Artigo de método

Coleta de Leite no Rato Usando Capilar Tubos e Estimativa da gordura do leite por conteúdo crematócrito

DOI:

10.3791/53476

⸱

16 de dezembro de 2015

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Faculty of Kinesiology, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

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O leite é a principal fonte de nutrição para o recém-nascido. A análise dos componentes do leite pode fornecer informações sobre os fatores maternos que afetam a saúde da prole. Este protocolo descreve um método manual de coleta de amostras de leite do rato em lactação, que pode ser usado para análises posteriores a jusante.

Resumo

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O leite, como única fonte de nutrição para o mamífero recém-nascido, fornece os nutrientes e a energia necessários para o crescimento e desenvolvimento da prole. Ele também contém um grande número de compostos bioativos que afetam muito o desenvolvimento do recém-nascido. A análise dos componentes do leite ajudará a elucidar os principais fatores que ligam o metabolismo e a saúde materna ao crescimento e desenvolvimento da prole. O rato de laboratório representa um organismo modelo popular para estudos maternos, e o leite de rato pode ser usado para examinar o efeito de várias intervenções fisiológicas, nutricionais e farmacológicas maternas nos componentes do leite, o que pode afetar a saúde da prole. Aqui, é descrito um método simples de coleta manual de leite do rato em lactação, que pode ser realizado por um único investigador, não requer equipamento especializado de vácuo ou sucção e fornece leite suficiente para análise subsequente a jusante. Um método para estimar o teor de gordura do leite medindo a porcentagem de creme dentro da amostra de leite, conhecido como crematócrito, também é apresentado. Esses métodos podem ser usados para aumentar a percepção da saúde materno-infantil e elucidar os fatores maternos envolvidos no crescimento e desenvolvimento adequados da prole.

Introdução

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O leite é a única fonte de nutrição para mamíferos recém-nascidos, fornecendo energia e nutrientes para o crescimento e desenvolvimento infantil 1,2. Quando o leite é constituído principalmente por células, lípidos e proteína 1, que também contém uma pletora de compostos bioactivos que modulam o desenvolvimento vida precoce da descendência, incluindo enzimas, hidratos de carbono, hormonas, anticorpos, factores de crescimento, citocinas, exossomas, microvesículas, e pequenos RNAs tais como microARN 1,2. O papel fundamental do leite materno na criação da prole imunitário e saúde intestinal 3, juntamente com evidências de que crianças amamentadas são menos suscetíveis à doença 2, destaca a importância de identificar os constituintes do leite associados a processos de doenças no início da vida e os mecanismos moleculares envolvidos em suas ações. O rato é o desenvolvimento de um modelo popular para investigar o efeito de vários nutricional, fisiológico e intervenções químicas no iníciodesenvolvimento -life 4. A análise do leite do rato podem, portanto, proporcionar novos insights sobre a saúde materna e prole.

Avanços científicos atuais fornecem agora aumentar as oportunidades para investigações aprofundadas sobre os efeitos de constituintes do leite específicos na saúde e na doença. Por exemplo, a sequenciação de leite perfis bacterianas elucidou o seu papel na colonização intestinal precoce do intestino infantil 5, análise de espectrometria de massa de oligossacarídeos do leite forneceram uma visão sobre a alteração dos perfis de oligossacarídeos do leite via dieta materna 6 e profunda seqüenciamento de microRNA secretada em os glóbulos de gordura do leite materno destaca possíveis papéis na transcrição do gene, o metabolismo e a função imunológica 7.

Modelos de ratos representam um dos organismos modelo mais populares usados ​​em estudos materno 8,9. Uma vantagem é seus períodos de gestação e aleitamento curtas, durando apenas approximatEly 21 dias cada; Por conseguinte, o tempo total a partir do início da gravidez até lactação representa um curto período de tempo em que os dados valiosos podem ser gerados. Quanto maior o tamanho de ratos em comparação com os ratinhos, no contexto de recolha do leite, pode proporcionar uma vantagem significativa no que diz respeito ao volume de leite e facilidade de recolha do leite; produção de leite no rato, por exemplo, parece ser dependente do peso corporal total com os ratos mais pesados ​​que produzem mais leite 10.

Aqui, uma descrição geral para a coleta manual de leite de ratas lactantes é fornecido. Este protocolo requer um equipamento mínimo, é não-invasiva e de baixo custo, e podem ser usadas para recolher os volumes adequados de leite para análises adicionais a jusante. Em breve, a barragem é anestesiados com isoflurano, a descida do leite é estimulada pela oxitocina, e de leite são recolhidas em tubos capilares por meio de extracção manual do leite. Finalmente, como dois principais componentes de leite são proteínas e gordura, uma breve description de estimar o teor de gordura do leite por meio de medidas crematócrito 11 e quantificação da concentração total de proteínas usando um ensaio de proteína padrão é apresentada.

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Protocolo

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Este protocolo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Calgary Animal Care e conformado com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Dam Separe Offspring

  1. Separa-se a barragem de sua prole para um mínimo de 5 min antes da ordenha 12.
    NOTA: A represa pode ser ordenhadas até 5-6 horas após a separação 1,6,13, no entanto períodos de separação mais do que 4 horas podem alterar a composição do leite 14. Enquanto tempo de separação não parece afetar coleção volume de leite 12, é aconselhável que um tempo de separação consistentes ser mantida durante todo o estudo. A composição do leite pode mudar ao longo da lactação 15, portanto, devem ser feitas tentativas para manter o dia da coleta de leite consistente. Máxima produção de leite é sugerida para ocorrer no dia 14 de lactação 12.
  2. Usando uma câmara de aquecimento, garantir os filhotes são capazes de manter temperatu do corpo adequadare sem a presença da mãe durante a duração do procedimento de ordenha.
    NOTA: No estudo apresentado a seguir, ordenha foi realizada ao desmame, quando as barragens eram aproximadamente 22 semanas de idade e The Offspring 21 dias de idade, portanto, nenhuma câmara de aquecimento foi utilizado.

2. Set-up e Preparação

  1. Colete todos os materiais necessários para o procedimento de ordenha.
    NOTA: Todos os materiais pode ser encontrada na tabela de materiais e equipamento.
  2. Coloque uma almofada de aquecimento no banco onde a ordenha terá lugar e cobrir a almofada com um banco absorvente sob-pad.
  3. Configure o sistema anestésico. Assegure-se que o sistema tem de oxigénio e isoflurano antes do início suficiente. Fixar o anestésico máscara que irá ser utilizada para a indução da anestesia inicial para a máquina. Coloque a máscara que irá ser utilizado para a manutenção da anestesia nas proximidades se for diferente do que a máscara de anestesia inicial.
  4. Coloque uma agulha 25 G para uma seringa de 1 ml para ocitocinainjecção utilizando uma técnica asséptica.
  5. Ligue a almofada de aquecimento para que a temperatura do corpo materno é mantida durante o processo de ordenha. NOTA: Monitorar a temperatura da almofada de aquecimento para assegurar a almofada não se torna muito quente e causar queimaduras. Em alternativa, usar uma fonte de calor, tal como uma mesa de operações aquecida, que pode ser ajustado para uma temperatura específica.

3. anestesiar o Dam Usando Isoflurane

  1. Abra o tanque de oxigênio e virar o fluxo de 1 L (1000 cc) por min. Ligue o fluxo de isoflurano e ajustado para 5%. CUIDADO: Evite inalação direta de anestésico e evitar a acumulação de vapores anestésicos.
  2. Anestesiar a barragem.
  3. Mudar para a máscara de manutenção, se necessário, colocando o supino barragem no banco almofada absorvente. Confirme anesthetization por falta de pedal reflexo.
  4. Reduzir o fluxo de isoflurano a 2-3% para manutenção da anestesia. Monitorar continuamente barragem durante todo o processo para garantir depressão da respiração não ocorre. NOTA: Uma vez sob anestesia, os olhos da represa devem ser protegidos com um lubrificante de olho estéril para evitar que os olhos sequem ou tornar-se riscado.

4. A oxitocina injeção

  1. Garantir a ocitocina (20 USP Unidades / ml) não passou da data de validade. Desinfetar o frasco de ocitocina com um álcool estéril limpar / álcool de limpeza pad.
  2. Utilizando uma técnica asséptica, elaborar 2 UI (0,1 ml) de ocitocina para a seringa. Utilize uma nova agulha e seringa para cada barragem que vai ser ordenhadas.
    NOTA: A oxitocina doses variam geralmente de injecções individuais de 1 a 5 IU 1,6,12,16. Alternativamente, uma dose de 4 UI / kg de peso corporal pode ser utilizado 12. Uma dose única de 2 Ul pode ser repetida uma vez, se a ordenha for encontrada dificuldade.
  3. Injectar a oxitocina por via intraperitoneal. Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen com a agulha apontando para a cabeça, em um ângulode 15-30 °, cerca de 0,5 cm de profundidade.
  4. Puxe o êmbolo para garantir pressão negativa antes da injeção. Se qualquer líquido (sangue, urina, conteúdo intestinal, etc.) é aspirada para a seringa, a agulha e remover tentar a injecção com uma agulha e seringa. Se nenhum fluido é aspirado injetar a oxitocina e descarte a agulha e seringa imediatamente em um recipiente de risco biológico.
  5. Aguarde cerca de 5-15 min para a ocitocina para estimular a descida do leite.

5. Preparação de Sites de ordenha

  1. Escolha os sites / tetos de leite serão coletadas. O leite pode ser recolhida a partir de qualquer tetina 12.
  2. Remova suavemente a pele ao redor dos tetos de ser ordenhadas com os trimmers, como a pele pode causar dificuldade na coleta de amostra devido à absorção da do leite. Seja gentil - a pele ao redor dos bicos é extremamente sensível e pode ser seca e, como tal, é suscetível a arranhões e lágrimas.
  3. Esterilização do i tetinaNão é necessário, mas opcionalmente, limpar a tetina com água morna após a pele é removida. Preparar pelo menos dois locais como mais do que um sítio possa ser necessária para a recolha de leite.
    NOTA: Se a análise do leite inclui perfis de microbiana, a área de tetina pode exigir a esterilização com iodo 5.

Coleção 6. Leite

  1. Espremer suavemente a base da teta, expulsando o leite manualmente para recolha.
    NOTA: Se a análise do leite inclui perfis de microbiana, as primeiras gotas de leite devem ser descartados.
  2. Recolher as gotas de leite para um tubo capilar, o enchimento do tubo capilar. Tubos capilares, que podem acomodar volumes maiores (por exemplo, 50 ul) facilitar o processo.
    NOTA: Se houver dificuldade na coleta de leite é encontrado, uma segunda dose de oxitocina pode ser administrado. Recomenda-se a dose não deve exceder 4 IU total.
  3. Repartir o leite a partir do tubo capilar para um tubo de microcentrífuga esterilizadotocar a extremidade do tubo que foi utilizado para desenhar a partir do leite da teta para o lado do tubo de microcentrífuga - observar o leite a ser desenhada para fora do tubo capilar por meio de acção capilar.
    NOTA: 'funda para fora "do leite que não é puxado para dentro do tubo, usando uma agulha de 18 G ligada a uma seringa de 1 ml.
  4. Monitorar continuamente a barragem para sinais de dor ou depressão respiratória e ajustar o fluxo de isoflurano em conformidade.
  5. Continuar a recolher o leite como descrito nesta seção até que o leite suficiente tiver sido coletado para a análise de leite escolhido. Para a determinação da concentração de proteína e crematócrito descrito abaixo, recolher 0,25 ml de leite.
    NOTA: Use um local de ordenha diferente se a descida do leite diminui ou o local escolhido não expulsar leite suficiente. Um máximo de cerca de 2,5 ml de leite por animais pode ser recolhida 17, ou até 0,5 ml por tetina. Os autores recomendam que o tempo total sob anestesia ser limitado a aproximadamente 45-60 min, oR 45 min de ordenha.
  6. Recolha do leite para um tubo de micro-hematócrito para medição crematócrito a partir de amostras de leite fresco, e vedar a extremidade do tubo com vedante argila. Rotular o tubo de microhematócrito com o ID barragem e armazenar a amostra de leite na posição vertical.
  7. Quando a ordenha é completa, desligue o fluxo de isoflurano e oxigênio. Retire a máscara da barragem e continuará a acompanhar barragem até acordado. Recomenda-se que se não totalmente consciente, a barragem deve ser colocada sobre uma almofada absorvente banco durante o período de recuperação, ao invés de diretamente na cama gaiola, para evitar que a roupa de cama de ser aspirado ou coçar os olhos da represa durante a recuperação.
    NOTA: Não deixe a barragem autônoma até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter recumbancy esternal.
  8. Se não forem necessárias análises adicionais, congelar o leite à temperatura de -80 ° C. Outros têm sugerido que o leite possa ser armazenado durante até 3 horas a 4 ° C ou 5 meses a -20 ° C 18.

7. Medição crematócrito

  1. Estimar o teor de gordura do leite por meio do cálculo do crematócrito leite (a percentagem de creme na amostra de leite) 19.
    NOTA: As medições com leite humano demonstraram que o leite fresco ou congelado pode ser utilizado para uma medição crematócrito, no entanto leite fresco é mais altamente correlacionados (r = 0,92 versus R = 0,90) com a concentração lipídica 11. O uso de leite fresco ou congelado para medições crematócrito deve ser mantido consistente em todo o estudo, como o leite descongelado está associado a uma pequena diminuição no crematócrito valores 11.
  2. Para o leite fresco, recolher uma amostra de leite da teta em um tubo de microhematócrito; preencher pelo menos ¾ cheio (cerca de 15-20 mL). Alternativamente, extrair leite fresco a partir da amostra recolhida para dentro do tubo capilar depois de misturar bem. Selar o fim com selante de barro.
  3. Colocar o tubo capilar para hematócrito da fieira, com aextremidade vedada apontando para o exterior, garantindo a centrífuga é equilibrada.
  4. Comece o spin hematócrito (120 segundos a 13.700 xg).
    NOTA: O tempo da rotação ou velocidade pode mudar, dependendo do modelo de centrífuga utilizada.
  5. Remover o tubo da centrifugadora depois da rotação é completo e realizar as medições para calcular o crematócrito. Observar separação da amostra numa camada de creme e uma camada clara.
  6. Medir e registar o comprimento total de fluido no tubo e o comprimento da gordura (creme) camada usando compassos de calibre ou uma régua.
    NOTA: O crematócrito é expressa como a percentagem da camada de creme na amostra de leite a 19, calculada como (comprimento da camada de nata / comprimento total da coluna de leite) x 100 (Figura 1A). Calcular os valores de concentração e de energia a partir da medição de gordura crematócrito como se segue: concentração de gordura (g / L) = (crematócrito (%) - 0,59) /0.146 (Figura 1B) 19; Valor energético (kcai / L) = 290 + (* crematócrito 66,8 (%) (Figura 1C) 19.

8. Proteína Concentração Determinação

  1. Utilizando albumina de soro bovino como padrão de proteína, determinar a concentração total de proteína do leite, utilizando um ensaio de proteína padrão, tal como ensaio de proteínas de Lowry um 6.
    NOTA: A diluição do leite pode ser necessária para as medições de proteínas de leite a cair dentro da curva padrão do ensaio.

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Resultados

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O leite foi recolhido como descrito no desmame de fêmeas Wistar (cerca de 22 semanas de idade, pesando 350 a 400 g) que consumiram um controlo (AIN-93G, n = 5), elevado teor de proteínas (40% de caseína p / p, n = 5) , ou alta fibra pré-biótica (21,6% p / p, 1: 1 razão de oligofrutose e inulina, n = 4) dieta durante a gravidez e lactação. A dose de oxitocina foi de 2 UI. O leite foi recolhido utilizando tubos capilares, e um tubo foi centrifugado usando um spinner hematócrito para determinar crematócrito (Figura...

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Discussão

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As investigações sobre os componentes do leite materno aumentaram à medida que aumenta o interesse na pesquisa de desenvolvimento no início da vida. Como única fonte de nutrição durante o período neonatal, os compostos bioativos do leite são essenciais para o crescimento e desenvolvimento ideais, especialmente no contexto da saúde intestinal e imunológica3. O método apresentado aqui é um método simples e não invasivo de coleta de leite do rato lactante em quantidades suficientes para análise a jusante, como o ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com os protocolos do CCAC aprovado.

Agradecimentos

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Isso funciona foi apoiada através de subsídios da Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN 238382-2011) e Canadian Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul foi apoiada por uma Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia de Bolsas de Pós-graduação e uma bolsa Alberta inova Health Solutions. Megan Hallam foi apoiado por uma bolsa de estudos em Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa de Pós-Graduação, um Scholarship Frederick Banting e Charles Best Canadá graduação, e Prêmio de Crianças Alberta Hospital Research Institute Formação em Genética, Desenvolvimento Infantil e Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipment - Ordenha
Seringas de 1 mlBD-Canada309602
agulhas de 25 GBD-Canada305122
agulhas de 18 GBD-Canada305196
50 μ l Tubos capilares microdispensadoresFisher Scientific21-169D
Ocitocina (20 unidades USP/ml)Bimeda-MTC1OXY015
PPC Vet Isoflurano Anestésico para inalação, 250 mlFresenius KabiM60302Usado por ordem de um veterinário Almofada de
preparação de álcool estérilDukal853
Almofada de bancada absorventeVWR82020-845
Manta Maxi-Therm Hyper/HypothermiaCincinnati Sub-Zero274
Máquina de Anestesia para Roedores com VaporizadorBenson Medical Industries Inc.Sujeito às necessidades individuais do laboratório
Máscaras de animaisBenson Medical Industries Inc.50100/50102
Tubos de MicrocentrífugaAxygenMCT-060-C
ChroMini Aparador ProfissionalWahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Tubos de Microhematócrito de Plástico (Não Tratado)Fisher Scientific22-274-914
Critoseal Bandeja de selante de tubo capilarVWR470161-478
Centrífuga de microhematócrito StatSpinCritSpin Beckman Coulter, IncX00-004999-001

Referências

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