Artigo de método

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

DOI:

10.3791/53459

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22 de dezembro de 2015

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1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.

Resumo

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Um parâmetro importante que determina o sucesso de um procedimento de enxerto ósseo é vascularização da área circundante ao enxerto. Nossa hipótese é que a implantação de um enxerto ósseo induziria maior regeneração óssea por formação de vasos sanguíneos abundante. Para investigar o efeito do enxerto sobre a neovascularização no local do defeito, desenvolvemos uma tomografia (μCT) abordagem computadorizada de micro para caracterizar recém-formando vasos sanguíneos, o que envolve a perfusão sistêmica do animal com um agente de contraste de polimerização. Este método permite uma análise detalhada vascular de um órgão na sua totalidade. Além disso, a perfusão de sangue foi avaliado usando imagiologia de fluorescência (ILF) de um agente fluorescente transmitida pelo sangue. A formação óssea foi quantificada por FLI usando uma sonda segmentadas por hidroxiapatita e análise μCT. O recrutamento de células estaminais foi monitorizada por meio de imagem de bioluminescência (BLI) de ratinhos transgénicos que expressam luciferase sob o controlo do promotor de osteocalcina.Aqui descrevemos e demonstrar a preparação de aloenxerto, cirurgia defeito calvária, protocolos de digitalização μCT para o estudo neovascularização e análise da formação óssea (incluindo a perfusão in vivo de agente de contraste), e o protocolo para a análise de dados.

A análise de alta resolução da vasculatura 3D demonstraram significativamente maior a angiogénese em animais implantados com autoenxertos, especialmente no que diz respeito à formação das arteríolas. Assim, a perfusão de sangue foi significativamente maior no grupo de auto-enxerto pelo 7º dia após a cirurgia. Observou-se a mineralização do osso superior e formação óssea maior medido em animais que receberam autoenxertos. Implantação autotransplante residente induzido recrutamento de células-tronco para a sutura do enxerto ósseo-hospedeiro, em que as células diferenciadas em células formadoras de osso entre o 7º e 10º dia pós-operatório. Esta descoberta significa que a formação óssea aumentada pode ser atribuída aa alimentação vascular aumentada, que caracteriza o implante auto-enxerto. Os métodos apresentados poderão servir como uma ferramenta ideal para estudar a regeneração óssea em termos de formação de osso bem delimitada e neovascularização.

Introdução

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Perda óssea devido ao trauma craniofacial, a ressecção do tumor, craniotomia descompressiva, e defeito congênito raramente cura por si só e apresenta uma necessidade clínica não satisfeitas clara. Enxertos ósseos autólogos e alogênicos enxertos ósseos são amplamente utilizados para tratar estas condições 1.

É amplamente aceito que osteogênese é intimamente ligado com a angiogênese 2,3. Assim, o estudo completo de uma terapia proposta para regeneração óssea deve incluir uma investigação exaustiva da árvore vascular formando ao longo do sítio do defeito completo. Existem vários métodos disponíveis para caracterizar a v....

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Protocolo

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O protocolo segue as diretrizes do cuidado com os animais institucional e uso comissão (IACUC) da Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel, uma instalação AAALAC aprovado (Request MD-12-13524-4 No.), e pelos Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request No. 3770). Os animais foram tratados de adesão estrita às diretrizes do NIH.

1. Preparação de aloenxertos de osso

  1. Eutanásia de 7 a 8 semanas de idade, os ratinhos Balb / C, ou qualquer outra estirpe do receptor, utilizando o método padrão de CO 2 inalação ou injecção intraperitoneal de 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confirmar a ausência de um piscar de....

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Resultados

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A neovascularização foi avaliada através da análise volumétrica μCT e por ILF, utilizando um agente fluorescente transmitida pelo sangue para quantificar a perfusão sanguínea. Sete dias após a cirurgia, μCT varrimento demonstrou um volume significativamente maior de vasos sanguíneos de pequeno e médio Diâmetro em ratos que tinham recebido autoenxertos do que em ratinhos que receberam aloenxertos colhidas a partir de ratinhos C57BL / 6 (Figura 3A). Interessantemente, no grupo de auto-enxerto da árvore va.......

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Discussão

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O objectivo das abordagens de imagem multimodais aqui descritas é permitir meticulosa investigação do eixo angiogénese-osteogénese no contexto de enxerto de osso craniano. A neovascularização foi fotografada utilizando um protocolo μCT, o que permitiu uma alta-resolução demonstração 3D exacta da árvore vascular que alimenta todo o defeito craniano. μCT dados podem ser facilmente analisados ​​utilizando ferramentas avançadas como software IPL. Por exemplo, a análise de espessura mostrado na Figura

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem o financiamento do NIDCR (Grant No. DE019902) e da Fundação Israelense de Ciência (Processo nº 382/13).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C57BL/C  Laboratórios MiceHarlan57
FVB/n Laboratórios MiceHarlan862
FenobarbitalWest waroNDC 0641-0477-25
Máquina de cortar cabelo para roedoresWahl animal8786-451A
Bisturi 11Miltex27111504
Maratona micro motor dentalIII
5 mm trefinaFerramentas de ciência fina18004-50
Creme de depilaçãoVeet
KetaVed (cetamina)VedcoNDC 50989-996-06
DomitorZoetisNADA 141-267
carprofenoNorbrook02000/4229
Pomada para os olhosPuralubeNDC 17033-211-38
Binóculo de operaçãoKent scientificKSCXTS-1121
Tesoura fina Ferramentas Fine Science14060-11
Pinças curvasFerramentas Fine Science11274-20
Espátula em forma de colherFerramentas Fine Science10090-13
Kit de gel Tisseel Fibin 718971Baxter
Ferramentas Fine Science12060-01
sutura de vicryl 4-0EthiconJ392H
AntisedanZoetisNADA#141033
HeparinaSigmaH3393
20 ml luerlock BD302830
23G conjunto de veias do couro cabeludo (agulha borboleta)BD367342
HemostatFine Science tools13008-12
Bomba de seringaAparelho HarvardPHD 2000
3-sec cola gel Placa de
Leica38DI02313
Microfil MV-122flow-techMV-122
μ Scanner CT40Scancoμ CT40
TCA6%SigmaT6399
Osteosense 680PerkinElmarNEV10020EX
Angiosense750PerkinElmarNEV10011
Oxigen 100%
isoflurano (furano)Baxter1001936040
IVISXenogênio
Fusca luciferinaPromegaE160A
Porta-agulhas dissecação de roedores Scotch Cinética

Referências

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  1. Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
  2. Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
  3. Schipani, E., Maes,....

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