Pós Coluna A derivação utilizando a reação Fluxo cromatografia líquida de alta Colunas

Summary

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado.

Abstract

Um protocolo para o uso de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fluxo de reação para métodos que empregam derivatização pós-coluna (PCD) é apresentado. Uma grande dificuldade na adaptação do PCD aos sistemas e colunas de HPLC modernos é a necessidade de bobinas de reação de grande volume que permitam a mistura de reagentes e, em seguida, a reação de derivatização. Esse grande volume morto da coluna de postes leva ao alargamento da banda, o que resulta em uma perda da eficiência de separação observada e, de fato, na detecção de sensibilidade. Na derivatização pós-coluna de fluxo de reação (RF-PCD), o(s) reagente(s) de derivatização é(são) bombeado(s) contra o fluxo da fase móvel para uma ou duas das portas externas da coluna de fluxo de reação, onde é misturado com o efluente da coluna dentro de uma frita alojada dentro do encaixe final da coluna. Essa técnica permite uma mistura mais eficiente do efluente da coluna e do(s) reagente(s) de derivatização, o que significa que o volume dos loops de reação pode ser minimizado ou mesmo eliminado completamente. Verificou-se que os métodos RF-PCD têm um desempenho melhor do que os métodos convencionais de PCD em termos de eficiência de separação observada e relação sinal-ruído. Outra vantagem das técnicas de RF-PCD é a capacidade de monitorar o efluente proveniente da porta central em seu estado não derivado. O RF-PCD foi atualmente testado em uma gama relativamente pequena de reações pós-coluna, no entanto, atualmente não há razão para sugerir que o RF-PCD não possa ser adaptado a qualquer reação de derivatização pós-coluna existente de um ou dois componentes (desde que ambos os reagentes sejam adicionados ao mesmo tempo).

Introduction

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com pós-coluna de derivação (PCD) é uma poderosa ferramenta que é útil para resolver uma série de questões em laboratório analítico. Ele pode ser usado para detectar compostos que são de outra forma indetectável, com o conjunto de detectores disponíveis ^1,2, aumentar o sinal do analito alvo, o que permite que os limites inferiores de detecção e quantificação ^3-5 ou derivatizar selectivamente um analito alvo, a fim de evitar efeitos de matriz ^6. PCD reacções comumente usados ​​incluem a reacção de aminas, tais como aminoácidos, com orto-phthaladehyde ^7-9, ninidrina ....

Protocol

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados).

Nota: Este protocolo descreve 3 métodos de fluxo de reacção de derivatização pós-coluna técnicas (RF-DCP), cada um com u....

Results

O primeiro método de PCD que foi adaptado para utilização por RF-CPD foi a derivatização de antioxidantes, utilizando o radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH ^{•) 24.} Esta reacção foi introduzido por Koleva et al. ^25, e tem sido amplamente utilizada desde então. A detecção se baseia na descoloração do radical DPPH ^• na presença de espécies de oxigénio reactivas, portanto, a presença de antioxidantes resulta numa queda na absorvância observada. O DPPH ^• r.......

Discussion

RF-PCD permite a mistura eficiente do reagente de derivatização com o efluente pós-coluna de HPLC, sem a utilização de bobinas de reacção, minimizando os efeitos de alargamento de banda e melhorar o desempenho da separação. métodos de RF-PCD também mostraram melhorias na resposta de sinal em relação ao método de detecção. Camenzuli et al. ²⁸ foi o primeiro a reportar o uso de colunas de fluxo de reacção com DPPH ^• para a detecção de ROS em uma amostra de café espresso. O estudo envolveu a .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumento para HPLC		Agilent Série 1290 HPLC
Bomba(s) adicional(is) para sistema de derivatização	Shimadzu	LC-20A
RF colum			PEEK não comercial
	Sigma Aldrich	Z227307
Rolhas de			Fornecido com
cortador de tubo PEEK	de coluna Sigma Balança Analítica	Aldrich Z290882
Balança			Balança analítica de 4 pontos
Cronômetro			Equipamento não científico
Frascos de coleta de			Qualquer frasco pequeno com fundo plano serve, e.g., frascos de HPLC Frascos
de			Dependerá do instrumento usado
Recipientes para fase móvel e solução(ões) de derivatizaçãoSigma	Aldrich	Z232211
General Laboratory vidraria			Frascos volumétricos, pipetas, etc. A quantidade e os volumes dependerão do método de preparação da amostra.
Metanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma	Aldrich D9132
Acetato de amônio	Sigma Aldrich	17836
Amônia	Sigma Aldrich	320145
Acetonitrila	Sigma Aldrich	34998
Fluoresamina	Sigma Aldrich	F9015
4- aminoantipireno	Acros Organics BVBA	AC103151000
Ferricianeto de potássio	AnalaR	B10204-30