinar a posição central iluminado com um caminho objetivo luz livre de lente no teto da sala de microscopia. Para marcar a posição central, colocar um selo colorido círculo no teto (Figura 2, passo 1, 2).
   2. Iluminar o tecto com uma lente objectiva (Figura 2, Passo 3, 4). Mova o illuminated região para a posição central (Figura 2, passo 5). Foque a laser (Figura 2, Passo 6). Afinar a posição do laser focado para o centro (figura 2, o passo 7).
2. Defina uma amostra na platina do microscópio e selecione as células para a observação com uma iluminação de campo claro.
3. Verificar que a proteína fluorescente pode ser observada nas células, e definir a posição z -axis na superfície da célula utilizando iluminação epi fluorescência (Figura 3A).
4. Execute observações VAEM.
   1. Inclinar o ângulo de entrada do feixe de laser, gradualmente, com a caixa do controlador. Ao mesmo tempo, monitorar a imagem ao vivo com cuidado. Inicialmente, a imagem ficará borrada (Figura 3B).
   2. Como o ângulo de laser aumenta, a imagem VAEM irá tornar-se menos turva, eventualmente, produzir uma imagem nítida (Figura 3C e D). Neste ponto, parar de aumencante o ângulo de laser. Se o sinal de fluorescência é perdido, para diminuir um ângulo mais aberto.
   3. Afinar o ângulo de entrada de laser para obter uma imagem melhor. Ajuste fino da posição do z -axis também pode melhorar a imagem. Se necessário, ajustar os parâmetros ópticos (potência do laser, comprimento de onda e conjuntos de filtros) e parâmetros do sensor de imagem [tamanho da imagem, tempo de exposição, ganho, digitalizadoras e (EM) de ganho de elétron-multiplicando].
      NOTA: Para o caso de o equipamento TIRF microscópio descrito acima, os parâmetros representativos são como se segue. Ampliação da lente apenas na frente da câmera: 2X; Saída de laser: 1,0 mW; Tamanho da Imagem: 512 × 512 pixels; Tempo de exposição: 100 ms; Ganhar: 5 ×; Digitador: 11 MHz; e EM ganho: 100.
5. Adquirir um filme como um arquivo de imagem TIFF de várias páginas usando o microscópio software comercial. Aqui, o filme é de GFP marcadas com pontos a piscar na superfície de células estomatais.
   NOTA: As condições de aquisição de imagem representativos são como folbaixos. Modo de Aquisição: Fluxo para a RAM; Número de imagens: 600; e tamanho de arquivo TIFF de várias páginas: ~ 302 MB.

4. Análise quimógrafo para Quantificação de marcado com GFP Dot Residence tempo usando Software Fiji

1. Instale Fiji ('Fiji é apenas ImageJ ") usando software ^{de 10} instruções dos autores (http://fiji.sc/Fiji).
2. Execute Fiji e abra o arquivo TIFF multi-página adquiridos utilizando o menu de Fiji "File-Open".
3. Coloque uma linha no local de interesse, usando a ferramenta de barra de menu Fiji "Selection Tool linha reta". Opcionalmente, use a "Selection Tool linha segmentada" ou "Ferramenta de Seleção de Linha Freehand". Nos resultados aqui apresentados, uma linha recta de 100 pixels (correspondendo a 8,0 uM) foi colocada sobre uma célula controlada (Figura 4A).
4. Faça uma imagem quimógrafo usando o menu de Fiji "Imagem-Pilhas-Dynamic corte virtual "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figura 4B). Opcionalmente, "Inverter verticalmente" e "girar 90 graus" em uma janela de caixa de seleção também estão disponíveis (não utilizado nos resultados aqui apresentados). O x e eixo y na imagem quimógrafo indicam a posição da linha (100 pixels correspondente a 8,0 mm) e tempo de observação (600 pixels correspondente a 60 seg), respectivamente. Se a imagem quimógrafo não é satisfatória, a posição e tipo (linear, segmentada e à mão livre) da linha a imagem multi-página no podem ser alteradas. Como as mudanças de linha, a imagem quimógrafo muda dinamicamente. Salve uma imagem de quimógrafo como um arquivo TIFF usando o menu de Fiji "File-Save As-Tiff".
5. Medir o comprimento da mancha na orientação do eixo do tempo.
   1. Para executar redução de ruído, aplicar um filtro Gaussian às imagens quimógrafo usando o menu Fiji "Processo de Filtros-Gaussian Blur". O "Sigma (RadIUS) "parâmetro é sintonizável (1 pixel de raio é utilizado para os resultados apresentados).
   2. Segmento as regiões sinal de limiar, utilizando o menu de Fiji "Imagem-Ajustar-Threshold".
      NOTA: Existem vários algoritmos de limiarização para escolher. Em resultados apresentados, o algoritmo "Yen" foi escolhido (Figura 4C).
   3. Prepare-se para medir o tempo (y) -axis comprimento do blob usando o menu "Medições Analisar-Set". Verifique o "rectângulo envolvente" na janela "Definir Medidas". Idealmente, o conjunto área deve ser tão pequena quanto possível, para excluir o ruído. Aqui, a área mínima foi fixada em 50 pixels. Medir o tempo (y) -axis comprimento do blob usando o menu "Analyze-Analise Particles". Para obter os valores de resultados e provar a credibilidade das regiões de medição, verifique as "Mostrar resultados" e "Adicionar ao Gerente </ em> "caixas.
   4. Valores na coluna "altura" são o tempo (y) -axis comprimentos para o blob medido (Figura 4D). Salve os valores usando o menu tabela Resultados "Arquivo-Salvar como" e calcular e processar o conjunto de dados de durações imagem blob usando um pacote estatístico e / ou software de planilha (Figura 4E).

Results

Neste artigo de vídeo, os protocolos de observação VAEM de GFP-PATROL1 em A. células complexas thaliana cotilédones estômatos são fornecidos. Montagem gota Sky é um método de preparação simples que podem ajudar a reduzir a ocorrência de bolhas de ar em preparações VAEM de A. cotilédones thaliana (Figura 1). Overtilting do laser de entrada e / ou z-posicionamento dos espécimes para VAEM proporcionará uma imagem pouco clara. Se isso acontecer, recomenda-se iniciar de no...

Discussion

Neste artigo de vídeo, os protocolos são dadas para a monitorização e a medição do comportamento dinâmico de GFP-PATROL1 pontos sobre o complexo estomatal da Arabidopsis thaliana. Como mostrado aqui, observação VAEM é uma poderosa ferramenta para geração de imagens ao vivo de superfícies de células vegetais. Sob as condições experimentais utilizadas aqui para monitorização GFP-PATROL1, houve muito pouca fotobranqueamento fluorescência na amostra utilizada durante 1 min de captura de vídeo, porque o EM-CCD altam...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio invertido	Olympus	IX-73
Unidade TIRF Lente	Olympus	IX3-RFAEVAW
	Olympus	UAPON 100 &vezes; OTIRF	NA = 1,49
Caixa de controle de ângulo de laser	Chuo Seiki	QT-AK
Laser semicondutor bombeado opticamente	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510- Filtro passa-banda de 550 nm	Olympus	U-FBNA
EM Câmera CCD	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
Unidade de mudança de ampliação de câmera C-mount	Software Olympus	U-TVCAC
MetaMorph	Molecular Devices	MetaMorph versão 7.7.11.0
Manual de microscopia TIRF	Olympus	AX7385	Instruções: Sistema de Iluminação de Reflexão Interna Total (Impresso no Japão em 24 de agosto de 2012)
Óleo de imersão	Olympus	Typr-F	ne = 1,518 (23 graus)