Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em C. elegans Como usar as ferramentas de código aberto

Summary

Aqui é mostrado como rastrear e quantificar os processos de desenvolvimento em C. elegans. Os métodos apresentados são baseados em ferramentas de código aberto que podem ser facilmente implementadas. É demonstrado como reconstruir modelos 3D de forma celular, como rastrear manualmente estruturas subcelulares e como analisar o fluxo contrátil cortical.

Abstract

Quantitativamente capturar processos de desenvolvimento é crucial para derivar modelos mecanicistas e chave para identificar e descrever os fenótipos mutantes. Aqui são apresentados os protocolos para a preparação de embriões e adultos C. elegans animais para microscopia de lapso de tempo curto e longo prazo e métodos de rastreamento e quantificação dos processos de desenvolvimento. Os métodos apresentados são todos baseados em C. cepas elegans disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis e no software de código aberto que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório independentemente do sistema de microscopia usado. A reconstrução de um modelo de célula-forma 3D usando o IMOD software de modelagem, o rastreamento manual de estruturas subcelulares fluorescente-etiquetados usando o multi-purpose programa de análise de imagem Endrov, e uma análise de fluxo contrátil cortical usando PIVlab (resolvida no tempo Velocimetry Digital Imagem de Partículas Ferramenta para MATLAB) são mostrados. Discute-se como esses métodos também podem ser implantados to quantitativamente capturar outros processos de desenvolvimento em diferentes modelos, por exemplo, rastreamento de linhagem celular e rastreamento, monitoramento do fluxo de vesícula.

Introduction

Com as melhorias estáveis ​​de proteínas fluorescentes, engenharia de genoma, microscopia de luz, e soft e hardware de computador, agora é possível gravar desenvolvimento de muitos organismos modelo em sem precedentes resolução espácio-temporal. Isto permite aos investigadores fazer perguntas que não podem ser abordados anteriormente ou revisitar processos de desenvolvimento conhecidas, a fim de procurar os aspectos negligenciados. Este progresso tem suscitado o campo da biologia do desenvolvimento quantitativo, que visa transformar qualitativos, modelos informais em modelos quantitativos por meio de medições exaustivas e análises estatísticas.

Protocol

1. Preparação de C. elegans embriões para Lapso de tempo Microscopia usando Microbeads

1. Transferência de vermes adultos grávidas usando uma picareta verme (fio de platina) em uma gota de tampão M9 e limpar as bactérias pela primeira vigorosamente agitando e, em seguida, transferindo cada worm para uma queda adjacente de M9 usando um chicote do olho montada em uma picareta do dente / ponteira ou use um capilar de vidro aguçado.
2. Dilui-se a dispersão contendo as 20 uM esferas de poliestireno diâmetro de 10-vezes em tampão M9 (1 tampão G M9 contém 3 g _de KH 2 PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de....

Results

Usando protocolos 2, 3, e 4, com intervalo de tempo de imagem das gônadas em selvagem tipo C. elegans adultos é realizada (OD58 estirpe (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), expressando um marcador de membrana a partir de um promotor da linha germinal ). Centrando-se no turno da gônada, um modelo 3D das células germinativas é gerada a partir dos dados de microscopia (Figura 2). Este modelo permite analisar alterações no tamanho da célula, enquanto o .......

Discussion

Através de rastreamento em desenvolvimento objecto, em particular de seguimento nuclear, tem sido possível para elucidar os mecanismos centrais de padronização de C. elegans embriogênese ^1,23,24. Expandindo essa estratégia para um maior rendimento, tem sido recentemente possível descobrir regras de padronização adicionais e propor um método para deduzir como padronização regras de novo ^10. Para muitos mutantes, no entanto, os defeitos de padrões precisos ainda são desconh.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio estéreo	Motic/VWR	OT4005S	Microscópio estéreo para dissecação e montagem
de microesferas de poliestireno Polybead,	Polysciences	18329	Montagem de embriões
20 µ m
Microesferas de Poliestireno Polibead,	Polysciences	876	Montagem de animais adultos
0.1 µ m
Lâminas de microscópio	VWR	631-0902	Montagem de animais adultos
Vidro de cobertura 18x18 mm	VWR	631-1331	Montagem embrião/adulto
Vidro de cobertura 24x60 mm	VWR	631-1339	Bisturi de montagem de embriões
	VWR	233-5455	Dissecção de embriões
Tubo de silicone	VWR	228-1501	Tubo para pipeta bucal
30 mm Filtro de membrana PTFE	NeoLab	Jul-01	Filtro para pipeta bucal
Tubos capilares	VWR	621-0003	Ponta de pipeta para pipeta bucal
Vaselina	Roth	E746.1	Montagem embrião/adulto
	Ágar Roth	5210.5	Montagem de animais adultos
Potássio-di-hidrogenofosfato	Roth	P018.2	Tampão M9
Di-hidrogenofosfato de sódio	Roth	P030.2	Tampão M9
Cloreto de sódio	Roth	3957.1	Tampão M9
Sistema confocal de disco giratório VisiScope	Sistemas de visita	n/a	Microscopia confocal