Duas análises complementares de partículas biológicas atmosféricas de filtros de amostras de ar são descritas aqui: a extração e detecção de endotoxina e de DNA.
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Artigo de método
Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aerosol Research Outdoor comumente utiliza partículas amostradas em filtros. Este procedimento permite que várias caracterizações das partículas recolhidas para ser realizado em paralelo. O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. A extracção de moléculas orgânicas de elevado peso molecular, tais como lipopolissacáridos, de filtros amostrados envolve a agitação da amostra, num meio à base de água livre de pirogénio. A subsequente análise baseia-se numa reacção enzimática que pode ser detectada utilizando uma medição turbidimétrica. Como resultado do elevado teor orgânico nos filtros da amostra, a extracção de ADN a partir de amostras é realizada usando um kit de extracção de DNA comercial que foi originalmente concebido para solos e modificados para melhorar o rendimento de ADN. A detecção e quantificação de espécies microbianas específicas usando Reacti cadeia da polimerase quantitativaem análise (Q-PCR) são descritos e comparados com outros métodos disponíveis.
Introdução
Amostragem de ar em filtros é uma ferramenta básica na investigação aerossóis atmosférica. 1 Os filtros são amostrados o ponto de partida para várias propriedades químicas, físicas e biológicas das caracterizações partículas ambiente recolhida. 2-11 A vantagem desta abordagem é que várias análises podem ser realizado fora de linha na mesma amostra. Compilando os dados de todas as diferentes análises permite ao pesquisador obter uma boa compreensão das características das partículas e auxiliares colhidos em resolver questões complexas nas ciências atmosféricas. 12,13 Por exemplo, aparelhos de ar amostras marinhas e fluviais tomada dura....
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Protocolo
Nota: Uma lista detalhada de todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo é mostrado na seção Materiais.
1. Amostragem de Ar em filtros
- Preparação de Filtros
- Para a amostragem de alto volume, utilize 20,3 x 25,4 cm2 filtros. Escolha o tipo específico de filtro que melhor se adapta às necessidades de investigação, bem como o tamanho de corte do filtro, se for o caso. 1 Aqui, filtros de microfibra de uso de quartzo.
- filtros de pré-cozer servem para a extracção de compostos orgânicos e biológico para destruir os resíduos orgânicos. Para pré-bake os filtros, envolvê-los indiv....
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Resultados
É comum para estudar aerossóis atmosféricos usando "off-line" análises de filtros amostra (ver Figura 2). Analisa 32 química do material incluem orgânico (por exemplo, proteínas, as moléculas de hidrocarboneto, sacáridos) e inorgânico (por exemplo, metais, sais) conteúdo amostrado . análises biológicas incluem conteúdo viáveis e não viáveis microrganismo, identificação de espécie utilizando uma abordagem de ADN ou microscopia, b.......
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Discussão
Este trabalho descreve métodos de extração e detecção para quantificar tanto endotoxinas e DNA presente em amostras de aerossóis recolhidas em filtros. Os métodos requerem rotinas precisas e pode ser executada facilmente, desde que o experimentalista adere a alguns pontos essenciais e importantes discutidos aqui.
Para o passo de detecção de endotoxina, note que o lisado solução é bastante viscosa e tende a produzir bolhas mediante pipetagem. É difícil de remover ti bolhas, e eles levam a alt.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Yoav Barak, da Faculdade de Química do Instituto Weizmann, pelo apoio e aconselhamento. Este estudo foi apoiado pela Israel Science Foundation (concessão # 913/12) e pela Minerva Foundation com financiamento do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - Amostrador de Ar de Alto Volume | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Fornos de Câmara de Laboratório | Carbolite | ELF 11series | |
| Folha de alumínio | Opala | ||
| < strong>Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Endotoxina | |||
| Etanol | Sigma Aldrich | 16368 | Reagente de laboratório, 96% |
| Gabinete de Segurança Biológica Airstream Classe II AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates de Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Associados de Endotoxina Padrão | de Controle de Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µ g/frasco 1 Pacote |
| de Água Reagente LAL | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| Seringa estéril de 10 ml com ponta Luer-Lok | Becton-Dickinson & Co. | ||
| Agulha de seringa BD Precisionglide | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Estéril |
| Fita de vedação Parafilm-M | Parafilm | P7543 | Número de catálogo Sigma |
| Microtubos | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, livre de pirogênio |
| 1,12 cm de diâmetro Broca de Cortiça | Boekel Scientific | 1601 Série BD - Aço | Parte de um conjunto de broca de cortiça contendo brocas com vários diâmetros. |
| Placa de Petri de 50 mm | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Indústrias Científicas, Inc. | SI-0297 | |
| Microcentrífuga 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI c/tampa | Nunc | 167008 | Poços de fundo plano (com tampa (embalados individualmente)), estéreis, livres de pirogênio |
| Leitor de microplacas multidetecção Synergy HT | Biotek | 7091000 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| DNA padrão das espécies microbianas de interesse | ATCC ou outra coleção | A cepa microbiana apropriada para extração de DNA ou o DNA | |
| extraídoNeubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocitômetro |
| TE tampão, baixo EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0,1 mM EDTA |
| Água de grau PCR livre de nuclease | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| Primers PCR | Sigma Aldrich | Tem como alvo as espécies microbianas de interesse | |
| Sondas duplamente marcadas | Sigma Aldrich | Tem como alvo as espécies microbianas de interesse | |
| Tubos com tampa de rosca | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| Kit de extração de DNA PowerSoil | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Contas de vidro, lavadas com ácido 425-600 µ m | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Contas de vidro, lavadas com ácido < 106 µ m | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Tampão de lise celular, Kit de solo de energia |
| Balde de gelo Magic Touch | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Sistema de PCR em tempo real | aplicado Biosystems | 4376600 | |
| rápido SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| Placa de reação óptica rápida de 96 poços MicroAmp com código de barras, 0,1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Base sem respingos MicroAmp Base de 96 poços | Applied Biosystems | 4312063 | |
| Filme | adesivo óptico MicroAmpCentrífuga | 4311971 | |
| 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 com baldes MTP |
Referências
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C.
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Reimpressões e permissões
