Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Summary

Este é um protocolo rápido e econômico para a produção de proteínas de mamíferos glicosiladas secretadas e subsequente purificação em uma única etapa com rendimentos suficientes de proteína homogênea para cristalografia de raios-X e outros estudos biofísicos.

Abstract

A produção de proteínas secretadas de mamíferos para estudos estruturais e biofísicos pode ser desafiadora, demorada e cara. Aqui descrito é um protocolo eficiente em termos de tempo e custo para expressão de proteínas secretadas em células de mamíferos e purificação em uma etapa usando cromatografia de afinidade de níquel. O sistema é baseado na transfecção transitória em larga escala de células de mamíferos em suspensão, o que diminui muito o tempo de produção de proteína, pois elimina etapas, como o desenvolvimento de vírus de expressão ou a geração de linhagens celulares estáveis. Este protocolo utiliza agentes de transfecção baratos, que podem ser facilmente feitos por simples modificação química, ou agentes de transfecção de preço moderado, que aumentam o rendimento por meio do aumento da eficiência da transfecção e diminuição da citotoxicidade. O monitoramento cuidadoso e a manutenção dos níveis de glicose do meio aumentam o rendimento de proteínas. O controle da maturação de glicanos nativos na etapa de expressão aumenta o rendimento final de proteínas de mamíferos adequadamente dobradas e funcionais, que são propriedades ideais para a realização da cristalografia de raios-X. Em alguns casos, a purificação de etapa única produz proteína de pureza suficiente para cristalização, o que é demonstrado aqui como um caso de exemplo.

Introduction

Compreender a estrutura da proteína em nível atômico é a chave para desvendar a base molecular das vias biológicas e as doenças. Cristalografia de raios X da proteína é o método mais amplamente utilizado / aplicável para a determinação de estruturas macromoleculares. O principal desafio deste método é a obtenção de quantidades suficientes de devidamente dobradas, proteína pura. Isto torna-se um problema particular quando se trabalha com as proteínas secretadas de mamíferos, que sofrem modificações pós-tradução específicos.

Proteínas expressas em bactérias, são a fonte primária das proteínas cristalizadas depositadas no Protein Data Bank <....

Protocol

1. Produção de miligramas As quantidades de DNA de plasmídeo para a transfecção transitória em grande escala

1. Clone da proteína de interesse em um número elevado de cópias de mamífero vector de expressão de clonagem utilizando local de restrição, ou outra técnica adequada.
   1. Para melhores resultados, use pHLsec ⁷ vetor, que tem um built-in 6His-tag C-terminal, uma seqüência Kozak promotor forte e um sinal de secreção otimizado.
2. Transformar o plasmídeo para células competentes.
   1. Adicionar 20 ul de células competentes de E. coli em 1 ug de ADN plasmídeo e incubar em gelo durante 30 min.
   2. Células de choque....

Results

Aqui a seguir os resultados deste sistema de expressão aplicada a um domínio segregado 13 kDa imunoglobulina (Ig) a partir da proteína do receptor humano provocando expresso em células mielóides (2 hTREM2, resíduos 19-132). Trem2 é uma proteína transmembranar do tipo I contendo um único domínio Ig extracelular que tem duas ligações de dissulfureto e dois locais de glicosilação N-ligados. Ao contrário de muitas outras proteínas de domínio Ig ^8, trem2 não era passível de redobramento de corpos de inclusão bacte.......

Discussion

Células HEK 293F oferecer a produção de proteínas que requerem robusta modificações pós-traducionais. Este sistema permite a expressão rápida e escalável de proteínas nativamente dobradas contendo persulfuretos, glicosilação e fosforilação que seriam ausente usando mais ferramentas de expressão de rotina. Além disso, este sistema pode ser usado para a expressão e purificação de complexos de multi-proteínas simplesmente por co-transfecção de plasmídeos múltiplos. Além trem2, este sistema tem sido extensivamente utilizado.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frascos de Cultura	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use no lugar do
reagente de transfecção	Oz Biosciences	HY01500
293fectin reagente de transfecção	Life Technologies
Reagente de transfecção PEI	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Resina de Amilose	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Suplemento de Cultura de Células
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium para transfecção de DNA
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Células Competentes	Sigma-Aldrich	G2919