Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Resumo

É apresentada aqui uma descrição unificada de técnicas que podem ser utilizadas para desenvolver, transformar, administrar, e testar a expressão da proteína heteróloga dos probióticos levedura Saccharomyces boulardii.

Resumo

O desenvolvimento da terapia oral recombinante permitiria um direcionamento mais direto do sistema imunológico da mucosa e melhoraria a capacidade de combater distúrbios gastrointestinais. A adaptação da levedura probiótica, em particular, para essa abordagem traz várias vantagens. Essas cepas não têm apenas o potencial de sintetizar uma ampla variedade de proteínas heterólogas complexas, mas também são capazes de sobreviver e proteger essas proteínas durante o trânsito pelo intestino. Criticamente, no entanto, essa abordagem requer experiência em muitas técnicas laboratoriais diversas que normalmente não são usadas em conjunto. Além disso, embora os protocolos individuais para transformação de leveduras sejam bem caracterizados para cepas de laboratório comumente usadas, a ênfase é colocada aqui em abordagens alternativas e na importância de otimizar a transformação para cepas probióticas menos bem caracterizadas. Detalhar esses métodos ajudará a facilitar a discussão sobre as melhores abordagens para testar leveduras probióticas como veículos de administração oral de medicamentos e, de fato, servirá para avançar no desenvolvimento dessa nova estratégia para terapia gastrointestinal.

Introdução

Os microorganismos probióticos são um meio potencial intrigantes de entrega eficiente e economicamente proteínas heterólogas para o tracto gastrointestinal. Estes organismos são capazes de sobreviver a passagem através do tracto gastrointestinal ainda não colonizam ^o 1, permitindo que a dosagem controlada e limitação da exposição ao fármaco expressa. Além disso, a capacidade para manipular facilmente destes organismos para a produção de proteína heteróloga em grande escala torna uma alternativa económica para entrega partículas sintéticas. No entanto, o desenvolvimento de uma tal abordagem, como foi recentemente demonstrado utilizando uma estirpe auxotr�....

Protocolo

1. Mutagênese UV para produzir estirpes de levedura auxotróficas

1. Gerar curvas de sobrevivência para determinar doses necessárias de irradiação UV
   1. Prepare de YPD (extracto de levedura de peptona de dextrose) e meios de comunicação de outros reagentes listados na Tabela 1, de acordo com procedimentos padrão e inocular ²⁶ colónias individuais em 5-10 ml de meio YPD. Incubar as culturas num tambor de rolo a 30 ° CO / N à saturação durante pelo menos 8 h.
   2. Determinar a concentração de células de culturas de O / N utilizando um espectrofotómetro de células por diluição 1:10 em água numa cuvete de plá....

Resultados

A geração de uma curva de sobrevivência após a irradiação UV requer plaqueamento das células de levedura diluídas de tal modo que as unidades formadoras de colónias (CFU) distintos são capazes de formar. Cada amostra de 500 ul recolhido como descrito acima contém cerca de 5 X 10 ⁶ células; no entanto, maior do que 100 colónias por placa são difíceis de distinguir com precisão. Plaqueamento amostra não diluída em série, bem como diluições 1:10 de células irradiadas, assim, gara.......

Discussão

Juntos, os protocolos aqui descrever os passos essenciais necessários para o desenvolvimento e teste de estirpes probióticas de levedura auxotróficos para a entrega de proteína terapêutica heterólogo para o intestino. Esta manipulação e teste de levedura probiótica recombinante requer técnicas e recursos com os quais qualquer laboratório indivíduo não pode actualmente ser familiar. Assim, apesar de numerosos estudos anteriores descreveram os protocolos acima para várias cepas de leveduras e do rato, esses métodos não tê.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrofotômetro SmartSpec 3000	BioRad	170-2501	Exemplo de espectrofotômetro para determinar a concentração celular e OD600 de culturas de levedura
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Exemplo de tambor de rolo para incubação de cultura de levedura
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Exemplo de stratalinker
Contador de Colônias Stuart SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Suporte de prato com registros de ampliação a contagem de colônias ao sentir a pressão da caneta
Contador de Colônias Scienceware	F378620002	Bel-Art Scienceware	Caneta de contador de colônia portátil
Dispositivo de revestimento de réplica	Fisherbrand	09-718-1	Exemplo de suporte de revestimento de réplica e almofadas
Quadrados de veludo	Fisherbrand	09-718-2
Espalhadores de células estéreis em forma de L	Fisherbrand	14665230
Ácido desoxirribonucléico, de fita simples de testículos de salmão	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Exemplo de DNA transportador para levedura Transformação LiOAc
Agulhas de gavagem	Braintree Scientific	N-PK  002	Para camundongos de 15 a 20 g, a agulha sugerida é uma agulha de gavagem reutilizável reta de calibre 22 (bola de 1,25 mm), 1 polegada de comprimento. Para camundongos com peso superior a 20  g, agulhas de gavagem reta ou curva de calibre 20 ou maiores podem ser usadas
Seringa de tuberculina descartável de ponta deslizante estéril de 1 ml	Becton Dickinson	BD 309659
Pinça romba, como Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) ponta serrilhada, pinça de aperto largo	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Exemplo de pinça romba necessária para dissecção
Tesoura de dissecção reta e curva	Microscopia eletrônica Ciências	72966-02 e 72966-03	Exemplos de tesouras necessárias para dissecação
IMDM	Tecnologias de vida	12440053