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Artigo de método

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em

8.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53469

⸱

16 de dezembro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui é mostrado como rastrear e quantificar os processos de desenvolvimento em C. elegans. Os métodos apresentados são baseados em ferramentas de código aberto que podem ser facilmente implementadas. É demonstrado como reconstruir modelos 3D de forma celular, como rastrear manualmente estruturas subcelulares e como analisar o fluxo contrátil cortical.

Resumo

Quantitativamente capturar processos de desenvolvimento é crucial para derivar modelos mecanicistas e chave para identificar e descrever os fenótipos mutantes. Aqui são apresentados os protocolos para a preparação de embriões e adultos C. elegans animais para microscopia de lapso de tempo curto e longo prazo e métodos de rastreamento e quantificação dos processos de desenvolvimento. Os métodos apresentados são todos baseados em C. cepas elegans disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis e no software de código aberto que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório independentemente do sistema de microscopia usado. A reconstrução de um modelo de célula-forma 3D usando o IMOD software de modelagem, o rastreamento manual de estruturas subcelulares fluorescente-etiquetados usando o multi-purpose programa de análise de imagem Endrov, e uma análise de fluxo contrátil cortical usando PIVlab (resolvida no tempo Velocimetry Digital Imagem de Partículas Ferramenta para MATLAB) são mostrados. Discute-se como esses métodos também podem ser implantados to quantitativamente capturar outros processos de desenvolvimento em diferentes modelos, por exemplo, rastreamento de linhagem celular e rastreamento, monitoramento do fluxo de vesícula.

Introdução

Com as melhorias estáveis ​​de proteínas fluorescentes, engenharia de genoma, microscopia de luz, e soft e hardware de computador, agora é possível gravar desenvolvimento de muitos organismos modelo em sem precedentes resolução espácio-temporal. Isto permite aos investigadores fazer perguntas que não podem ser abordados anteriormente ou revisitar processos de desenvolvimento conhecidas, a fim de procurar os aspectos negligenciados. Este progresso tem suscitado o campo da biologia do desenvolvimento quantitativo, que visa transformar qualitativos, modelos informais em modelos quantitativos por meio de medições exaustivas e análises estatísticas.

Células de rastreamento e estruturas subcelulares tornou possível derivar modelos quantitativos do desenvolvimento embrionário, atividade do sistema nervoso, ou a divisão celular 1-12. Ao rastrear restos de divisão celular durante o desenvolvimento precoce do C. elegans embrião, poderíamos recentemente revelam que eles seguem um aparelho de somdigitado caminho e constituem fatores de polarização importante 13,14.

Aqui, os protocolos são apresentados que fazem biologia do desenvolvimento quantitativo aproxima acessível para os não-especialistas. O foco recai sobre três straight-forward, ferramentas livremente disponíveis, que são aplicáveis ​​em qualquer laboratório que tem acesso a microscopia confocal padrão e computadores. Estes incluem um protocolo para gerar formas celulares 3D, um protocolo para rastrear restos de divisão celular, e um protocolo para descrever quantitativamente dinâmica actomiosina corticais. O nemátodo C. elegans é usado como um caso exemplar, no entanto, os métodos e ferramentas discutidas aqui são adequadas para uma variedade de questões em outros modelos biológicos, por exemplo, as células cultivadas, explantes de tecido, Organóides ou esferóides, outros embriões, etc.

Geralmente, algumas das análises mostrados aqui também pode ser realizada com a ferramenta aberta fonte populares ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIJI, os "baterias incluídas" versão do ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para os quais muitos plugins para diferentes análises quantitativas estão disponíveis. No entanto, os programas aqui discutidos são projetados para resolver problemas específicos.

Em primeiro lugar, IMOD, um processamento de imagem, modelagem e suite do display pode ser usado para as reconstruções 3D de cortes seriados de elétron ou microscopia de luz 15. IMOD também contém ferramentas para visualizar os dados 3D a partir de qualquer orientação. Em segundo lugar, Endrov, um programa Java projetado para executar análise de imagem, processamento de dados, e anotação de redes ou faixas (entre outros), com base em uma arquitetura de plugins extensa, com ImageJ compatibilidade de encaixe 16. Ele contém mais de 140 operações de processamento de imagem e uma interface de usuário extensível em que modelo e dados brutos são exibidos separadamente. Seu código fonte pode ser encontrada em https://github.com/mahogny/Endrov. Em terceiro lugar, PIVlab, um HAtlab ferramenta para partículas de imagem digital velocimetria que permite que o usuário quantitativa e qualitativamente analisar campos de fluxo de partícula 17. O uso deste programas requer uma licença MATLAB, que inclui a Imagem Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab é um programa desenhado para descrever quantitativamente o fluxo. Ele calcula a distribuição de velocidade, magnitude, vorticidade, divergência ou de cisalhamento dentro de pares de imagens ou séries. Para isso, cross-se correlaciona pequenas áreas de imagens (chamado de "passes" na seção de protocolo) de um par de imagens para derivar o deslocamento de partículas mais provável. Esta correlação cruzada produz uma matriz de correlação que pode ser analisada, no espaço de domínio de frequência ou utilizando qualquer correlação cruzada directa ou uma transformação rápida de Fourier (FFT), respectivamente.

O equipamento utilizado é um microscópio invertido equipado com uma Nipkow ('fiação') do disco, uma EMCCD, 488 e 561 nm padrão sólido-lasers de estado, e 20x ou 40x de ar ou 60x plano / Apochromat objectivos óleo ou água-de imersão. No entanto, é também possível realizar imagem de lapso de tempo com outras modalidades de imagiologia, por exemplo, ponto-, linha- ​​ou microscopia de varrimento de folha à base de laser, microscopia multi-fotão, bem como microscopia de epi-fluorescência combinado com desconvolução ou estruturada iluminação. A vantagem de utilizar um sistema de disco de Nipkow é a aquisição de imagem extremamente rápida, especialmente se um modo de fluxo contínuo (movimento contínuo e de varrimento do objecto na dimensão Z) está disponível. Além disso, para melhorar a resolução, um extensor de aumento de 1,5 vezes na parte dianteira do EMCCD pode ser usado.

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Protocolo

1. Preparação de C. elegans embriões para Lapso de tempo Microscopia usando Microbeads

  1. Transferência de vermes adultos grávidas usando uma picareta verme (fio de platina) em uma gota de tampão M9 e limpar as bactérias pela primeira vigorosamente agitando e, em seguida, transferindo cada worm para uma queda adjacente de M9 usando um chicote do olho montada em uma picareta do dente / ponteira ou use um capilar de vidro aguçado.
  2. Dilui-se a dispersão contendo as 20 uM esferas de poliestireno diâmetro de 10-vezes em tampão M9 (1 tampão G M9 contém 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, e, depois de autoclavagem (20 min, 120 ° C), adicionar um adicional de 1 ml de uma solução 1 M 4 MgSO).
  3. Adicione uma pipeta de boca a partir de qualquer tipo de capilar de vidro fina (por exemplo, ponto de fusão capilares pontuais ou capilares usados ​​para puxar as agulhas de injecção), cerca de um 0,5 m de comprimento pedaço de borracha, silicone ou material semelhante tubagem (de preferência transparente), A 200 ulponta da pipeta, a tampa de um tubo de PCR de 200 uL, de um filtro hidrofóbico de pequenas seringas (por exemplo., um 0,2-0,45 uM de tamanho de poro de 15-50 mm de diâmetro e de nylon, de PTFE ou material semelhante de filtro), e uma pipeta de 1000 ul ponta . Este tipo de boca pipeta garante que nenhum material biológico pode entrar em contacto com o experimentador.
  4. Montar a pipeta através da inserção da ponta de uma pipeta de 200 uL com a ponta primeiro para o tubo e ligá-lo com a tampa de um tubo de PCR, que apresenta uma perfuração central que coincide com o diâmetro do capilar utilizado. Uma agulha furador ou preparação muito apontada pode ser usado para gerar a perfuração.
  5. Desenhe um capilar fino e inseri-lo na perfuração. Inserir o filtro para a outra extremidade do tubo e inserir uma ponta de pipeta 1000 uL como peça de boca (Figura 1).
  6. Dissecar adultos grávidas cortando transversalmente vermes na vulva com uma lâmina de barbear limpa ou bisturi.
    NOTA: Geralmente, muitos embriões e seráxpulsed após o corte. No entanto, se houver necessidade de embriões, às vezes eles têm que ser liberados a partir da carcaça usando um chicote do olho ou a agulha pontiaguda.
  7. Pipetar uma gota da dispersão de bolhas de polistireno diluída (~ 4 mL) para uma tampa de vidro de 24x60 mm e em embriões de transferência de gota utilizando esta pipeta boca.
  8. Com cuidado, coloque um pequeno (por exemplo, 18x18 ou 20x20 mm) tampa de vidro no topo da gota e certifique-se a queda foi totalmente se espalhar.
    NOTA: A queda também deve ser pequeno o suficiente para não tocar as bordas da tampa de vidro pequeno.
  9. Selar a montagem com vaselina liquefeito. Adicionar uma gota de óleo de imersão no lado 24x60 lamínula mm e prossiga para a seção "Lapso de tempo Microscopia '.

2. Preparação de Adulto C. elegans Animais de Lapso de tempo Microscopia usando Nanobeads

NOTA: Em geral, o protocolo para a montagem de animais adultos, é uma adaptação do protocolo de ref. 18.Com este protocolo, é possível a realização de microscopia confocal de lapso de tempo de longa duração de animais adultos.

  1. Prepara-se uma 1,5% (w / v) de solução de agarose em tampão M9, fervura (1 min, 100 ° C em banho de água ou de microondas). A utilização de maiores concentrações de agarose não é recomendado uma vez que isto pode levar a extrusão do intestino e / ou partes da gónada.
  2. Atenha-se 2-3 camadas de fita em duas lâminas de microscópio cada. Coloque um slide sem fita entre os dois slides com fita.
  3. Utilizar uma ponta de pipeta e colocar uma gota da solução de agarose quente no centro da lâmina secundária. Colocar rapidamente uma outra corrediça para a gota de modo que seja suportada pelas camadas de fita de cada lado. Isto irá criar uma almofada redonda e agar apartamento de cerca de 10 mm de diâmetro.
  4. Colocar uma gota de solução de esferas 100 nm (não diluído, o qual é de 2,6% (w / v)) para a almofada. Transferir 1-10 vermes adultos limpas na gota com uma picareta worm. Selo com 18x18 mm e tampa de vidro de vaselina como explicado no ProtOCOL 1.

Microscopia 3. Time-lapse

  1. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina de microscópio ou o sanduíche tampa de vidro. Use campo claro a baixa ampliação (5x ou 10x lentes) para localizar a amostra.
    NOTA: Limite a exposição à luz azul, tanto quanto possível (em especial para C. elegans embriões), por exemplo, não use microscopia de epi-fluorescência para encontrar / concentrar a amostra, mas usar brightfield vez.
  2. Mude a maior ampliação (40x ou 60x objetivos), levar a amostra em foco (ou plano central ou planos superiores / inferiores da amostra, dependendo do software de aquisição).
  3. Defina os intervalos de amostragem para 30 aviões no 1 um espaçamento registrados a cada 1min. No caso de um palco xyz XY ou automatizada está disponível, vários pontos podem ser gravados em uma única sessão. Mudar para imagens de fluorescência e verifique o foco novamente.
    NOTA: Tente evitar o uso poderes alta de laser, em vez usar um pouco mais longos tempos de exposiçãoa muito baixas intensidades. Medida imagens adquiridas de imediato, quer no programa de aquisição de imagem ou em ImageJ para evitar a saturação, que corta a dinâmica variam e também significa a exposição à radiação excessiva.
  4. Comece a gravar a série de lapso de tempo.
    NOTA: Para excluir análise de artefatos, comece com intervalos longos (3-10 min) Tempo entre a digitalização de amostra e aumentar gradualmente a amostragem temporal para os intervalos adequados. Tempo de desenvolvimento, bem como os pontos finais em ambos os casos deve ser semelhante ao realizar uma análise estatística. Além disso, é muitas vezes necessário para avaliar as taxas de sobrevivência e fototoxicidade. Portanto, recuperar espécime da montada após a microscopia de lapso de tempo a longo prazo e verificar se eles continuam a desenvolver / live.

4. Reconstruir um modelo celular Forma 3D com IMOD

NOTA: O software IMOD está disponível a partir da página web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. A instalação do software é descreverd lá. Quando utilizar o Windows OS, um conjunto de ferramentas Unix tem de ser instalado, que também pode ser encontrado como um pacote na página IMOD. Além disso, há uma introdução 3dmod excelentemente compilado disponível na página IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).

  1. Abra o shell do Unix e digite "imod". A janela IMOD será aberta. Selecione o arquivo com os dados brutos (idealmente um tif empilhados ou semelhantes), de que para gerar um modelo 3D.
  2. Localize a parte inferior e superior dos objetos na janela de Zap usando a janela de informações (up & down ferramenta de rolagem).
  3. Comece traçando os contornos celulares. Importante, garantir que cada célula é um objeto. Comece com o plano superior de cada célula e criar o primeiro contorno lá usando a janela de informações. Role para baixo na z e criar um novo contorno para cada plano z.
  4. Faça o mesmo para o maior número de células conforme necessário para modelar em 3D. Não se esqueça de criar um novo objeto ao iniciar com uma nova célula.
    NOTA: Há muitas maneiras diferentes para o rastreamento de contorno e vários plugins votos. Por favor, visite o site IMOD e tutoriais on-line para obter detalhes. No caso mostrado, a configuração padrão foi usado.
  5. Abra o "Model View" janela para inspecionar os objetos e seus contornos.
  6. No "Model View" da barra de ferramentas escolher "Editar" - "Objetos". A janela de edição respectivo será aberta.
  7. Para modelar células como objectos cheios e fechados, escolha "malha" como "Desenhar tipo de dados" e "Fill" como "estilo do desenho". Clique em "engrenagens" na seleção de rolagem no canto inferior esquerdo da janela. Marque a opção "Cap" na seleção no canto inferior direito. Confira como muitos objetos, conforme necessário e clique em "Malha All". O programa irá gerar objetos sólidos das pilhas de contornos. O factor z-amostragem pode ser ajustado mudando "Z-escala" na janela "Ver".
  8. Move / girar o objec 3Dt ("Edit" - "Ver") e salvar instantâneos ou filmes ("File" - "Pressão Tiff como ..." ou "Movie / Montagem").

5. Rastreamento fluorescente Estruturas rotuladas com Endrov

NOTA: De modo a rastrear restos de divisão celular, utilizar uma estirpe com um marcador de membrana nuclear ou plasma para a identificação de células (por exemplo, H2B, Ph-PLC-d1) e um marcador remanescente divisão celular (por exemplo, NMy-2, ZEN-4 ). O marcador nuclear ou de membrana de plasma é importante para determinar qual célula herda o remanescente a divisão celular.

  1. Para o carregamento rápido e facilidade de utilização, os dados em bruto tem que ser convertido para um ficheiro TIFF (por exemplo, em ImageJ). Em seguida, abra Endrov e carregar o arquivo a ser analisado, escolhendo a opção "Carregar arquivo" no menu arquivo. Clique no ícone "visualizador 2D" na barra de ferramentas.
  2. Ajuste do histograma, clicando no ícone "gama Fit" (o ícone azul no canto inferior direitoda tela Endrov). Defina a resolução XYZ, indo para "Data" - "filename" - "ImageSet" - "Channel" - "Definir XYZ-resolução". Tipo de valores para X, Y, e Z, por exemplo, 5, 5, 1 se resolução X e Y é de 0,2 uM e 1 uM cada amostra em Z.
  3. Para anotar os núcleos, passar para o plano de interesse e clique em "Visualizador 2D". Selecione "Lineage" no menu suspenso e escolha "New linhagem".
  4. Clicando e arrastando no núcleo, que pode ser marcado. Para nomear o núcleo, clique com botão direito e escolha "Renomear partícula" no menu suspenso. Para aumentar ou diminuir o diâmetro do círculo, arraste o ícone de seta que aparece no lado esquerdo do círculo marcado. Para marcar o plano central do núcleo, clique no ícone à direita. Quando se utiliza um marcador de membrana plasmática, uma grande esfera pode ser desenhada que vai cobrir a maior parte da célula.
  5. Para continuar no tempo e no avião, escolher o "Frame" e "Z"opções na barra de ferramentas inferior. Depois de passar para o próximo ponto de tempo, ajustar a posição ou o tamanho do círculo que marca o núcleo em conformidade. Repita este procedimento até a célula se divide rastreados.
  6. Quando há uma divisão celular, marque os núcleos filhos e mudar para "viewer Lineage". Isso pode ser selecionado clicando no ícone "Windows" na barra de ferramentas superior. Marcar todos os três núcleos simultaneamente, ir até a opção "Lineage" na barra de ferramentas superior e selecione "pai Associado".
  7. Quando o rastreamento de pilha for concluído, mude para a marcação do remanescente divisão celular para rastreamento de canal. Para mudar de canal, clique no nome do arquivo no canto inferior esquerdo da barra de ferramentas. O remanescente da divisão celular (ou qualquer outra estrutura) pode ser controlada como acima descrito para o núcleo.
  8. Ao retornar para o software depois de fechar, é necessário ir a "2D Viewer" - "Lineage" - "Editar" e clique sobre o número linhagem que será editada.

6. Analisando Cortical actomiosina fluxo com PIVlab

NOTA: PIVlab é um software disponível gratuitamente a partir de: http://pivlab.blogspot.de/; ele pode ser chamado de dentro do ambiente de linha de comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Ao trabalhar com PIVlab, recomenda-se para salvar a série de imagens em uma pasta separada.

  1. Inicie uma nova sessão do menu "Arquivo". Coloque os arquivos de imagem clicando no botão "Carregar imagens".
  2. Selecione o estilo de seqüenciamento 1-2, 2-3, ... e navegue até o diretório que contém a sequência de imagens desejadas. Selecione as imagens e clique no botão "Adicionar" e importação.
  3. Vá em "configurações de Análises" e selecione "Exclusões (ROI), Máscara". Como alternativa, pressione "Ctrl + E". Use o botão "Empate máscara (s) para o quadro atual" para inativar a parte indesejada da imagem / s (ou seja, fora da área do embrião).
  4. Selecione "Configurações PIV" from o menu "configurações Análises". Como alternativa, pressione "Ctrl + S". Escolha "FFT janela deformação", como o algoritmo PIV desejado.
    NOTA: transformação de Fourier rápida (FFT) reduz o custo computacional, mas é recomendado apenas o sinal é bem acima do ruído e se o deslocamento das partículas estudadas não excede metade da área de passagem analisado (ver 6.5).
  5. Entre os seguintes valores para as três passagens, que são a área de interrogação para a correlação cruzada entre a intensidade de imagens subsequentes: Passe 1: Interrogação área de 64 pixels, com uma fase de passagem 32. 2: Interrogação área de 32 elementos de imagem com um passo de 16 . Selecione "linear" da deformação Janela menu suspenso. Escolha forma de 2 * 3 pontos Gaussian para sub-pixel estimativa deslocamento.
  6. Selecione "Analisar!" a partir do menu Análise e use o botão "Analisar todos os quadros" para começar uma análise.
  7. Para o processamento pós selecione "Vector validação" de "; Menu de Pós-processamento "e definir o limite de filtro de desvio padrão (Stdev) a 7 e se aplicam a todos os quadros.
  8. Escolha "derive parâmetros / modificar dados" do menu "Plot". Selecione "Vectors [px / frame]" do menu suspenso. Ajuste a suavidade de vetores e filtro passa alta e se aplicam a todos os quadros.
  9. Para calcular vetores médios de todos os quadros, definir os quadros "usado" para 1: final e clique no botão "Calcular vetores médios".

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Resultados

Usando protocolos 2, 3, e 4, com intervalo de tempo de imagem das gônadas em selvagem tipo C. elegans adultos é realizada (OD58 estirpe (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), expressando um marcador de membrana a partir de um promotor da linha germinal ). Centrando-se no turno da gônada, um modelo 3D das células germinativas é gerada a partir dos dados de microscopia (Figura 2). Este modelo permite analisar alterações no tamanho da célula, enquanto o ...

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Discussão

Através de rastreamento em desenvolvimento objecto, em particular de seguimento nuclear, tem sido possível para elucidar os mecanismos centrais de padronização de C. elegans embriogênese 1,23,24. Expandindo essa estratégia para um maior rendimento, tem sido recentemente possível descobrir regras de padronização adicionais e propor um método para deduzir como padronização regras de novo 10. Para muitos mutantes, no entanto, os defeitos de padrões precisos ainda são desconh...

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Divulgações

A pesquisa no laboratório da CP é financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; PARA 1756) e o LOEWE Research Cluster Ubiquitin Networks. A PC é ainda apoiada pelo 7.º Programa-Quadro da União Europeia (Projeto de Ações Marie Curie 326632).

Agradecimentos

Os autores não têm nada a divulgar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio estéreoMotic/VWROT4005SMicroscópio estéreo para dissecação e montagem
de microesferas de poliestireno Polybead, Polysciences18329Montagem de embriões
20 µ m
Microesferas de Poliestireno Polibead, Polysciences876Montagem de animais adultos
0.1 µ m
Lâminas de microscópioVWR631-0902Montagem de animais adultos
Vidro de cobertura 18x18 mmVWR631-1331Montagem embrião/adulto
Vidro de cobertura 24x60 mmVWR631-1339Bisturi de montagem de embriões
VWR233-5455Dissecção de embriões
Tubo de siliconeVWR228-1501Tubo para pipeta bucal
30 mm Filtro de membrana PTFENeoLabJul-01Filtro para pipeta bucal
Tubos capilaresVWR621-0003Ponta de pipeta para pipeta bucal
VaselinaRothE746.1Montagem embrião/adulto
Ágar Roth5210.5Montagem de animais adultos
Potássio-di-hidrogenofosfatoRothP018.2Tampão M9
Di-hidrogenofosfato de sódioRothP030.2Tampão M9
Cloreto de sódioRoth3957.1Tampão M9
Sistema confocal de disco giratório VisiScopeSistemas de visitan/aMicroscopia confocal

Referências

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