Introduction
חלב הוא המקור היחיד לתזונה ליונקים יילוד, לספק אנרגיה וחומרים מזינים לצמיחת תינוק ו1,2 פיתוח. בעוד חלב מורכב בעיקר של תאים, שומנים, וחלבונים 1, הוא מכיל גם שפע של תרכובות ביו לווסת פיתוח חייו המוקדם של צאצאים כוללים אנזימים, פחמימות, הורמונים, נוגדנים, גורמי גדילה, ציטוקינים, exosomes, microvesicles, וRNA הקטן כזה כמייקרו-רנ"א 1,2. התפקיד הבסיסי של חלב אימהי בהקמת צאצאים חיסוניים ובריאות מעיים 3, יחד עם ראיות לכך שהנקת תינוקות הם פחות רגישים למחלה 2, מדגיש את החשיבות של זיהוי מרכיבי חלב הקשורים לתהליכי מחלה בתחילת החיים והמנגנונים המולקולריים מעורבים במעשיהם. עכברוש הפיתוח הוא מודל פופולרי לחקירת ההשפעה של תזונה שונות, פיסיולוגי, והתערבויות כימיות בתחילהפיתוח'החיים 4. הניתוח של חלב חולדה לכן עשוי לספק תובנות רומן לבריאות האם וצאצאים.
התקדמות מדעית נוכחית כעת לספק הגדלת הזדמנויות לחקירות מעמיקות של ההשפעות של מרכיבי חלב ספציפיים על בריאות ומחלה. לדוגמא, רצף של פרופילי חיידקי החלב הובהר תפקידם בהתישבות במעי המוקדמת של מעי התינוק 5, ניתוח ספקטרומטר מסה של אוליגוסכרידים חלב סיפק תובנה השינוי של פרופילי oligosaccharide חלב באמצעות דיאטה אימהית 6, ורצף עמוק של microRNA מופרש ב כדוריות השומן של חלב מדגישה תפקידים אפשריים בשעתוק הגנים, חילוף חומרים, ואת תפקוד מערכת חיסון 7.
מודלים של עכברים מייצגים את אחד אורגניזמים המודל הפופולריים ביותר בשימוש במחקרים אימהיים 8,9. יתרון אחד הוא תקופות קצרות שלהם להריון והנקה, שנמשכות רק approximatאיליי 21 ימים כל אחד; לכן הזמן הכולל מתחילת ההריון להנקה מייצג פרק זמן קצר שבו יכולים להיות שנוצרו נתונים יקרי ערך. הגודל הגדול יותר של חולדות בהשוואה לעכברים, בהקשר של אוסף חלב, עשוי לספק יתרון משמעותי ביחס להיקף של חלב וקלות אוסף חלב; ייצור חלב בעכבר למשל נראה,, להיות תלוי במשקל גוף כולל עם עכברים כבדים לייצר יותר חלב 10.
כאן, תיאור כללי לאיסוף הידני של חלב מחולדות מניקות מסופק. פרוטוקול זה דורש ציוד מינימאלי, אינו פולשני, זול, וניתן להשתמש בם כדי לאסוף כמויות מספיקות של חלב לניתוחים נוספים במורד הזרם. בקיצור, הסכר הוא הרדים עם isoflurane, אכזבת חלב היא מגורה על ידי אוקסיטוצין, וחלב נאסף לתוך צינורות נימים באמצעות ביטוי ידני של חלב. לבסוף, כשני מרכיבים עיקריים של חלב הם שומן וחלבונים, descriptio קצרn של הערכת תכולת שומן חלב באמצעות מדידות creamatocrit 11 וכימות של ריכוז חלבון כולל באמצעות assay חלבון סטנדרטי מוצג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי האוניברסיטה של ועדת טיפול בבעלי חיים קלגרי ותאם את המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.
1. סכר נפרד מצאצאים
- הפרד את הסכר מצאצאיה למינימום של 5 דקות לפני חליבת 12.
הערה: הסכר ניתן חלב עד 5-6 שעות לאחר הפרדת 1,6,13, לעומת זאת תקופות של הפרדה יותר מ -4 שעות עשויות לשנות הרכב חלב 14. בעוד זמן הפרדה אינו מופיע להשפיע חלב אוסף 12 נפח, מומלץ כי זמן הפרדה עקבי יישמר לאורך כל תקופת המחקר. הרכב חלב עשוי להשתנות בכל הנקה 15, לכן ניסיונות צריכים להיעשות כדי לשמור על היום של חלב אוסף עקבי. ייצור חלב מרבי הוא הציע להתרחש ביום ההנקה 14 12. - שימוש בתא התחממות, להבטיח את הגורים הם מסוגלים לשמור על טמפרטורות גוף נכוניםמחדש ללא הנוכחות של האמא שלהם למשך הליך החליבה.
הערה: במחקר שיוצג להלן, חליבה בוצעה בגמילה, כאשר הסכרים היו כ 22 שבועות ישנים וישנים 21 ימי הצאצאים, ולכן אין תא התחממות היה בשימוש.
2. הגדרה והכנה
- לאסוף את כל החומרים הנדרשים להליך החליבה.
הערה: ניתן למצוא את כל החומרים בטבלת החומרים וציוד. - הנח כרית חימום על הספסל שבי החליבה תתקיים ולכסות את משטח עם ספסל סופג מתחת לכרית.
- להגדיר את מערכת ההרדמה. ודא שיש במערכת חמצן וisoflurane לפני תחילת מספיק. צרף את מסכת ההרדמה שתשמש לזירוז הרדמה ראשוני למכונה. מניחים את המסכה שתשמש לתחזוקת הרדמה סמוכה אם שונה ממסכת ההרדמה הראשונית.
- צרף מחט 25 G למזרק 1 מיליליטר לאוקסיטוציןהזרקה באמצעות טכניקת aseptic.
- הפעל את כרית החימום כך שטמפרטורת גוף אימהית נשמר במהלך הליך החליבה. הערה: צג הטמפרטורה של כרית החימום על מנת להבטיח את הכרית לא להיות חם מדי ולגרום לכוויות. לחלופין, להשתמש במקור חום, כגון שולחן כירורגית מחומם, שניתן להגדיר טמפרטורה מסוימת.
3. להרדים את Isoflurane שימוש דאם
- פתח את מיכל החמצן ולהפוך את זרימה לL 1 (1,000 סמ"ק) לדקה. הפעל את זרימת isoflurane ולהגדיר עד 5%. זהירות: הימנע משאיפה ישירה של חומר הרדמה ולמנוע הצטברות של אדי חומר הרדמה.
- להרדים את הסכר.
- לעבור למסכת התחזוקה אם נדרש, הצבת הסכר פרקדן על משטח הספסל הסופג. לאשר הרדמה על ידי חוסר רפלקס דוושה.
- להפחית את זרימת isoflurane ל 2-3% עבור תחזוקה של הרדמה. הרף לפקח סכר לאורך ההליך כדי להבטיח דהpression נשימה אינו מתרחש. הערה: לאחר בהרדמה, יש להגן על העיניים של הסכר באמצעות סיכה עין סטרילי כדי למנוע את העיניים מהתייבשות או להיות שרוט.
4. הזרקת אוקסיטוצין
- ודא אוקסיטוצין (20 USP יחידות / מיליליטר) לא עברו תאריך התפוגה שלה. לחטא את הבקבוקון של אוקסיטוצין עם אלכוהול סטרילי לנגב / כרית ניקוי אלכוהול.
- באמצעות טכניקה האספטי, לערוך 2 IU (0.1 מיליליטר) של אוקסיטוצין לתוך המזרק. שימוש במחט ומזרק חדש עבור כל סכר שיהיה חלב.
הערה: מנות אוקסיטוצין בדרך כלל נעות בין זריקות בודדות של 1 עד 5 IU 1,6,12,16. לחלופין, במינון של 4 IU / קילוגרם משקל גוף יכול לשמש 12. מנה אחת של 2 IU ניתן לחזור פעם אחת אם חליבת קושי הוא נתקלה. - הזרק אוקסיטוצין intraperitoneally. הכנס את המחט לתוך רבע הימני התחתון של הבטן עם ההצבעה המחט לכיוון הראש, בזוויתשל 15-30 מעלות, כ -0.5 סנטימטרים עמוקים.
- למשוך בחזרה על הבוכנה על מנת להבטיח לחץ שלילי לפני ההזרקה. אם כל נוזל (דם, שתן, תוכן מעיים, וכו ') הוא להישאף לתוך המזרק, להסיר את המחט ולנסות ההזרקה עם מחט ומזרק חדש. אם אין נוזל להישאף להזריק אוקסיטוצין וזורקים את המחט ומזרק מייד למכל Biohazard.
- המתן כ5-15 דקות לאוקסיטוצין כדי לעורר אכזבת חלב.
5. הכנת חליבת האתרים
- בחר את האתרים / פטמות שממנו חלב ייאסף. חלב יכול להיות שנאסף מכל פטמה 12.
- הוצא בעדינות את הפרווה סביב הפטמות לחליבה עם סתגלן, כפרווה עלולה לגרום לקושי באיסוף דגימה בשל הפתילה של חלב. להיות עדין - העור סביב הפטמות הוא מאוד רגיש ויכול להיות יבש ובתור שכזו הוא רגישה לסריטות ודמעות.
- עיקור שלי הפטמהזה לא הכרחי, אבל אופציונלי, לנקות את הפטמה עם מים פושרים לאחר הפרווה הוסרה. הכן לפחות שני אתרים כמו אתר אחד או יותר עשוי להידרש לאוסף חלב.
הערה: אם ניתוח חלב כולל אפיון חיידקים, אזור הפטמה עשוי לדרוש עיקור עם יוד 5.
אוסף 6. חלב
- יש ללחוץ בעדינות את הבסיס של הפטמה, לגרש את חלב לאוסף באופן ידני.
הערה: אם ניתוח חלב כולל אפיון חיידקים, כמה הטיפות הראשונות של חלב צריך להיות מושלכות. - לאסוף את טיפות חלב לתוך צינור נימים, מילוי צינור הנימים. צינורות נימים שלהכיל כמויות גדולות יותר (לדוגמא, 50 μl) להקל על התהליך.
הערה: אם קושי באיסוף חלב הוא נתקל, מנה שנייה של אוקסיטוצין יכולה להינתן. מומלץ המנה לא תעלה על 4 סך IU. - לוותר חלב מצינור הנימים לתוך צינור microcentrifuge סטרילי על ידילגעת בקצה הצינורית ששימשה לצייר חלב מהפטמה לצד השני של צינור microcentrifuge - לבחון את חלב נמשך אל מחוץ לצינור הנימים באמצעות פעולת נימים.
הערה: "לפוצץ את" חלב שאינו נמשך לתוך הצינור באמצעות מחט 18 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר. - הרף לפקח על הסכר לסימנים של כאב או דיכאון בדרכי הנשימה ולהתאים את זרימת isoflurane בהתאם.
- תמשיך לאסוף חלב כפי שתואר בסעיף זה עד חלב מספיק כבר נאסף לניתוח חלב בחר. לקביעת ריכוז creamatocrit והחלבון שתתואר להלן, לאסוף 0.25 מיליליטר של חלב.
הערה: השתמש באתר חליבה שונה אם אכזבת חלב מאטה או האתר שנבחר לא מגרש חלב מספיק. מרבי של כ 2.5 מיליליטר של חלב לכל בעל חיים יכולים להיות שנאסף 17, או עד 0.5 מיליליטר לפטמה. החוקרים ממליצים שזמן כולל תחת הרדמה להיות מוגבל לכ 45-60 דקות, or 45 דקות של חליבה. - לאסוף חלב לתוך צינור microhematocrit למדידת creamatocrit מדגימות חלב טריים, ולאטום את קצה הצינורית עם איטום חימר. תווית צינור microhematocrit עם זיהוי הסכר ולאחסן את מדגם חלב זקוף.
- כאשר החליבה הושלמה, לכבות את זרימת isoflurane והחמצן. הסר את המסכה מהסכר ותמשיך לעקוב אחר סכר עד ער. מומלץ שאם לא בהכרה מלאה, הסכר צריך להיות ממוקם על משטח ספסל סופג במהלך תקופת ההתאוששות, ולא ישירות על מצעי הכלוב, כדי למנוע את המצעים מלהיות להישאף או מגרדים את עיניו של הסכר במהלך התאוששות.
הערה: אל תשאיר את הסכר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור recumbancy sternal. - אם לא ניתוח נוסף נדרש, להקפיא חלב ב -80 ° C. אחרים טענו כי חלב יכול להיות מאוחסן במשך עד 3 שעות על 4 מעלות צלזיוס או 5 חודשים ב -20 ° C. 18.
7. מדידת Creamatocrit
- להעריך את תכולת השומן בחלב על ידי חישוב creamatocrit חלב (אחוז הקרם במדגם חלב) 19.
הערה: מדידות עם חלב אנושי הוכיחו כי חלב אם טרי או קפוא יכול לשמש למדידת creamatocrit, אולם חלב טרי מתואם גבוה יותר (r = 0.92 לעומת r = 0.90) עם ריכוז שומנים בדם 11. השימוש בחלב טרי או קפוא למדידות creamatocrit צריך להישמר עקבי במחקר, כמו חלב מופשר קשור עם ירידה קטנה בcreamatocrit ערכי 11. - לחלב טרי, לאסוף דגימה של חלב מהפטמה לתוך צינור microhematocrit; למלא לפחות ¾ (כ 15-20 μl) מלא. לחלופין, לצייר חלב טרי מהמדגם שנאסף לתוך צינור הנימים לאחר הערבוב טוב. חותם את הסוף עם איטום חימר.
- מניחים את צינור הנימים לטווית המטוקריט, עםהסוף אטום והצביע לעבר בחוץ, הבטחת צנטריפוגה הוא מאוזן.
- בגין ספין המטוקריט (120 שניות ב13,700 XG).
הערה: זמן ספין או מהירות עשוי להשתנות בהתאם לדגם של צנטריפוגות בשימוש. - הסר את הצינור מצנטריפוגות לאחר הספין הוא להשלים ולבצע את המדידות לחישוב creamatocrit. שים לב ההפרדה של המדגם לקרם שכבה ושכבה ברורה.
- מדוד ורשום את האורך הכולל של נוזל בצינור והאורך של השומן (השמנת) שכבה באמצעות מחוגה או שליט.
הערה: creamatocrit מתבטא באחוז קרם השכבה בתוך מדגם חלב 19, מחושב כ( אורך של קרם שכבה / אורך כולל של עמודת חלב) x 100 (איור 1 א). לחשב ערכי ריכוז ואנרגיה שומן ממדידת creamatocrit כדלקמן: ריכוז שומן (גר '/ ל') = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (איור 1) 19; ערך אנרגיה (KCאל / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (%) (איור 1 ג) 19.
קביעת ריכוז חלבון 8.
- שימוש בסרום שור אלבומין כסטנדרט חלבון, לקבוע את ריכוז חלבון חלב כולל באמצעות assay חלבון סטנדרטי, כגון assay חלבון לורי 6.
הערה: דילול של חלב עשוי להיות נחוץ למדידות חלבון חלב ליפול בתוך העקומה סטנדרטית של assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חלב נאסף כמתואר בגמילה מסכרי Wistar (כ 22 שבועות, במשקל של 350-400 ז) שצרך שליטה (AIN-93G, n = 5), חלבון גבוה (40% WT קזאין / WT, n = 5) , או סיבי prebiotic גבוהים (21.6% WT / WT, 1: 1 יחס של אוליגופרוקטוז ואינולין, n = 4) דיאטה במהלך הריון והנקה. מינון האוקסיטוצין היה 2 IU. חלב נאסף באמצעות צינורות נימים, וצינור אחד היה סובב באמצעות טווה המטוקריט לקבוע creamatocrit (איור 1 א), ששמש אז להעריך ריכוז שומן וערך אנרגיה על פי: ריכוז שומן (גר '/ ל') = (creamatocrit (% ) -.59) /0.146 (איור 1); ערך אנרגיה (קלוריות / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (%) (איור 1 ג) 19. ריכוז חלבון חלב נקבע באמצעות assay Bio-Rad DC החלבון (איור 2). לא היו הבדלים בcreamatocrit (p = .674), ריכוז שומן (p = .674), ערך אנרגיה (p = .674, טו)ריכוז חלבון r (p = 0.127) המבוסס על דיאטה אימהית (בכיוון אחד ANOVA).
creamatocrit איור 1. חלב, ריכוז שומן, וערך אנרגיה. דגימות חלב נאספו בגמילה מסכרי Wistar על ביקורת (n = 5), חלבון גבוה (n = 5), או הגבוה prebiotic סיב (n = 4) דיאטות במהלך הריון והנקה. מדידות Creamatocrit () ששמשו בחישוב ריכוז שומן חלב (B) וערך אנרגיה (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ריכוז חלבון חלב סה"כ. דגימות חלב היו לאסוףאד בגמילה מסכרי Wistar על ביקורת (n = 5), חלבון גבוה (n = 5), או גבוה prebiotic סיב (n = 4) דיאטות במהלך הריון והנקה. ריכוז חלבון סה"כ נקבע באמצעות assay החלבון ביו-ראד DC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף. כל הניסויים בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקולי CCAC אושר.
Acknowledgments
עבודות זו נתמכה באמצעות מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (RGPIN 238,382-2,011) והמכון קנדי לבריאות מחקר (MOP115076). הת'ר פול נתמכה על ידי מלגות לתארים מתקדמים מדעי טבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה ומלגת פתרונות בריאות אלברטה מתפתחת. מייגן האלאם נתמכה על ידי מלגה למדעי טבע והנדסת מחקר מועצה שלאחר התואר הראשון, מלגות פרדריק בנטינג וצ'רלס בסט קנדה בוגר, ובית החולים מכון מחקר הדרכת פרס ילדים אלברטה בגנטיקה, התפתחות ילד, ובריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
