Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

Resumo

Um protocolo para a extração e pré-concentração de estradiol de amostras de água usando um sistema automatizado e miniaturizado é apresentado.

Resumo

Um novo método de extracção em fase sólida (SPE) de amostras de água do ambiente é proposto. O protótipo desenvolvido é amigável custo-eficiente e usuário, e permite realizar SPE rápido, automatizado e simples. A solução de pré-concentrado é compatível com a análise por imunoensaio, com um conteúdo de solvente orgânico de baixo. É descrito um método para a extracção e concentração da pré-hormona natural 17β-estradiol em 100 ml de amostras de água. SPE de fase reversa é efectuada com octadecil-sílica adsorvente e a eluição é feita com 200 ul de metanol a 50% v / v. Eluente é diluída por adição de di-água para baixar a quantidade de metanol. Depois de preparar manualmente a coluna SPE, o procedimento geral é realizada automaticamente dentro de 1 hora. No final do processo, a concentração de estradiol é medido usando um ensaio imuno-sorvente comercial ligado a enzima (ELISA). 100 vezes pré-concentração é conseguida e o teor de metanol em apenas 10% v / v. Recuperações de pleno direito da moléculasão alcançados com 1 ng / L amostras adicionadas desionizada e água do mar sintética.

Introdução

A preparação da amostra é uma etapa importante em qualquer processo analítico. Em particular, a remoção dos efeitos de matriz, diminuição das interferências, e enriquecimento da substância a analisar são necessárias para obter resultados precisos e atingem baixos limites de detecção. Compostos de desregulação endócrina (EDC) são particularmente preocupantes devido à sua ação sobre os organismos vivos, mesmo quando presentes em níveis muito baixos no meio ambiente. O hormônio natural 17β-estradiol está presente na poluição da água UE Watch List e propenso a ser adicionado à lista de substâncias prioritárias regulamentados pela Directiva-Quadro da Água da UE. Extracção em fase sólida (SPE), é geralmente utilizado para a análise de pequenas poluentes na água, com tanto química ^1-5 (cromatografia, espectrometria de massa) e métodos de detecção imunológicos ^6-9. Este último ganhou interesse no campo da monitorização ambiental, como imunoensaios estão disponíveis em grande variedade de formatos, são específicas para a TArPegue analito, e atingir baixos limites de detecção. ^{6, 7, 10, 11} Vários ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA) estão comercialmente disponíveis e permitem analisar várias amostras ao mesmo tempo sobre uma placa multi-poços. O procedimento consiste em passos de reacção sucessivos que podem levar algumas horas. O produto final da reacção pode ser detectado opticamente para determinar a concentração da molécula alvo com base em uma curva de calibração.

SPE procedimentos clássicos incluem sorvente pré-condicionado, extracção da amostra, a lavagem, a eluição, e concentração por evaporação do eluente. O solvente utilizado para a diluição deste extracto é escolhido dependendo do método de detecção. ¹² Para os métodos imunológicos, a quantidade de solvente orgânico influências fortemente a sensibilidade do método.

Para além da recuperação e os desempenhos de pré-concentração, o método também tem de ser simples e de custo eficiente. Automação do Procedure ajuda a reduzir erros humanos-relacionados. No nosso trabalho anterior ¹³ que introduzida a protótipo para SPE automatizado, e o nosso método foi aplicado para a análise da hormona natural 17β-estradiol nas amostras de água do mar. Com o presente vídeo, gostaríamos de destacar as vantagens técnicas do nosso método em comparação com off-line tradicional e on-line SPE, e em particular a sua compatibilidade com detecção por imuno-reacções. Nós descrevemos o protocolo aplicado a amostras de água para a detecção de 17β-estradiol. SPE é realizada com octadecil-silica (C18) de fase sorvente e a eluição é realizada com metanol diluído.

Protocolo

Nota: O protocolo seguinte descreve a SPE realizada em amostra de 100 ml de água com sorvente C18 e eluição com 50% v / v de metanol. A amostra é diluída enriquecido para chegar a 10% v / v de metanol, antes da análise com um ensaio de imunoabsorção enzimática kit (ELISA).

1. Preparar os reagentes

1. Prepare as amostras de água
   1. Antes de qualquer outra etapa, filtrar cada amostra de 100 ml de água com filtros de tamanho de poro de 0,2 um.
   2. Pico a amostra com a concentração desejada por diluição volume apropriado da solução de referência para um volume de água. Por exemplo, preparar 100 mL de amostra de água com 100 ng / L de E2 através da diluição de 3,3 ml de solução de referência E2 a uma concentração de 300 ug / L. Diluir esta solução dez vezes para obter uma amostra enriquecida com 10 ng / L E2. Dilui-se esta última mais de dez vezes para se obter uma amostra de 100 ml com 1 ng / L E2.
   3. Colocar a amostra filtrada (não modificada ou perfurantes) em um frasco de vidro com GLinha L45. Utilizar a amostra no mesmo dia. Pegue uma pequena fração de ser analisadas com o ELISA para estimar concentração inicial.
2. Preparar 300 ul de eluente por diluição em metanol (di) água desionizada a 50% v / v em um tubo apertado.

2. Preparação da coluna de SPE

1. Preparar uma solução 20 mg / ml, suspensão de partículas de octadecil-sílica absorventes, adicionando primeiros 1.600 ul de metanol e em seguida 400 ul de di-água a 40 mg de adsorvente de fase inversa. Feche bem a tampa e agitar com um vortex.
2. Instalação da membrana inferior na coluna
   1. Selecione uma membrana de nylon com tamanho de poros de 11 mm e coloque-a sobre uma dupla camada de tecido anti-poeira. Com um furador de diâmetro de 3 mm, cortar duas peças pequenas na membrana.
   2. Pegar numa das pequenas membranas com uma extremidade plana fórceps de filtro e colocá-lo sobre um lado da coluna.
   3. Parafuso do conector de fundo plano com o tubo e aperte. A membrana é now no lugar e o adsorvente pode ser adicionado de forma segura. Desenhar uma seta no corpo da coluna de apontamento para o fim em que a membrana foi colocada.
3. Preparação da coluna de sorvente embalado
   1. Fixe a coluna no suporte com a seta apontada para o fundo. A coluna deve ser definido como na vertical quanto possível.
   2. Anexar um vazio 10 ml seringa descartável para a extremidade do tubo da coluna, utilizando os conectores Luer-Lock.
   3. Prepare uma micro-pipeta com uma ponta de 20-200 �, ajustar o volume para 100 l. Este formato de ponta de pipeta é adaptada ao tamanho da coluna de adsorvente a ser preparado. O procedimento seria mais difícil com pontas de pipeta maiores, como os usados ​​com pipetas de 1 ml.
   4. Agita-se a suspensão sorvente com um vortex, e pipeta-se rapidamente 100 pi no centro sobre a coluna. Embora a injecção, aspirar suavemente pipetado toda a solução através da membrana usando a seringa com a outra mão. Neste sta idade, a solução de encher a seringa tem de estar livre de partículas, e um leito de partículas pode, eventualmente, ser observada na coluna.
   5. Repetir este processo mais 2 vezes por agitação da suspensão de pasta entre todos os passos de pipetagem para garantir a suspensão homogénea das partículas em solução. A coluna resultante contém 6 mg de sorvente.
   6. Quando os 300 ul de suspensão ter sido carregado e secou-se por aspiração com a seringa, manter a seringa na posição e colocar a segunda membrana de nylon sobre a parte superior, utilizando a pinça com a outra mão.
   7. Aperte o segundo conector com tubo e descarte da seringa. A coluna de SPE está pronto para uso.

3. Preparação do Sistema

1. Aperte a coluna SPE no dispositivo usando os conectores Luer-Lock. A seta aponta para deve ser na mesma direcção que a mostrada no dispositivo.
2. Ligue o frasco contendo a amostra para o dispositivo por enroscamento afornecida tampa de segurança GL45 nele.
3. De carga de 200 mL de eluente no reservatório "Eluente '.
4. Carga de 800 ul de di-água no reservatório "diluição".
5. Coloque uma garrafa na saída de resíduos para recolher a água processada durante a etapa de extração. O formato não é importante, mas o volume tem de ser suficientemente grande no que diz respeito ao volume da amostra.
6. Coloque um pequeno frasco na saída do sensor com a capacidade mínima volume de 1,5 ml. Um volume máximo de 1 ml será muito pequeno como bolhas se formarão neste saída ao coletar eluente enriquecido e tampão de diluição.
7. Verifique se o regulador de pressão está na posição fechada, rodando-a manualmente, inverter-horário até novo movimento não é possível.

4. SPE com o Prototype

1. Ligue o protótipo pressionando o botão na parte de trás.
2. Preparando a interface do usuário e selecionar o programa
   1. Abra a interface do usuário. Selecionara porta de comunicação do computador ao qual o dispositivo está conectado a partir da lista e clique no botão "Next".
   2. Digite os valores para 580 pset e 30 para dpset. A bomba irá ajustar para manter a pressão no sistema pressurizado e reservatórios em 580 ± 30 mbar quando em execução.
   3. Selecione o modo automatizado.
   4. No canto modo automatizado, carregar o arquivo de programa no "caminho do arquivo de configuração 'caixa.
3. Ajustar o regulador de pressão
   1. Comece a bomba.
   2. Gire manualmente o regulador de pressão até que o valor lido para preg é inferior mas próximo de 320 mbar.
   3. Parar a bomba.
4. Iniciar o procedimento de SPE
   1. Prima 'start' no canto automatizado modo. A bomba irá ligar e as etapas de extração, eluição e diluição seguirá automaticamente o outro. Todo o procedimento para uma amostra de 100 mL é realizada em 50 min.
   2. Verifique se o valor de preg. Ele deve estar na gama de 320 - 350 mbar durante a fase de extracção para assegurar uma taxa de fluxo óptima.
   3. Feche o pequeno frasco e armazenar a 4-5 ° C no escuro até à análise. Realizar a análise em 30 horas a seguir para evitar a degradação da substância a analisar.
   4. Elimine a água processada.
5. Limpeza do sistema
   Nota: Após cada procedimento de extração do sistema precisa ser limpo para evitar a contaminação cruzada.
   1. Prepara-se uma solução de 10 ml de metanol a 70% v / v em um frasco de vidro de 45 GL.
   2. Desligue a coluna SPE e ligue o tubo com conectores.
   3. No modo automático, selecione o arquivo 'limpeza' e iniciá-lo com as configurações mesma pressão.

5. Detecção de Concentração de Estradiol com ELISA

1. Preparar as amostras de calibração com concentrações, tal como indicado no protocolo fornecido com o kit de ELISA que é utilizado. Prepare uma calibração definido com a mesma matriz, como a amostra, e um conjunto de calibragem com metanol a 10% v / v.
2. Retirar a quantidade necessária de amostra nos poços na placa, de acordo com as instruções do fabricante. Use amostras de calibração, as amostras de água não modificados e perfurantes que foram filtrados, mas não processados ​​com a SPE, e amostras enriquecidas em metanol a 10% v / v. Use 3 poços por amostra para reduzir o erro associado com o ensaio.
3. Seguir as indicações do protocolo que é fornecido com o kit para a adição de reagentes, tempo de incubação, lavagem e posterior reacção com a enzima.
4. Ler o sinal óptico em cada poço de acordo com as instruções do fabricante do kit com um instrumento leitor de placas e recolher os dados.
5. Utilizar o software do instrumento leitor de placas para se ajustar às curvas de calibração e determinar a concentração de E2 na amostra inicial com mesma matriz, e nas amostras enriquecidas com metanol a 10% v / v.

Resultados

A reprodutibilidade da embalagem sorvente foi avaliada por secagem e pesagem do sorvente pipetado em frascos de vidro e o resultado é mostrado na Figura 1. A reprodutibilidade do tempo de injecção foi testado para as amostras de 100 ml, como mostrado na Figura 2. A concentração in inicial e pré- concentrado cravado amostras foram determinadas usando um kit comercial de ELISA para 17β-estradiol e são mostrados na<...

Discussão

Foi proposto um novo método para a preparação de amostras de água seguida por análise utilizando imunoensaio. O instrumento permite realizar extração em fase sólida de forma automatizada e fácil de usar.

A filtração da amostra de água antes da sua injecção no sistema é crítico. Quaisquer partículas ainda presentes na solução seria, potencialmente, causar o entupimento da rede de fluidos e obstruir a coluna de SPE. Outro passo importante é a preparação da coluna de SPE. A quantidade de partíc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membrana filtrante 0,2 μ m tamanho do poro	Merck Millipore	GNWP04700	Para filtração de amostras
Membrana de nylon 11 μ m tamanho de poro	Merck Millipore	NY1104700	Para coluna SPE
Perfurador de biópsia descartável 5 mm	Orçamento Médico	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μ m diâmetro de partícula
Água do mar sintética	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Metanol	VWR
17beta-estradiol padrão	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol Kit ELISA	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 poços, faixa de 30 - 3.000 ng/L