Artigo de método

Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

9.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

7 de março de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

Neste artigo

Resumo

Duas análises complementares de partículas biológicas atmosféricas de filtros de amostras de ar são descritas aqui: a extração e detecção de endotoxina e de DNA.

Resumo

Aerosol Research Outdoor comumente utiliza partículas amostradas em filtros. Este procedimento permite que várias caracterizações das partículas recolhidas para ser realizado em paralelo. O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. A extracção de moléculas orgânicas de elevado peso molecular, tais como lipopolissacáridos, de filtros amostrados envolve a agitação da amostra, num meio à base de água livre de pirogénio. A subsequente análise baseia-se numa reacção enzimática que pode ser detectada utilizando uma medição turbidimétrica. Como resultado do elevado teor orgânico nos filtros da amostra, a extracção de ADN a partir de amostras é realizada usando um kit de extracção de DNA comercial que foi originalmente concebido para solos e modificados para melhorar o rendimento de ADN. A detecção e quantificação de espécies microbianas específicas usando Reacti cadeia da polimerase quantitativaem análise (Q-PCR) são descritos e comparados com outros métodos disponíveis.

Introdução

Amostragem de ar em filtros é uma ferramenta básica na investigação aerossóis atmosférica. 1 Os filtros são amostrados o ponto de partida para várias propriedades químicas, físicas e biológicas das caracterizações partículas ambiente recolhida. 2-11 A vantagem desta abordagem é que várias análises podem ser realizado fora de linha na mesma amostra. Compilando os dados de todas as diferentes análises permite ao pesquisador obter uma boa compreensão das características das partículas e auxiliares colhidos em resolver questões complexas nas ciências atmosféricas. 12,13 Por exemplo, aparelhos de ar amostras marinhas e fluviais tomada durante o mesmo período pode ser comparado com respeito à toxicidade de partículas amostrado e composição biológica. 14 para este estudo, lipopolissacáridos (LPS), componentes de células, as paredes bacterianas gram-negativas, também conhecidos como endotoxinas, foram extraídos a partir de filtros amostrados em terra e em um site para o interior, e foram avaliados usando olimulus amebócito lisado (LAL) de teste. Em paralelo, uma avaliação do conteúdo genómico bacteriano (bactérias totais, bactérias gram negativas, e cianobactérias) foi realizada na mesma amostra, utilizando a reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR). O teste LAL baseia-se em medições de turvação formada após a adição de um extracto aquoso de amebócitos do caranguejo-ferradura, Limulus polyphemus, a uma solução aquosa que contém as endotoxinas. Quanto maior for a concentração de endotoxinas na amostra, a turbidez mais rapidamente se desenvolve. 15 A análise Q-PCR baseia-se num sinal de fluorescência emitido como um fragmento de ADN específico é amplificado. 16 por monitorização em tempo real do sinal durante a fase exponencial da PCR reacção e de calibragem com uma curva padrão, a quantidade inicial de ADN pode ser quantificada. A combinação destas duas análises em conjunto com os outros, como detalhado em outra parte, 14 pode fornecer uma boa estimativa dos níveis de endotoxina e aquantidade de bactérias nas amostras de origem.

O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. Embora os métodos para a amostragem das características físico-químicas e inorgânicos dos aerossóis são bem conhecidos e, mais recentemente, têm sido desenvolvidos métodos para investigar a sua componente de matéria orgânica, 17 houve uma pesquisa escassa no componente biológico de aerossóis. 18 A razão para a corrente de método é preencher esta lacuna, apresentando em pormenor um método robusto para extrair, analisar e identificar a fração biológica de aerossóis 14.

O método detalhado aqui é esperado para encontrar uma ampla utilização em projectos de investigação biológicos interiores e exteriores de aerossol que envolvem a análise de filtro 20-24.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Nota: Uma lista detalhada de todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo é mostrado na seção Materiais.

1. Amostragem de Ar em filtros

  1. Preparação de Filtros
    1. Para a amostragem de alto volume, utilize 20,3 x 25,4 cm2 filtros. Escolha o tipo específico de filtro que melhor se adapta às necessidades de investigação, bem como o tamanho de corte do filtro, se for o caso. 1 Aqui, filtros de microfibra de uso de quartzo.
    2. filtros de pré-cozer servem para a extracção de compostos orgânicos e biológico para destruir os resíduos orgânicos. Para pré-bake os filtros, envolvê-los individualmente em papel alumínio e, em seguida, fazê-los em um forno de laboratório a 450 ° C durante pelo menos 5 horas.
    3. Armazenar os filtros de forno à temperatura de -20 ° C até à colheita.
  2. Manuseamento instrumento e Air Sampling
    1. pó residual limpa da cabeça do amostrador de grande volume. Limpe as peças com toalhetes de papel limpo e permitir-lhes befo de ar secore reconectar-los para o amostrador.
    2. Desinfectar a cassete do filtro com etanol, e trabalhar com luvas e uma bata de laboratório em todos os momentos.
    3. Colocar um filtro de pré-cozido dentro da cassete de filtro limpo, e proceder de acordo com o manual amostrador de grande volume.
    4. Marque a data e quaisquer condições meteorológicas incomuns, se for o caso (por exemplo, chuva, tempestade de areia) sobre o envoltório de alumínio, e salve-o em um local limpo até a conclusão da amostragem.
    5. Recolher o filtro de amostragem e dobre-o ao meio, com o lado amostrados voltado para dentro.
    6. Envolver o filtro na folha de alumínio original e armazenamento a -20 ° C até à análise.
      Nota: Se o intervalo de tempo entre a amostragem e análise é mais do que 2 meses, armazenar a amostra a -80 ° C para evitar a degradação do material orgânico e biológica.

Análise 2. endotoxina

Nota: desinfectar a superfície de trabalho com 70% de etanold trabalho com acesso de pirogénios tubos, apenas dicas e reagentes. Se material de vidro são usados, pré-aquecimento a 250 ° C durante 30 min, ou a 200 ° C durante 60 minutos é necessária. 25 Prepara todos os reagentes numa câmara de biosegurança classe II e trabalhar com luvas e uma bata de laboratório em todos os momentos.

  1. Preparação de Reagentes
    1. Siga o protocolo do fabricante kit da LAL para reidratar o ligado imediatamente antes da utilização. 26 Toque suavemente no frasco para desalojar LAL restantes nas paredes do frasco. Retirar o tampão suavemente para quebrar o vácuo. Usando uma seringa com agulha, adicionar 5 ml de água isenta de pirogénios (PFW) para o frasco para hidratar todo o conteúdo lisado e misturar delicadamente para evitar a formação de espuma.
    2. Fecha-se o frasco com uma película de parafina de plástico quando não em uso e armazenar a 4 ° C durante até dois dias. Armazenar qualquer lisado restante à temperatura de -20 ° C durante até três meses.
      Nota: Este reagente pode ser congelado apenas uma vez.
    3. Reidratar o controle endotoxina padrão (CSE), que contém 0,5 μ; g E. coli, de acordo com o protocolo do fabricante. 27 Determinar a quantidade específica de água a ser adicionada ao frasco CSE a partir do site do fabricante 28, digitando o número do lote do kit quando especificado no site. A concentração final de E. coli no frasco, é medido em unidades de endotoxina (UE; UE onde 10 = 1 ng). Marque esse frasco ed0.
    4. Selar o frasco CSE com filme plástico de parafina quando não em uso e armazenar a 4 ° C por até 4 semanas.
  2. Curva padrão e Preparação cravado-filter
    1. Em uma cabine de segurança biológica de classe II, preparar 22 tubos de 2 ml de centrifugação isentos de pirogénios contendo quantidades decrescentes de CSE (tubos Ed1-Ed11) ou nenhuma CSE (o tubo em branco contendo apenas PFW) para produzir uma série de diluições de endotoxina duplicado, como mostrado na Tabela 1.
    2. Em um gabinete biológico com fluxo circular, cortar 22 pedaços circulares de filtro limpo, pré-cozidos usando um desinfectada 1.1 2 centímetros broca do diâmetro da rolha.
    3. Colocar os pares de filtros em placas de Petri estéreis.
    4. Pico de 50 ul a partir de cada membro da série de diluição endotoxina Ed2-Ed11 e do tubo em branco para um par correspondente de filtros.
    5. Deixar as placas de Petri contendo os filtros perfurantes abertas sob o capô para secar por 30 min.
    6. Coloque cada pedaço de filtro num tubo livre de pirogénio 2 ml.
Tubo A concentração final de endotoxina (UE mL -1) Volume de endotoxina padrão (ml) Pyrogen volume de água livre (ml) volume total (mL)
ed0 2.500 solução Estoque * 5
Ed1 1.000 80 (a partir de ed0) 120 200
Ed2 100 20 (a partir de Ed1) 180 200
ED3 50 10 (a partir de Ed1) 190 200
ED4 25 5 (de Ed1) 195 200
ED5 12,5 2.5 (a partir de Ed1) 197,5 200
ED6 6.25 1,25 (a partir de Ed1) 198,75 200
Ed7 3,125 6,25 (a partir Ed2) 193,75 200
Ed8 1.563 6,25 (a partir ED3) 193,75 200
ED9 0,781 6,25 (a partir ED4) 193,75 200
ED10 0,391 6,25 (a partir de ED5) 193,75 200
Ed11 0,195 6,25 (a partir ED6) 193,75 200
Em branco 0 0 200 200
* Preparar a solução estoque de acordo com as instruções do fabricante.
">

Tabela 1:. A endotoxina padrão da curva de concentração de endotoxinas, o volume de endotoxina padrão e de água isenta de pirogénios a ser adicionado, e o volume total obtido são detalhados para cada tubo de diluição na curva de calibração.

  1. Extração de endotoxina do Experimental e Filtros cravado
    1. Em um armário biológica com fluxo circular, cortar os filtros de recolha (a partir do passo 1.2) em pedaços circulares usando um 1,12 centímetros broca do diâmetro da rolha desinfectados, e colocá-los, em conjunto com os filtros convencionais perfurantes (do passo 2.2), em 2 isenta de pirogénio- tubos ml (ou seja, os tubos de amostra).
    2. Adicionar 1 ml PFW para os tubos e agitá-los, durante 60 min à temperatura ambiente, usando um agitador laboratorial.
    3. Centrifugar os tubos de amostra em uma microcentrífuga a 375 xg durante 10 min. 29
    4. th de transferênciae sobrenadante, que contém as endotoxinas, para um novo tubo livre de pirogénio 2 ml.
  2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Teste
    1. Determinar a concentração de endotoxina nas amostras por realizar o teste LAL numa microplaca de 96 poços isenta de pirogénios, com um fundo plano e uma tampa.
    2. Plano do arranjo de placas previamente, como se mostra na Figura 1. Incluir uma curva padrão preparada directamente a partir de soluções-padrão de endotoxina Ed2-Ed11 (e, portanto, cobrindo a gama de concentrações de 100-0.195 UE / ml (ver secção 2.2)) em cada placa de execução . A curva padrão deve ocupar cavidades 1-10 de linhas A e B da placa. Separe poços 11-12 nestas linhas para amostras em branco (perfazendo um total de quatro espaços em branco).
    3. Ligue o leitor de microplacas e programá-la para uma reacção cinética que envolve a incubação da microplaca a 37 ° C e agitação a cada 5 min, seguida por medidas de absorção a 405 nm. Repetir 18 vezes durante 1,5 h.
    4. Determinar a eficiêncy com que as endotoxinas são extraídos a partir dos filtros de recolha (isto é., as amostras obtidas a partir dos filtros padrão perfurantes) através de divisão da quantidade calculada de endotoxina por o montante original é cravado.
    5. Iniciar o ensaio colocando 50 ul das soluções de endotoxina padrão (do passo 2.4.2), ou do extrato filtro espetado e os seus espaços em branco (de secção 2.3), ou das amostras experimentais e seus espaços em branco (também do ponto 2.3), , conforme a placa-matriz planeada (Figura 1) e fechar a tampa.
    6. Para cada cavidade, adicionar rapidamente 50 ml de solução de LAL, e agitar suavemente a placa horizontalmente, enquanto é colocado sobre a mesa, antes de levantar-o no leitor.
    7. Coloque a placa no leitor de placas e iniciar a execução experimental.

figure-protocol-1
Figura 1:. Placa matriz endotoxina Um examplo de uma matriz de análise de endotoxinas em uma microplaca de 96 poços.

3. Análise Genômica

Nota: Para a extração de DNA, desinfectar a superfície de trabalho com 70% de etanol e trabalhar com tubos estéreis, apenas dicas e reagentes. Para a análise Q-PCR de ADN, desinfectar a superfície de trabalho com a superfície ADN-descontaminante. Prepare todos os reagentes em uma cabine de segurança biológica classe II e trabalhar com luvas e uma bata de laboratório em todos os momentos.

  1. Preparação dos iniciadores e sondas de DNA
    1. Antes de extração de DNA, qualquer ordem de um conjunto disponível no mercado de primers e uma sonda (se o método da sonda de hidrólise é aplicada), ou projetar um novo conjunto de primers e uma sonda utilizando o iniciador concepção de ferramentas computacionais. 30
    2. Re-hidratar os iniciadores de acordo com o protocolo do fabricante usando 10 mM de Tris-ácido etilenodiaminotetraacético 0,1 mM (EDTA) (tampão TE) ou água de grau de PCR.
      Nota: Recomenda-se a dissolver o iniciador de PCR inicial stock em tampão TE baixo com EDTA (0,1%), uma vez que evita a degradação do iniciador quando mantidos durante tempos mais longos. Use água PCR-grade para diluições subsequentes para reduzir a quantidade de EDTA que pode inibir reações de PCR.
    3. Preparar alíquotas de 50 uL ou de 100 uL do iniciador e da sonda em 0,5 ml estéreis tubos e armazenar a -20 ° C até à análise.
  2. Avaliação celular concentração padrão Antes da Extracção de DNA
    1. Num tubo de centrífuga de tamanho adequado, preparar uma solução de células padrão das espécies microbianas de interesse (tubo Od0, TABELA 2A). Misture a suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo no tubo de 7-10 vezes usando uma pipeta com um pequeno furo.
    2. Se as células são coloridas (por exemplo, certos esporos fúngicos), não realizar um procedimento de coloração. Se a coloração de células é necessária, dilui-se a suspensão de células em um corante adequado para a detecção microscópica das células de interesse. 31
    3. Limpe a lâmina de cobertura e hemocytometer com etanol. Umedecer e apor a lamela ao hemocitômetro.
    4. Carregar cerca de 8 ul da suspensão de células em ambas as câmaras hemocitómetro tocando cuidadosamente a extremidade da lamela com a ponta da pipeta e o enchimento da câmara, por acção capilar. Não acima / abaixo encher a câmara.
    5. Determinar o número de células por vê-las sob um microscópio com aumento de 400x (40x na objetiva e 10X no ocular). Nove quadrados medindo 1 x 1 mm e 2 dispostos numa grelha de 3 x 3 deve ser visto. Concentre o microscópio sobre uma das quatro esquinas da grelha (uma ampliação mais elevada pode ser usado). O 1 x 1 mm2 quadrado deve conter 16 quadrados menores.
    6. Contagem de todas as células nos quadrados dos cantos quatro 1 x 2 1 mM, bem como no quadrado do meio da grelha de 3 x 3. Se houver muitas ou poucas células para contar, repetir o procedimento, quer se concentrar ou diluir a suspensão de células original como apropriado (15-50 células devem sobrepor uma área singularização 2 1 mM).
    7. Calcula-se a concentração das células (células ml -1) na suspensão de células padrão Od0 a partir do número de células na média entre os cinco quadrados contadas como se segue: contagem celular ml -1 = contagem celular média quadrada -1 Factor de diluição 10 4.
  3. Avaliação da Eficiência DNA Extraction
    1. Prepare nove estéreis de 0,5 ml tubos de acordo com a Tabela 2A.
    2. Dilui-se a solução de células padrão (Od0) para conter cerca de 10 7 mL -1 células num volume total de 20 ul (DO1).
    3. Adicionar 18 mL de água PCR-grade livre de nuclease estéril (NFW) para tubos OD2-Od8 e 20 l para o tubo em branco, Od9.
    4. Transferência de 2 ul da solução de células de OD1 OD2 em. Pipeta suavemente para misturar e transferir 2 mL de tubo de DO2 para OD3. Continuar diluindo as células da mesma maneira ao longo dos tubos até e incluindo o tubo para o Od8btain uma diluição em série de 10 -10 7 0 ml de células -1.
    5. Em um gabinete biológico com fluxo circular, cortar 18 pedaços circulares de filtro limpo, pré-cozidos, utilizando uma desinfectada 1,12 centímetros broca do diâmetro da rolha. Coloque os filtros em pares em placas de Petri estéreis.
    6. Pico de 10 ul de diluições para OD1 Od8 e a partir da estrutura de tubo Od9 em cada um dos filtros emparelhados, de tal modo que existe um par de filtro que corresponde a cada concentração de células padrão.
    7. Deixar as placas de Petri abertas sob o capô e deixá-los secar por 30 min.
    8. Coloque cada pedaço de filtro num tubo ml estéril com tampa de rosca 2 e extrai-se o ADN de acordo com o procedimento pormenorizado na secção 3.4.
  4. Extração de DNA a partir do Experimental e Filtros cravado
    Nota: Para a extração de DNA a partir de filtros, utilize kits comerciais projetados para a extração de DNA a partir do solo de acordo com o protocolo do fabricante com as seguintes modificações.
    1. Para cada filTer amostra (DO1-Od8), preparar uma mistura de esferas de vidro lavadas com ácido em um tubo estéril de 0,5 ml. Use 0,1 g grânulos com um diâmetro de 425-600 ^ m e 0,3 g de grânulos com um diâmetro de ≤106 uM.
    2. Em um gabinete biológico com fluxo circular, cortar três peças circulares a partir de locais selecionados aleatoriamente em cada amostra de filtro usando um desinfectada 1,12 centímetros broca do diâmetro da rolha, e colocá-los em parafuso-top 2 ml tubos.
    3. Adicionar a mistura de pérolas de vidro para os tubos.
    4. Adicionar o tampão de lise de células-fornecido com o kit de extracção de cada tubo no armário biológica, com a quantidade indicada no protocolo do fabricante.
    5. Prepare um balde de gelo e perturbar as células mecanicamente usando um batedor de talão.
    6. Bater as esferas durante 1 minuto e, em seguida, colocá-los em gelo durante 1 min. Repita cinco vezes.
    7. Prosseguir com o protocolo do fornecedor kit da etapa pós-lise.
    8. Depois da eluição com o tampão de eluição fornecido (contém 10 mM de Tris bpode ser prejudicado) ou NFW, recarregar a amostra eluída através da coluna novamente para melhorar o rendimento DNA.
      Nota: Se não analisados ​​no mesmo dia em que a extracção do ADN, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até à análise.
A- Preparação de Série celular Diluição Padrão
Tubo A concentração celular final (ml -1 de células) volume da célula padrão (ml) Nuclease volume de água livre (ml) O volume total (mL)
Od0 determinar com Hemocytometer câmara de contagem
DO1 deve ser eluida para a gama de 10 ml-1 7 Células 20
OD2 10 -1 DO1 2 de DO1 18 20
OD3 10 -2 OD1 2 de DO2 18 20
Od4 10 -3 OD1 2 de OD3 18 20
Od5 10 -4 OD1 2 de Od4 18 20
OD6 10 -5 OD1 2 de Od5 18 20
Od7 10 -6 OD1 2 de OD6 18 20
Od8 10 -7 OD1 2 de Od7 18 20
Em branco 0 0 20 20
B- Preparação de ADN Curva Padrão
Tubo Concentração final de ADN (mg ml-1) volume de ADN standard (ml) Nuclease volume de água livre (ml) O volume total (mL)
determinar com NanoDrop
DD1 deve ser eluida para a gama de 10 a 1 mg ml -1 20
Dd2 10 -1 DD1 2 de DD1 18 20
DD3 10 -2 DD1 2 de Dd2 18 20
DD4 10 -3 DD1 2 de DD3 18 20
DD5 10 -4 DD1 2 de DD4 18 20
DD6 10 -5 DD1 2 de DD5 18 20
DD7 10 -6 DD1 2 de DD6 18 20
DD8 10 -7 DD1 2 de DD7 18 20
Em branco 0 0 20 20
1 "style =" height: 21px; "> Dd0

Tabela 2:. ADN Curva Padrão série de diluições de células microorganismo Padrão (A) detalhado para o volume padrão de células, o volume NFW, e o volume total em cada tubo de diluição. ADN preparação padrão curva (B), detalhado para o volume padrão de DNA, o volume NFW, e o volume total em cada tubo de diluição.

  1. DNA Curve Preparação Padrão
    1. Extracto de ADN directamente a partir de uma amostra padrão do microrganismo de interesse (Dd0) utilizando o mesmo procedimento tal como descrito para os filtros experimentais no passo 3.4.
    2. Utilizar um espectrofotómetro para determinar a concentração de ADN de amostras de ADN normal (Dd0) a 260 nm.
    3. Prepare nove estéreis de 0,5 ml a partir do qual os tubos para preparar uma curva padrão de DNA, como mostrado na Tabela 2B.
    4. Se necessário, dilui-se a solução de ADN padrão Dd0 para dentro de uma gama de concentração de 1-10 ng mL -1 no primeiro tubo (DD1) num volume total de 20 ul.
    5. Adicionar 18 ul de NFW aos tubos Dd2-DD8 e 20 ul para o tubo vazio.
    6. Transferência de 2 ul da solução padrão de ADN DD1 em Dd2. Pipeta suavemente para misturar e depois transferir 2 mL de Dd2 para DD3. Continuar diluir o ADN da mesma maneira ao longo dos tubos para conseguir uma diluição em série de 10 0 -7 -10 em tubos Dd2-DD8 em conjunto com um tubo em branco containing única NFW.
      Nota: Se não analisados ​​no mesmo dia de extracção, armazenar amostras a -20 ° C até à análise.
  2. Análise Quantitativa-PCR
    1. Ligue o instrumento q-PCR com antecedência para se aquecer.
    2. Em um novo arquivo de programa, insira os detalhes para a q-PCR executado no software operacional instrumento como detalhado na Tabela 3.
      Nota: instrumentos diferentes têm melhor momento diferente para cada etapa do ciclo térmico. Esta entrada é especificado no manual do instrumento.
    3. Desinfectar a superfície de trabalho com a superfície DNA-descontaminante e trabalhar apenas com tubos estéreis, dicas e reagentes.
    4. Prepare um balde de gelo ao lado do banco de funcionamento. Loja mix Taq-polimerase no gelo.
    5. Calcular o número total de poços de reacção que serão ocupadas na placa. Adicione subsídio teórico para reacções adicionais (5%) e multiplicar o número aumentado de reacções por o volume por reacção para calcular o total de reactiovolume de n.
    6. Prepare a reação misturada piscina, a partir NFW, primers, sonda, e por último a mistura de polimerase Taq. Ver exemplo para os cálculos de volume para a piscina misturado na Tabela 4.
    7. Armazenar a mistura reaccional no escuro e em gelo até à sua utilização.
    8. Coloque 1 ul de DNA padrão, o ADN da amostra, ou NFW (como controlo negativo) dentro dos poços da microplaca em Q-PCR em triplicado.
    9. Certifique-se de que a placa está no um suporte da placa para evitar que não toque a superfície de trabalho e para manter limpa.
    10. Adicionar 9 ul da piscina misto (Tabela 4) em cada poço de reacção.
    11. Cobrir a placa com película adesiva óptica e feche-o bem de todos os lados.
    12. Girar a placa em uma centrífuga com baldes placa durante 1 min a 1000 x g antes de o colocar no dispositivo de Q-PCR.
    13. Coloque a placa no instrumento e ativar o programa em execução.
Parâmetro detalhes Comentários
método de detecção sonda de hidrólise quantitativa
condições de ciclos térmicos
A desnaturação inicial e activação de enzimas 95 ° C durante 10 min
desnaturação 95 ° C durante 15 seg repetir 45 vezes
O recozimento e a extensão 60 ° C durante 60 seg
arranjo de placas
curva padrão DD1 - DD8 3 repetições por diluição em 1-8 poços nas 3 principais linhas
controle não-modelo (NTC) água livre de nuclease (NFW) 3 repetições no 9º bem no topo3 linhas.
amostras analisadas ADN extraído de filtros 3 repetições por amostra nos poços restantes.
conjunto de primers por cada poço
volume da amostra 10 ml

Tabela 3:. Detalhes para o software operacional q-PCR Os detalhes dos parâmetros de análise a ser celebrado o arquivo de programa q-PCR.

Reagente Volume por reacção (ml) Número de reacções Tolerância para erros(5%) Mistura de volume total (mL)
Taq Polymerase Mix 5 50 52,5 262,5
F iniciador (10 mM) 0,5 50 52,5 26.25
R iniciador (10 mM) 0,5 50 52,5 26.25
água livre de nuclease 3 50 52,5 157,5
ADN - 1 ml vai ser adicionado directamente nos poços de alvo na placa 96.

Tabela 4:. Quantitative-PCR Mix Reaction Cálculo Volume por reacção, número de reacções, tolerância para erros, e o volume total calculado a ser adicionado à mistura de reacção por reagente são detalhados.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

É comum para estudar aerossóis atmosféricos usando "off-line" análises de filtros amostra (ver Figura 2). Analisa 32 química do material incluem orgânico (por exemplo, proteínas, as moléculas de hidrocarboneto, sacáridos) e inorgânico (por exemplo, metais, sais) conteúdo amostrado . análises biológicas incluem conteúdo viáveis ​​e não viáveis ​​microrganismo, identificação de espécie utilizando uma abordagem de ADN ou microscopia, b...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este trabalho descreve métodos de extração e detecção para quantificar tanto endotoxinas e DNA presente em amostras de aerossóis recolhidas em filtros. Os métodos requerem rotinas precisas e pode ser executada facilmente, desde que o experimentalista adere a alguns pontos essenciais e importantes discutidos aqui.

Para o passo de detecção de endotoxina, note que o lisado solução é bastante viscosa e tende a produzir bolhas mediante pipetagem. É difícil de remover ti bolhas, e eles levam a alt...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Yoav Barak, da Faculdade de Química do Instituto Weizmann, pelo apoio e aconselhamento. Este estudo foi apoiado pela Israel Science Foundation (concessão # 913/12) e pela Minerva Foundation com financiamento do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filter sampling
HiVol 3000 - Amostrador de Ar de Alto VolumeEcotech
Quartz Microfiber FiltersWhatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - Fornos de Câmara de LaboratórioCarboliteELF 11series
Folha de alumínioOpala
< strong>NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Endotoxina
EtanolSigma Aldrich16368 Reagente de laboratório, 96%
Gabinete de Segurança Biológica Airstream Classe II AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates de Cape Cod, Inc.T0051
Associados de Endotoxina Padrãode Controle de Cape Cod, Inc.E0005-1Escherichia coli  O113:H10, 0.5 µ g/frasco 1 Pacote
de Água Reagente LALAssociates of Cape Cod, Inc.W0051
Seringa estéril de 10 ml com ponta Luer-LokBecton-Dickinson & Co.
Agulha de seringa BD PrecisionglideBecton-Dickinson & Co.305129Estéril 
Fita de vedação Parafilm-MParafilmP7543Número de catálogo Sigma
MicrotubosAxigenMCT-200-C2 ml, livre de pirogênio
1,12 cm de diâmetro Broca de CortiçaBoekel Scientific1601 Série BD - AçoParte de um conjunto de broca de cortiça contendo brocas com vários diâmetros. 
Placa de Petri de 50 mmMiniplast Ein-Shemer72050-01Aseptic
Vortex Genie 2 Indústrias Científicas, Inc.SI-0297
Microcentrífuga 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI c/tampaNunc167008Poços de fundo plano (com tampa (embalados individualmente)), estéreis, livres de pirogênio
Leitor de microplacas multidetecção Synergy HTBiotek7091000
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DNA
DNA awaySigma Aldrich7010
DNA padrão das espécies microbianas de interesseATCC ou outra coleçãoA cepa microbiana apropriada para extração de DNA ou o DNA
extraídoNeubauer-improvedMarienfeld640030hemocitômetro
TE tampão, baixo EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8.0)  0,1 mM EDTA 
Água de grau PCR livre de nuclease Sigma Aldrich3315959001
Primers PCRSigma AldrichTem como alvo as espécies microbianas de interesse
Sondas duplamente marcadasSigma AldrichTem como alvo as espécies microbianas de interesse
Tubos com tampa de roscaAxigenST-200-SS2 ml 
Kit de extração de DNA PowerSoil Mo Bio Laboratories12888-100
Contas de vidro, lavadas com ácido 425-600 µ mSigma AldrichG8772-100G
Contas de vidro, lavadas com ácido < 106 µ mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1Tampão de lise celular, Kit de solo de energia
Balde de gelo Magic TouchBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus Sistema de PCR em tempo realaplicado Biosystems4376600
rápido SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4370048
Placa de reação óptica rápida de 96 poços MicroAmp com código de barras, 0,1 mlApplied Biosystems4346906
Base sem respingos MicroAmp Base de 96 poçosApplied Biosystems4312063
Filmeadesivo óptico MicroAmpCentrífuga4311971
5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62 com baldes MTP 
309605 de cultura Applied Biosystems

Referências

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

An lise de EndotoxinasExtra o de DNAAmostragem por FiltroMedi o Turbidim tricaPCR QuantitativoRompimento por Esferas de Vidrogua Livre de Pirog niosProtocolo de Centrifuga oCabine de Biosseguran aLeitor de Microplacas

Artigos relacionados