A Microsurgical Modelo Novel para heterotópico, em bloco da parede torácica, Thymus, e Transplante Cardíaco em Ratos

Resumo

Para estudar o alotransplante combinado de órgãos sólidos e compostos vascularizados, descrevemos um novo modelo heterotópico de transplante de parede torácica, timo e coração em camundongos usando uma técnica de manguito cervical sem sutura.

Resumo

Deve-se buscar a exploração de novas estratégias no transplante de órgãos para prolongar a sobrevida do aloenxerto e minimizar a necessidade de imunossupressão de manutenção a longo prazo. O emprego do transplante vascularizado de medula óssea e o cotransplante do timo têm se mostrado promissores nesse sentido em vários modelos animais. ^1-11 O transplante de medula óssea vascularizada permite a transferência ininterrupta de células da medula óssea do doador dentro do microambiente preservado do doador, e a incorporação de tecido timo com transplante de medula óssea vascularizada demonstrou aumentar o quimerismo de células T, desempenhando um papel de suporte na indução da regulação imunológica. A combinação de alotransplante de órgão sólido e composto vascularizado pode combinar essas estratégias de forma única na forma de um novo modelo de transplante. Os modelos murinos servem como um excelente paradigma para explorar os mecanismos de rejeição aguda e crônica, quimerismo e indução de tolerância, fornecendo assim a base para propagar estratégias superiores de sobrevivência do aloenxerto para modelos animais maiores e futura aplicação clínica. Aqui, desenvolvemos um novo modelo heterotópico de transplante de parede torácica, timo e coração em camundongos usando uma técnica de manguito cervical sem sutura. A experiência em ambientes de transplante singênico e alogênico é descrita para futuras investigações imunológicas mais amplas por meio de um manuscrito instrucional e suplemento de vídeo.

Introdução

O transplante cardíaco é o tratamento de escolha para insuficiência cardíaca em estágio terminal. Tanto os avanços técnicos quanto as inovações farmacológicas impulsionaram o campo para taxas de aceitação precoce de enxertos acima de 90%. ^12,13 Apesar disso, 60-80% de sobrevida do enxerto em 5 anos está estagnada e a rejeição crônica, caracterizada por vasculopatia do transplante, permanece inevitável. ^14-16 Além disso, os pacientes são submetidos a múltiplos procedimentos cirúrgicos e imunossupressão ao longo da vida, que estão associados a deformidades da parede torácica e sequelas e toxicidades médicas, respectivamente. A necessidade de abordagens inovadoras para estender a sobrevida do aloenxerto, minimizar os requisitos imunossupressores e oferecer opções reconstrutivas para deformidades anatômicas é premente.

O alotransplante composto vascularizado oferece uma estratégia única para melhorar os resultados do transplante cardíaco, tanto do ponto de vista imunológico quanto reconstrutivo. ¹⁷ Os aloenxertos compostos vascularizados também são únicos no sentido de que possuem uma fonte inerente de células-tronco hematopoiéticas derivadas de doadores, que mostraram uma capacidade favorável de reduzir a imunossupressão e induzir e sustentar o quimerismo misto. ^1-8 Além disso, o co-transplante do timo demonstrou prolongar a sobrevida de transplantes de órgãos sólidos e aloenxertos compostos vascularizados. ^2,9-11 A combinação dessas estratégias com o transplante cardíaco oferece uma nova solução para os desafios mencionados acima diante do transplante cardíaco. ¹⁸

Os modelos murinos servem como excelentes plataformas para investigação mecanicista in vivo devido à disponibilidade de anticorpos e cepas endogâmicas e nocautes bem definidas. ^19-21 Embora o transplante cardíaco em camundongos seja comumente estudado usando um modelo de transplante de sutura microcirúrgica intra-abdominal heterotópico^22-25, um modelo de técnica de manguito heterotópico, cervical e sem sutura mostrou ser extremamente replicável, confiável e apresenta menos taxas de trombose. ^19,26,27 O objetivo deste estudo é desenvolver uma técnica heterotópica de transplante osteomiocutâneo em bloco de parede torácica, timo e coração em camundongos para estudar os mecanismos imunológicos do alotransplante combinado de órgãos sólidos e compostos vascularizados usando uma técnica de manguito cervical sem sutura. Este aloenxerto em cluster é perfundido através da anastomose da aorta descendente do doador para a artéria carótida comum direita e da artéria pulmonar do doador para a veia jugular externa direita. A preservação dos vasos torácicos internos e dos ramos do timo associados é fundamental para perfundir a parede torácica (esterno, costelas, músculos e pele) e o timo.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos foram concluídos em conformidade com a Universidade Johns Hopkins e do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e os requisitos de Serviço de Saúde Pública. Este protocolo segue o Comité de Johns Hopkins University Animal Care e Use, conselho de revisão institucional aprovou orientações (número de protocolo M013M490). Dados de sobrevivência final foi registrada para os procedimentos cirúrgicos descritos abaixo. Dador e do receptor animais recebem anestesia de preferência usando a buprenorfina a 0,1 mg / kg sc uma hora antes da cirurgia e no buprenorfina animal receptor é re-administrado na mesma dose após o transplante e re-administrado como necessário, nas primeiras 48 horas depois da cirurgia.

1. Doadores Allograft Recovery

Nota: Comece a porção doador do transplante 40 min mais cedo do que o transplante de destinatário para minimizar o tempo de anestesia destinatário e para facilitar um tempo do fim simultânea ou ligeiramente ouvidotempo do fim Lier versus a preparação destinatário.

1. Use instrumentos de microcirurgia estéreis padrão e luvas estéreis para o procedimento. Nosso laboratório utiliza esterilização autoclave de instrumentos de microcirurgia.
2. Anestesiar o rato doador (masculino) usando isoflurano vaporizador indução em 4%. Usando cortadores mecânicos atraumáticas remover o cabelo da cervical, torácica, e na região abdominal. Colocar o animal na posição supina e manter isoflurano em 1-2% através de um cone do nariz. Certifique-se anestesia adequada em todo o processo por avaliar periodicamente o reflexo toe pitada retirada.
3. Antes da incisão na pele, amplamente preparar o dispositivo através da aplicação de anti-séptico iodopovidona seguido de álcool isopropílico com um cotonete estéril.
4. Comece com uma incisão cutânea transversal superficial com uma tesoura em toda a pele cervical e abdominal. Ligar as duas incisões bilateralmente ao longo das linhas axilar média.
5. Utilizando uma pinça microcirúrgicadissecar a região cervical bilateral para identificar, ligar e dividir as veias jugulares externas com fio de seda 6-0 e tesoura. Em seguida, utilizando eletrocautério dividir os esternocleidomastoideo para expor as veias jugulares internas e artérias carótidas comuns, bilateralmente. Passe uma sutura de seda 6-0 sob o lado esquerdo eo lado direito da carótida comum e veias jugulares internas na forma a granel.
   NOTA: Eles vão ser amarrado e dividida mais tarde no Passo 1.9.
6. Acentuadamente dividir os músculos cinta e tecido areolar frouxo associados, localizados anteriormente à traquéia, usando uma tesoura para libertar os restantes anexos da região cervical.
7. Utilizando o eletrocautério bipolar e dissecção afiada, dividir os principais músculos peitorais e clavículas para expor os vasos subclávia e ligar (6-0 seda) e dividir proximal.
8. Em seguida, delicadamente, agarrar e retirar o pênis do animal. Ao longo do dorso do pénis visualizar a veia dorsal do pénis, e o desinfectarregião com álcool isopropílico. Usando uma agulha de 30 G, injectar 30.000 unidades de heparina por via intravenosa através da veia dorsal do pénis e permitir que os a recuar para trás para a sua posição original. O vazamento parcial da solução de heparina para o tecido circundante pode ocorrer.
9. Usando os laços granel previamente colocados ao redor da artéria carótida comum e veia jugular interna, ligar e dividir as estruturas, bilateralmente.
10. Use a tesoura próximos para fazer uma incisão intrabdominal transversal. Eviscerar os intestinos para expor a veia cava inferior infrahepatic injectar e 2 ml de solução cardioplégica a frio de Euro-Collins na infrahepatic veia cava inferior. Certifique-se de injecção adequada, visualizando descoloração fígado e cessação do batimento cardíaco antes de avançar para o passo seguinte.
    NOTA: solução de Euro-Collins é preparado em nosso laboratório, consulte a tabela de reagentes e instrumentos específicos.
11. Usando uma tesoura aceder à cavidade intratorácica através de um diaph bilateralincisão ragmatic do abdômen exposto. Estender a incisão cefálica através dos músculos intercostais e costelas. Reflita parede torácica expondo o coração, timo, e grandes vasos, assegurando simultaneamente a preservação dos vasos torácicos internos ao longo da parede torácica.
12. Injectar a suprahepática veia cava inferior com 4 ml de solução de cardioplegia fria Euro-Collins.
13. Identificar a raiz da aorta e traçar distal à aorta descendente. Cortou drasticamente a aorta descendente (preservando comprimento máximo).
14. Identificar o tronco pulmonar e dividir apenas proximal ao seu ponto de ramificação (preservando comprimento máximo). Em seguida, usando 2 ml de solução de cardioplegia fria Euro-Collins, lave o tronco pulmonar e cardíaca, colocando uma ponta de cateter plástico macio para o lúmen do tronco pulmonar.
15. Usando um fio de seda 6-0, ligadura e dividir a veia cava inferior, confluência das veias pulmonares, e ramos acessórios da veia cava superior bilateral. Em seguida, elevee dissecar o cefálica coração dos apegos ao longo da dos brônquios fonte e traquéia, com cuidado para não entrar as vias aéreas. Utilizando o eletrocautério bipolar agudo e dissecar a parede torácica, timo, coração e liberando-lo completamente do camundongo doador.
16. Finalmente, a guarnição da parede torácica processo de rejeição ao ex vivo para um tamanho menor, com uma tesoura, ao longo do esterno e costelas lateral, com o cuidado de não perturbar os vasos torácicos internos (Figura 1A). Para minimizar hemorragia após a revascularização, usar eletrocautério bipolar ao longo das fronteiras do esterno osteomusculocutaneous.
17. Coloque o allograft em 10 ml de frio ⁽⁴ ° Celsius) solução Euro-Collins se o destinatário não está preparado para inserção. No entanto, se o destinatário está pronto para inserir, transferir o allograft direto para o campo operatório destinatário.

2. Destinatário Preparação

Nota: Para minimizar o tempo de anestesia destinatário,começar a preparação destinatário em um posto operativo separado cerca de 40 min antes do término da colheita doador do enxerto.

1. Use um conjunto separado de instrumentos de microcirurgia estéreis padrão e luvas estéreis para o procedimento.
2. Anestesiar o mouse destinatário (masculino ou feminino) usando isoflurano vaporizador indução em 4%. Usando cortadores mecânicos atraumáticas remover os pêlos da região cervical e torácica direita.
3. Posicione o mouse na posição supina e ângulo do membro superior direito ligeiramente inferiormente formando um ângulo de 110 graus entre a cabeça e membro superior direito. Manter a anestesia em 1-2% de isoflurano através de um cone do nariz.
4. Coloque petróleo pomada oftálmica nos olhos de ratinhos usando um aplicador de ponta de algodão. Antes da incisão na pele, amplamente preparar o local da cirurgia usando anti-séptico iodopovidona seguido de álcool isopropílico.
5. Com uma tesoura, faça uma incisão na pele da linha média ao longo da bor inferior direitoder da mandíbula e estender a incisão ínfero-lateralmente à região torácica direita. Usando dissecção romba com pinças microvasculares, mobilizar a veia jugular externa por circunferencial livre do navio do tecido mole e adventícia. Divida todos os ramos usando bisturi elétrico, e remover o lobo direito da glândula submandibular com dissecção aguda e eletrocautério para espaço livre para o processo de rejeição.
6. Assegurar comprimento suficiente da veia jugular externa para everter ao longo de um punho, e ligar a veia jugular externa utilizando uma sutura de seda 6-0. Inserir a veia através do lúmen de um manguito pré-cortada poliimida e usar um grampo microvascular buldogue para fixar a bainha-conduta complexo navio no lugar. Em seguida, usando uma tesoura, proximal dividir a veia jugular externa, Evert sobre o punho, e fixar no lugar com uma sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
7. Divida o músculo esternocleidomastóideo direito com bisturi elétrico bipolar para expor a artéria carótida comum. Mob circunferencialilize artéria cefálica ao ponto mais distal na região cervical. Isto é conseguido utilizando uma dissecção romba do recipiente com fórceps para remover o tecido mole circundante e adventícia.
8. Usando 6-0 sutura de seda, ligadura e dividir a artéria carótida comum. Passe a artéria através do lúmen de um manguito precut poliimida e corrigi-lo no lugar com um bulldog microvascular braçadeira tão perto da entrada torácica possível. Divida o vaso distalmente, dilatar suavemente a embarcação usando um dilatador microcirúrgica, Evert sobre o punho, e fixar no lugar com uma sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
   NOTA: O dilatador microcirúrgico específico é descrito na tabela de reagentes e instrumentos específicos.

3. Allograft Inset

1. Manter instrumentação estéril padrão e luvas estéreis para colocar enxerto na região cervical do destinatário em um de cabeça para baixo e posição oblíqua.
2. Em seguida, coloque o aor doador descendentelúmen tic sobre a construção manguito arterial do destinatário e corrigi-lo no lugar com uma sutura de nylon 10-0 (Figura 1C e 1D).
3. Moldar o mesmo anastomose como no passo 3.2 entre a artéria pulmonar doador eo evertida construção veia jugular-cuff externo do mouse destinatário (Figura 1C e 1D).
4. Primeiro remova grampo microvascular venoso (veia jugular externa braçadeira) e em seguida, solte o grampo arterial (braçadeira artéria carótida comum). Durante reperfusão arterial, inspecionar a totalidade do enxerto para resolver qualquer hemorragia. Se a hemorragia é visualizado, reaplique o grampo arterial para minimizar a perda de sangue e mitigar a fonte da hemorragia utilizando o eletrocautério bipolar.
5. Inspecione o enxerto e garantir a hemostasia. Solte e remova completamente o grampo microvascular arterial. Observe o coração a mostrar sinais de reperfusão, que serão instantaneamente aparente com a expansão rápida de volume das câmaras cardíacas, e esperar por bcomer para começar dentro de 0,5-1 min. Use soro fisiológico morno (35 ° Celsius) para umedecer o coração.
6. Armar a parede torácica em uma posição anatômica de modo a não induzir qualquer acotovelamento ou tensões nas anastomoses. Fechar a pele da ferida cirúrgica é utilizando 6-0 suturas de nylon contínua (Figura 1E).

4. Cuidados Pós-Operatórios

1. Administrar um bolus fluido intraperitoneal de solução salina 0,3 ml normais imediatamente no pós-operatório para a reposição de líquidos.
2. Em seguida, por via subcutânea injetar buprenorfina (0,1 mg / kg) e enrofloxacina (5mg / kg) para dor e infecção profilaxia, respectivamente.
3. Colocar o animal sob uma lâmpada de calor até que acordar da anestesia e voltar ao decúbito esternal. Durante a recuperação, inspecionar o pescoço para visualizar os batimentos cardíacos fibrillating do enxerto assegurando a perfusão do enxerto adequado.
4. Uma vez acordado e na posição de decúbito, devolver o mouse para uma gaiola separado (sem a companhia de outros ratos) Onde ele pode receber comida e água ad libitum. Devido a qualquer movimento restritiva menor temporária do membro superior direito, deixar uma fonte de alimento de gelatina no chão da gaiola.
5. Observe o mouse destinatário durante 1 h de pós-operatório e, em seguida, devolvê-lo à facilidade gaiola onde ele pode receber comida e água ad libitum e é inspecionada três vezes por dia durante as primeiras 24 horas de atividade e ingestão nutricional. Monitorar ratinhos relativamente a sinais de dor e sofrimento e re-doses com buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea duas vezes por dia, conforme necessário para a primeira 72 h. Examine os animais diariamente a partir daí e pesá-los a cada semana.
6. Consultar com um membro do pessoal veterinário se houver ratos mostrar sinais de dor, angústia, ou a diminuição da ingestão de alimentos para animais. Considere eutanásia no início (no nosso protocolo emprega a técnica eutanásia CO ₂ sobredosagem durante 7 min, seguido por deslocação cervical).
7. Cessação do batimento cardíaco do enxerto é definido como um parâmetro específico levando o mouse para ser sacrificed.

Resultados

Singênico C57BL / 6 transplantes alcançada a sobrevivência a longo prazo. O design do enxerto (Figura 1) provou ser bem sucedida a partir de uma perspectiva de sobrevivência do animal e a capacidade para avaliar a sobrevivência de aloenxertos em curso. Isso foi demonstrado através da pele sobrejacente permanecer viável, ativa o crescimento do cabelo do enxerto em curso, e os batimentos cardíacos foram capazes de ser avaliada com visualização e palpação do dedo. Dados de sobrevivência é representada

Discussão

Há uma infinidade de fenómenos que factor para a investigação imunológica de alotransplante, que incluem mas não estão limitados a mecanismos de rejeição aguda e crónica, apresentação directa e indirecta antigénio, sensibilização destinatário, ou a indução de quimerismo misto. ¹⁹ Modelos animais se tornaram o padrão-ouro para o estudo da imunologia do transplante, e mouse modelos são popularmente implementada devido ao seu baixo custo, disponibilidade de camundongos transgênicos e knockout gene, os anticorpos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		Euro-Collins	A solução não é comprada comercialmente, mas sim preparada em laboratório. Para fazer uma solução de 500 ml, adicione o ingrediente listado abaixo a 330 ml de água bidestilada Misture bem e, em seguida, preencha o restante dos 170 ml de água bidestilada na solução até obter um volume final de 500 ml. Ingredientes: 1,02 g KH2PO4, 3,66 g K2HPO4, 0,56 g de KCl, 0,42 g de NaHCO3 e 17,52 g de glicose.
Sutura	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Suprimentos Veterinários)
Veia do manguito de poliimida (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Artéria do manguito de poliimida (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Cateter de ponta de plástico macio	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Dilatador microcirúrgico	S& T	D-5a.1	Dilatador, 11 cm, FH, 0,1 mm AT10d

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