Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital

Resumo

Medindo os impactos de contaminantes ambientais sobre o comportamento dos peixes é muitas vezes subjetiva e desafiando particularmente quando se trata de endpoints subletais. Descrevemos métodos, incluindo a tecnologia de vídeo para quantificar o comportamento de natação do início da vida estágio esturjão branco (Acipenser transmontanus) durante e após 96 horas exposições agudas a várias concentrações de cobre.

Resumo

As respostas comportamentais dos organismos aquáticos aos contaminantes ambientais podem ser precursoras de outros efeitos, como sobrevivência, crescimento ou reprodução. No entanto, essas respostas podem ser sutis e a medição pode ser desafiadora. Usando juvenis de esturjão branco (Acipenser transmontanus) com exposições de cobre, este artigo ilustra técnicas usadas para quantificar respostas comportamentais usando vídeo assistido por computador e análise de imagem digital. Em estudos anteriores, foram observados graves prejuízos no comportamento de natação entre o esturjão branco em estágio inicial da vida durante exposições agudas e crônicas ao cobre. O comportamento do esturjão foi rapidamente prejudicado e na medida em que a sobrevivência no campo seria comprometida, pois os peixes seriam arrastados rio abaixo ou prontamente capturados por predadores. Os objetivos desta investigação foram ilustrar protocolos para quantificar a atividade de natação durante uma série de exposições agudas ao cobre para determinar o tempo de efeito durante o desenvolvimento do estágio inicial da vida e entender o significado dessas respostas em relação à sobrevivência desses peixes vulneráveis em estágio inicial da vida. Com a mortalidade em um continuum de tempo, determinar quando o cobre afeta pela primeira vez a capacidade de natação nos ajuda a entender as implicações para os efeitos no nível da população. As técnicas utilizadas são prontamente adaptáveis a projetos experimentais com outros organismos e estressores.

Introdução

Compreender como a exposição de contaminantes podem afetar o comportamento às vezes é muito desafiador e subjetiva. O comportamento é tipicamente definida como uma série de actividades evidentes observáveis, de corpo inteiro, que opere por meio do sistema nervoso central, e permitir um organismo para sobreviver, crescer e reproduzir-se. Mudanças no comportamento devido à exposição a um tóxico estão entre os indicadores mais sensíveis de estresse ambiental, muitas vezes entre 10-100 vezes mais sensível quando comparado a sobrevivência ^1. A maioria destes estudos examinaram natação atividade, ventilação e comportamento de forrageamento de ^2,3,4 peixe. Natação atividade é o ponto final subletais mais utilizado para determinar uma mudança comportamental em resposta a um contaminante em testes de toxicidade ^5. variáveis ​​de natação incluir a frequência e duração do movimento, velocidade e distância percorrida, a frequência eo ângulo de voltas, posição na coluna de água e o padrão de natação. atividade de natação éuma medida eficaz do comportamento de natação ao avaliar sensibilidade a uma substância tóxica com base nos critérios propostos no Capítulo 9 por Rand ⁶ nos Fundamentos do livro de Aquatic Toxicology.

Este trabalho apresenta um estudo toxicológico como um exemplo de como a toxicidade do cobre para o estágio de vida início esturjão branco (Acipenser transmontanus) em vários estágios de desenvolvimento precoce na água só de exposições relativas a Sturgeon comportamento de natação foi avaliado e ilustra os métodos de quantificação de natação comportamento.

Em estudos anteriores, as respostas comportamentais adversos eram evidentes com início precoce durante os primeiros dias de exposições agudas e crónicas ao cobre e tornou-se progressivamente mais graves ao longo do tempo de exposição e ^7,8,9 concentração. A magnitude eo momento do aparecimento destas respostas comportamentais são susceptíveis suficiente para limitar a sobrevivência a longo prazo e, portanto, são motivo de preocupação, dadas as implicações para recruifalha tamento ^10. Para interpretar com exactidão o significado desta sensibilidade aos métodos e procedimentos de exposição de metal foram desenvolvidas para quantificar o curso de tempo e extensão da deficiência de comportamento relativo a concentrações de cobre.

protocolos de teste para a função e desenvolvimento comportamental foram estabelecidas através da análise de amostras de vídeo gerais de esturjão em câmaras de exposição. As amostras de vídeo fornecida avaliação qualitativa do desenvolvimento e função entre os tratamentos de cobre durante o período de exposição. atividade de comportamento e abrigo-seeking foram avaliados durante a exposição a concentrações de cobre aquosas para determinar o tempo para efetuar e caracterizar a sequência temporal de deficiência que afeta à procura de abrigo, letargia, natação coordenação, equilíbrio e respiração. Além disso, as gravações de vídeo foram feitas de esturjão subamostrados a partir de cada réplica para o propósito de documentar quantitativamente ACTI natação espontâneavidade. Estes terminais incluíram medidas de duração ou o tempo gasto em movimento, natação velocidade e distância percorrida ^5,11 usando uma imagem digital pacote de software de análise disponíveis comercialmente. Este software define o contorno de cada imagem dentro de um campo de vista e a partir desta, define o centróide para cada imagem. O software então pode acompanhar a posição de cada centróide em um quadro a quadro sucessão para determinar os caminhos de movimento.

Este estudo cumpridas todas as seções aplicáveis ​​das Regras finais dos regulamentos Animal Welfare Act (9 CFR) e com todas as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos organismos de teste durante a cultura e experimentação. Após o término do estudo, todos os peixes foram sacrificados de acordo com as orientações adequados, aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use para o US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

Protocolo

1. diluidor de configuração para larval Sturgeon A exposição a concentrações aquosas de cobre

1. Configurar exposições usando um sistema de fluxo, tais como um sistema de ¹² diluidor Mount e Brungs modificado seguintes orientações pela ASTM International ^13,14,15.
2. Escolha de 25 ug / L como a concentração elevada de cobre com base nos resultados dos testes anteriores, onde foram observados efeitos em torno de 4-6 ug / L. Use grau reagente cobre II pentahidratado (> 98% de pureza) e misturar-se uma solução de teste.
   NOTA: Série concentração Exemplo para as exposições são de 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625 e 0 g / L. Usando 50% a partir de diluições em série com 25 ug / L como a elevada concentração vai atingir uma gama de concentrações observadas para causar uma diminuição do comportamento.
3. Preparar a solução de estoque de teste em um frasco volumétrico de 48 horas antes do início da exposição e configurado para entregar a espiga da câmara de mistura utilizando um diluidordispensador de seringa automatizada.
4. Usar um molde folha de cálculo para determinar o peso do produto químico a ser adicionada a 1 L de água desionizada que irá resultar em 25 g / L de concentração de cobre, quando diluidor câmara de mistura é enriquecida com 1 ml da solução de reserva de teste.
   NOTA: A Figura 1 descreve um exemplo de um molde de folha de cálculo para a preparação da pasta química, para testes de toxicidade diluidor.
5. Pesar 195 mg de cobre de grau reagente II pentahidratado utilizando uma balança analítica e verter para um balão volumétrico de 1 L e misturar-se com 1 L de água desionizada para uma concentração de estoque de 48,65 mg / L.
6. Coloque o tubo de entrada do distribuidor seringa automatizada para a solução de teste e definir o volume de pico para 1 ml e virar o diluidor na lançando o interruptor de alimentação e deixe ciclo de 48 horas permitir que ele atinja o equilíbrio à concentração de cobre correspondente antes da meia esturjão.
7. Anexar uma linha de in-4-way divisor de fluxo 16 para cada linha de distribuição para dividir o fluxo de água para cada uma das quatro câmaras de exposição a replicar-se em banho de água diluente. Gravidade alimentar a água. Ciclo da água através do diluidor quando a alimentação do diluidor e liga-se uma válvula de solenóide é aberto permitindo que a água a fluir para os tanques de diluição. Definir a unidade chiller a 15 ° C e ligue a bomba de água para circular a água no banho de água diluidor.
   NOTA: Este processo é regulado através do uso de um temporizador automatizado.
8. Definir o diluidor de ciclo a cada 30 min, utilizando o temporizador automatizado e para fornecer 250 ml de água de teste com cada ciclo, o que resulta em 12 adições de volume por dia para cada câmara de teste de replicar.
9. Escolha as câmaras de ensaio de exposição com base no tamanho do esturjão para manter a taxa aceitável de carga que é <10 g de peso molhado de peixe / L em qualquer câmara em qualquer momento dado. Por exemplo, a realização de exposições com 30 dias de pós-eclosão (DPH) esturjão branco (peso médio em gramas 0,17 g) usar 12 x21,5 cm ² frascos de vidro com um buraco 4 cm no lado. Cobrir este lado com um crivo de aço inoxidável de malha de 30 micra para permitir o fluxo através da água de ensaio. O volume de água de teste nos frascos de exposição é de 1 L.
10. Usando uma seringa de plástico de 50 ml tomar duas 50 ml de amostras de água em duplicado em cada concentração de um total de 12 amostras e fornecimento de água de teste em 100 provetas mL em vidro e medir o oxigénio dissolvido (OD), de temperatura, de condutividade, pH, alcalinidade, dureza, Total amônia, cátions, os principais ânions e carbono orgânico dissolvido utilizando equipamento comercial padrão e siga as instruções do fabricante.
    NOTA: As amostras devem ser tomadas no início e no final da exposição.
11. Para recolher o sub-amostras para a análise química, utilizar uma seringa de plástico de 25 ml, elaborar aproximadamente 24 ml de água de teste a partir das câmaras de exposição usando uma palha Sipper ligada à seringa, em vez de uma agulha.
12. Remover a palha Sipper do SYRinge e colocar um alojamento do cartucho de filtro de polipropileno de 0,45 um de tamanho de poro, da membrana de polietersulfona na seringa de plástico.
13. Empurre 4 ml de água de teste através do filtro e descarte.
14. Dispensar os restantes 20 ml de água de teste através do filtro para um frasco de polietileno limpo-ácido e acidifica-se até um volume de% / volume com elevada pureza, o ácido nítrico 16 M para o armazenamento de até 3 meses.
    NOTA: As amostras para análise química deve ser tomada no início, meio e fim da exposição para confirmar as concentrações de cobre.
15. Realizar a análise química por espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado seguinte US Environmental Protection Agency Method 6020A ¹⁷
16. Depois de tomar todas as amostras de água e do diluidor está dando um ciclo, estoque 10 (ao acaso aleatório), esturjão em cada replicar câmara de teste. Recolhe-se o esturjão a partir do tanque de cultura em que eles estão alojados usando uma pequena malha de rede não-abrasivo. Coloque esturjão em um pequeno bucket com água cultura. Um total de 240 peixes são necessários para iniciar a exposição.
17. Não alimentar os peixes durante a exposição.
    NOTA: Por favor, consulte a Figura 1 para uma configuração visual do layout diluidor.
18. Leia o teste todos os dias para a duração da exposição e peixes registro de mortalidade e monitorar natação comportamento.
    NOTA: Outros endpoints de olhar para incluir letargia, perda de equilíbrio, alterações na respiração, alterações na pigmentação, a posição peixes estão na coluna de água, escondendo atividade e quaisquer outras anormalidades que podem ser identificados visualmente.
    NOTA: Leia o teste ao mesmo tempo todos os dias para manter a consistência.
19. Medir e quantificar a atividade de natação (peixe tempo gasto em movimento, a velocidade ea distância percorrida), utilizando um programa de software de rastreamento digital disponível comercialmente.

2. Observações e contagens da mortalidade durante a exposição

1. Inspecione visualmente cada ch testeâmbar e mortalidade nota e as observações do comportamento anormal, usando uma lista de verificação comportamental (Tabela 1) sobre as fichas aproximadamente ao mesmo tempo por dia durante a exposição de 96 h, de preferência na parte da manhã.
   NOTA: Comportamentos que são notavelmente, estranhamente, subjetivamente, qualitativamente diferente dos controles são considerados anormais. Otimamente o observador não tem conhecimento dos tratamentos.
   NOTA: A perda de equilíbrio é definida como a incapacidade de peixe para manter uma posição vertical dentro da coluna de água e a imobilidade é definida como a incapacidade de se mover para peixes ou nadar a menos estimulada. Outras anormalidades tais como letargia, hiperatividade, aumentos ou diminuições na respiração, mudanças de cor, tremores, espasmos, abdomens inchados, posição na coluna de água e quaisquer outros padrões de natação incomuns também devem ser registrados na folha de dados.
   NOTA: Consulte o Video 1 para exemplos de anormalcomportamento.
2. Record e remover esturjão mortos diariamente.
3. Usando uma mão oxigênio dissolvido (OD) metro realizado com sonda de medir o oxigênio dissolvido in situ e registro de temperatura da água em duas repetições de cada concentração de exposição e registro na folha de dados.

3. filmagem Natação Atividade

1. amostras de dados de captura de vídeo usando uma câmera de vídeo portátil montado em um tripé posicionado diretamente em cima da câmara de teste para documentar anormalidades comportamentais.
2. Para quantificar atividade de natação, corte um pedaço de PVC 13 tubos cm de diâmetro e 13 cm de altura para utilizar como a arena de teste (Figura 1). Coloque o tubo de PVC no diluidor dentro de cada correspondentes tanques de exposição de concentração de cobre. Use a área dentro do tubo de PVC como a arena de teste como este é grande o suficiente para esturjão para nadar livremente.
3. No fim da exposição 96 h, subamostra aleatoriamente cinco sobreviventes esturjão de cada Concentraçã cobren sob medida para atividade de natação e colocá-los para a arena de teste usando uma pequena rede de malha.
   NOTA: Nas concentrações de ensaio superiores onde a mortalidade esturjão foi predominante, qualquer esturjão sobrevivente restante deve ser usado para medir a atividade de natação e em alguns casos pode ser inferior a 5.
4. Depois de colocar os peixes para a arena de teste, permite que o peixe para aclimatar durante um período de 30 min.
   NOTA: sucesso, erro de análise gratuita do vídeo requer uma imagem de alto contraste do peixe contra um fundo com um mínimo de estrutura que pode obscurecer ou ocultar a imagem do peixe. A imagem dos peixes devem estar em bom foco e deve estar livre de brilho de superfície ou livre de distorções devido a água em movimento para que o sistema diluidor deve ser desligado.
5. Após 30 minutos, desligue a câmera de vídeo e definido para REC para gravar a atividade de natação por um período de 2 min.
6. Euthanize o peixe depois de tomar as gravações de vídeo para determinar seportamento.
7. Coloque esturjão de uma solução concentrada de tricaina metanossulfonato (MS222) de água durante pelo menos 10 minutos para permitir a interrupção do movimento dos opérculos.
   NOTA: A concentração de pelo menos 250 mg / L é recomendada e pode ser muito maior para determinadas espécies.
8. Coloque o esturjão sacrificados em um saco zip lock plástico e coloque no congelador para eliminação em um momento posterior. Vire o vídeo câmera e transferir todos os arquivos de vídeo a um computador para o processamento pós usando software de monitoramento digital.

4. Medidas de Natação Actividade de reprodução de vídeo

1. Localize os arquivos de dados da folha de dados e vídeo para o experimento a ser analisado. Converter arquivos de vídeo para um formato compatível o software de análise digital pode utilizar.
2. Carregar todos os arquivos a serem processados ​​em software. software de rastreamento aberto clicando no ícone. Clique na "experiência padrão Novo" sob o título "Criar uma nova experiência" option na tela principal.
3. Insira o nome para o experimento na caixa de diálogo "New Experiment" que aparece na tela. Escolher arquivo experimento localização é para ser salvo. Clique em "OK". Escolha "Configurações Experiment" opção em "Setup" .Choose "Do arquivo de vídeo" em "fonte de vídeo".
4. Selecione "1" para "Número de arenas". Selecione "3" para "Número de indivíduos por arena". "Detecção Centro-point" em "Características de rastos". Escolha unidades desejadas.
5. Selecione a opção "lista de Trial" em "Setup". Clique em "Adicionar vídeos" na parte superior da tela. Escolha "ordem alfabética" na opção "Ordem de classificação" na caixa de diálogo "Adicionar vídeos" que aparece na tela. Clique em "Procurar". Navegue até a pasta onde os arquivos de vídeo estão localizados.
6. Realce todos os arquivos de vídeo. Clique em "Abrir". Clique em "Adicionar variável" no topo da tela. Enter "Concentração" em "Etiqueta "caixa. Enter" concentração de cobre em microgramas / L "em" caixa de Descrição ".
7. Escolha "numérica" ​​da lista suspensa para "Type". Clique na caixa "pré-definidos valores". Escolha "Definir valores individuais" opção na caixa de diálogo "Predefina valores numéricos" que aparece.
8. Digite "0", "3", "6", "13", "25" e "50" no espaço "pré-definidas valor". Clique em "Adicionar >>" entre cada adição número. Desmarque a opção "Permitir que outros valores" opção. Clique em "OK".
9. Escolha "Trial" no menu suspenso na caixa "Scope". Digite concentração adequada para cada ensaio em caixas fornecidas. Clique em "Adicionar variável" no topo da tela. Enter "Replicar" na caixa "Etiqueta". Enter "Replicar número" na caixa "Descrição". Escolha "numérica" ​​da lista suspensa para "Type".
10. Clique em "POs valores redefinidos "caixa. Escolha" definir valores individuais "na opção" Predefina valores numéricos "caixa de diálogo. Digite" 1 "," 2 "," 3 "e" 4 "no" pré-definidas valor "espaço. Clique em" Adicionar >> "entre cada adição número. Desmarque a opção" Permitir que outros valores "option.Click" OK ".
11. Escolha "Trial" no menu suspenso na caixa "Scope". Insira o número de replicação apropriado para cada ensaio em caixas fornecidas. Escolha "Configurações Arena", sob aba "Configuração" no topo da tela. Nome primeira definição "Trial 1". Clique na opção "Grab Imagem de fundo" da caixa "Configurações Arena (Trial 1)" diálogo.
12. Clique em "Browse" na caixa de diálogo "Grab Imagem de fundo". Localize o arquivo de vídeo para o Ensaio 1 e clique em "Abrir". Clique na opção "Grab" na caixa de diálogo "Grab Imagem de fundo" depois de vídeo será exibido. Clique no ícone branco círculo próximo ao topo da tela under "Configurações Arena".
13. Manipular círculo que aparece de modo que toda área de piscina está incluído no círculo. marcas de hachuras aparecem onde a área da arena está definido. Clique no ícone "Calibragem Scale" perto da parte superior da tela em "Definições Arena". À esquerda, clique em uma borda da arena. Segure e arraste o mouse sobre a extremidade oposta da arena. Solte o botão esquerdo.
14. Enter "10.5" na caixa "distância do mundo real" na caixa de diálogo "Calibração Distância" que aparece. Clique em "OK". Se necessário, ajuste linha de calibração de modo que se estende por todo o diâmetro da arena circular.
15. Clique na opção "Validar Configurações Arena" on "(1 Trial) Configurações Arena" caixa de diálogo. Resolver quaisquer problemas se as configurações não são validados. Direito clique em "Configurações Arena" sob a opção "Configuração" a partir da barra de ferramentas "Experiment Explorer" na esquerda da tela e escolha "New" do menu.
16. Repita os passos 4,11-4,15 até arena de configurações have foi criado para cada tentativa. Certifique-se de escolher o arquivo de vídeo apropriado para cada tentativa. Escolha "Configurações de Detecção de" sob a opção "Configuração" a partir da barra de ferramentas "Experiment Explorer" na esquerda da tela.
17. Escolha "subtração dinâmico" no menu suspenso em "Método", no "configurações de detecção: 1 Configurações de Detecção de" caixa de diálogo que appears.Choose diferentes cores de preenchimento para cada assunto em "Identificação Assunto" no diálogo: "Configurações de Detecção de Configurações de Detecção de 1" caixa.
18. Escolha "Select Vídeo" e localize vídeo para julgamento 1.Click "Open" .Selecione "5,9941" da caixa "Taxa de amostragem" em "Video" na caixa de diálogo: "Configurações de Detecção de Configurações de Detecção 1". Clique em "Configurações" para a opção "Imagem de referência" em "Detecção" na caixa de diálogo: "Detecção de Configurações Configurações de Detecção 1".
19. Clique em "Iniciar Aprendizagem (C)4; na opção "Imagem de referência" diálogo box.Wait para o programa para aprender imagem de referência. Uma vez que a imagem na caixa de diálogo "Imagem de referência" aparece sem animais, clique em "Usar imagem de referência dinâmico" em "Definições de Aquisição" dentro da caixa de diálogo.
20. Clique em "Fechar". Escolha "Darker" a partir do menu drop-down para "O assunto está" em "Detecção" na caixa de diálogo: "Detecção de Configurações Configurações de Detecção 1". Definir um número menor de "33" e maior número de "153" para "contraste escuro" em "Configurações de Detecção de" detecção ": Configurações de Detecção de 1 caixa de diálogo".
21. Clique em "Salvar alterações" na parte inferior direita da caixa de diálogo: "Detecção de Configurações Configurações de Detecção 1". Clique no botão play na caixa de diálogo "Controle de reprodução" e confirmar que o software está rastreando com êxito animais ao invés de sombras ou detritos. Ajuste números de "contras escurasT "conforme necessário.
22. Uma vez que o acompanhamento é apropriado, clique em "Salvar alterações" na parte inferior direita da caixa de diálogo: "Detecção de Configurações Configurações de Detecção 1". Escolha "Aquisição" na opção "Configuração" a partir da barra de ferramentas "Experiment Explorer" na esquerda da tela.
23. Clique "Track próximo julgamento planejada" na caixa de diálogo "Configurações de aquisição". Confirmar a configuração experimental, vídeo e na arena correto é exibido em "Configurações" na caixa de diálogo "Configurações de aquisição".
24. Marque a opção "Detecção determina a velocidade" na caixa de diálogo "Controle de Aquisição". Clique no botão com o círculo verde fechado em um quadrado branco para iniciar o processo de aquisição. Repita os passos 4,22-4,23 até que todos os testes foram rastreados.
25. Clique em "Perfis de Dados" na opção "Análise" na barra de ferramentas "Experiment Explorer" na esquerda da screen.Choose "Time" em "Assentamento" option na barra de ferramentas "componentes". Ajuste "Para" para "0:02:00" no âmbito do "intervalo de tempo selecione a faixa" indo na caixa de diálogo "Time". Clique em "OK".
26. Arraste a caixa "ninho" entre a caixa "Iniciar" e na caixa "Resultado 1" na área de "perfis de dados" no lado direito da tela. Clique em "Análise de Perfil" na opção "Análise" na barra de ferramentas "Experiment Explorer" na esquerda da tela. Clique em "Velocity", sob a "Distância e do Tempo" título na barra de ferramentas "Variáveis ​​dependentes" que aparece.
27. Clique em "Adicionar" na caixa de diálogo "Velocity". Clique em "distância percorrida" sob a "Distância e do Tempo" título na barra de ferramentas "Variáveis ​​dependentes". Clique em "Adicionar" na "distância percorrida" caixa de diálogo. Clique em "Movimento" no âmbito do "comportamento individual" título nas "Variáveis ​​Dependentes" toolbar.
28. Ajuste "intervalo médio" para "1" sob o "filtro Outlier" indo na caixa de diálogo "Movimento". Ajuste "Iniciar velocidade" para "2,00" e "Stop velocidade" para "1,75" no âmbito do "Threshold" indo na caixa de diálogo "Movimento".
29. Marque as duas caixas para "Moving" e "não em movimento" sob o título "calcular as estatísticas de" indo na caixa de diálogo "Movimento". Clique em "Adicionar" na parte inferior da caixa de diálogo "Movimento". Clique em "Output Analysis" na opção "Resultados" na barra de ferramentas "Experiment Explorer" na esquerda da tela. Clique em "Calcular" no topo da tela.
30. Uma vez que as variáveis ​​dependentes são calculados, clique em "Export" no topo da tela. Escolha a pasta de destino em "Output Análise Export" caixa de diálogo. Selecione "Excel" no menu suspenso "Tipo de Arquivo" no "Export Análise Output "caixa de diálogo. Clique em" OK ".
31. Clique em "Salvar Experiment" sob a guia "Arquivo" no topo da tela. Feche o software de monitoramento digital. Importe os dados para um arquivo de planilha e analisar utilizando um pacote comercial de software de análise estatística.

Resultados

Processar manualmente os dados observacionais visuais mostraram anormalidades por cento de aumento com o aumento da concentração de cobre depois de apenas 72 horas de exposição iniciado com dois dias após o nascimento (DPH) esturjão (Figura 2). As amostras de vídeo documentou o impacto extremo de exposição ao cobre no comportamento esturjão natação (Video 2) e ajudou na definição da deficiência comportamental como resultado. Em outro exemplo, o esturjão em 30 de DPH mostraram-se sensíveis à exposição de cobre com uma concentração de 96 h mediana efeito letal (CL50) de 40,3 ng / L, com base na mortalidade única. No entanto, quando terminais comportamentais subletais de perda de equilíbrio e imobilização estão incluídos juntamente com a mortalidade, a sensibilidade aumenta com uma concentração de 96 hr efeito mediano estimado (EC50) varia entre 2,4 e 5,0 ug / L. documentação em vídeo capturados estes efeitos subletais e mais validados observações humanos das anomalias comportamentais gravadosdurante a exposição. O uso de software de monitoramento digital de reduzir o tempo de processamento pós significativamente ao analisar a atividade de natação. Velocidade de natação dos peixes, o tempo gasto em movimento, e a distância percorrida diminuiu significativamente todos (Figura 3) com o aumento da concentração de cobre. Caminhos natação também foram reduzidas com o aumento da concentração de cobre (Figura 4).

Figura 1:.. Captura de tela do computador de um modelo de planilha utilizado para determinar teste de concentração da solução estoque de preparação de estoque Químico para os testes de toxicidade diluidor foi determinada usando um modelo de planilha baseada em uma concentração alvo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2:. Configuração diluidor e design experimental Vários estágios de vida do esturjão branco foram expostos ao cobre. O tamanho de diluente utilizado para as exposições foi seleccionada com base no tamanho do peixe. (A) esturjão início do estágio de vida foram expostos usando uma pequena configuração diluidor e (b) esturjão mais velhos estágio de vida foram expostos usando um grande configuração diluidor.

Figura 3: Natação comportamento resulta de um esturjão branco estágio de vida precoce (Acipenser transmontanus) a exposição ao cobre 72 horas (começando com 30 dias após o nascimento [DPH] peixe). Endpoints atividade de natação (a) duração do movimento entre 30 dph esturjão branco; (B) a velocidade de natação; e (c

Figura 4: Resultados de um esturjão branco estágio de vida precoce (Acipenser transmontanus) 96 horas a exposição ao cobre (começando com dois dias após o nascimento [DPH] peixe) Sobrevivendo esturjão branco a 2 dph exibindo perda de equilíbrio e imobilização após 72 horas de um. exposição de 96 horas com o aumento da concentração de cobre. Asterisco indica diferença significativa do controle, barras de erro representam o desvio padrão.

Figura 5: Exemplo de natação caminho resulta de um esturjão branco estágio de vida precoce (TRANSMO Acipenserntanus) a exposição ao cobre 96 hr (olhando com 30 dias após o nascimento [DPH] peixe). caminhos de natação do esturjão digitalizado utilizando o software de rastreamento digital a partir de (a) replicar controle (n = 5 peixes) e (b) a partir de um tratamento de alta (50 ug / L) replicadas (n = 3 peixe) após uma exposição de 96 h. Observe o número de caminhos de natação não representa o número de peixes presente na câmara por causa de alguns peixes estavam inativos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetro quantificável	Parâmetros observacionais
Velocidade	Letargia / Hiperatividade
Distância Movido	A perda de equilíbrio
Duração do tempo de permanência na zona de	Espasmos / tremores / cabeçabaixa
Zona de transição-número de vezes organismo se move entre as zonas selecionadas	Posição na coluna de água
Indo para ponto-calcula o desvio do caminho do animal para um ponto de interesse	Respiração (rápido / lento)
Título calcula a posição do ponto de organismo seleccionado	Coloração
Vire ângulo diferença na posição entre duas amostras	Se escondendo
Velocidade angular calculada dividindo-se o ângulo de viragem por o intervalo de amostragem
Meandro-calculadas dividindo o ângulo de viragem pela distância percorrida. Utilizado para comparar transformando em animais movendo-se a velocidades diferentes
Tempo gasto em movimento
Mobilidade estado-calcula a duração em que a área total detectado como animal está em mudança, mesmo se o centponto er permanece a mesma
Rotação de uma rotação completa-se quando o ponto organismo seleccionado tem um ângulo de viragem cumulativo de 360 ​​°. Acontece na direção oposta de menos do que o limite são ignoradas.
Mobilidade contínua a calcular a percentagem da mobilidade para a área completa do animal detectados, mesmo se o ponto central permanece a mesma.
Distância entre os sujeitos-calcula a distância entre todos os intervenientes e os receptores selecionados
Proximity-calcula a duração para que o ator está ou não está na proximidade com o receptor
O movimento relativo
Líquido movimento-A ponderada movimento do actor (positiva) e a partir de (negativo) o receptor, ponderada pela distância entre eles
movimento ponderada de-moveme nt do actor do receptor, ponderada pela distância entre eles.
movimento ponderada to- movimento do ator para o receptor, ponderado pela distância entre eles
período de declaração de controle de teste entre dois eventos dos elementos de controlo julgamento, ou dentro de um elemento
controle julgamento evento momento em que um evento dentro de um elemento que tenha definido no Controle julgamento ocorre.

Tabela 1:. Endpoints comportamentais quantificados através do software de rastreamento digitais Estes endpoints pode ser usado em indivíduos ou grupos e também servir como uma lista de verificações de observação visuais de deficiência comportamental durante a exposição.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Vídeo ^1:. definição visual do comportamento anormal exibido pelo esturjão branco afetado (Clique direito a download) uma lista de verificação de observação diária foi usado para documentar anormalidades A. perda de equilíbrio e imobilização foram as anormalidades mais comuns observados durante as exposições. Modificado de Calfee et al ^7.

Vídeo 2: documentação Visual destacando um exemplo de comportamento branco esturjão natação. (Clique direito a download) atividade de natação Branco esturjão foi bastante reduzido com a exposição ao aumento da concentração de cobre. O esturjão representado neste vídeo são a partir de um controlo, médio baixo, e uma elevada no final do tratamento de uma solução aquosa de cobre 96 hrexposição. Embora o esturjão branco ainda estavam vivos, é evidente o peixe foram muito prejudicada nos tratamentos em comparação com os controles. Modificado de Calfee et al. ⁷

Discussão

Mudanças no comportamento devido à exposição a um contaminante são muitas vezes utilizados como um ponto final para a toxicidade sub-letal, mas pode ser difícil de medir. Geralmente, as respostas comportamentais são medidos através de observações visuais e análise de dados manual que exige muito tempo para processar. No entanto, com o avanço da tecnologia, métodos para a atividade de natação quantificar têm-se centrado sobre o uso de videografia ¹⁸ e análise de movimento ou software de monitoramento digital, que reduz o tempo de processamento e análise. Durante a análise do vídeo capturado dados, quantificar variáveis ​​natação manualmente teria sido muito demorado por isso o uso de gravações de dados de vídeo e software de rastreamento de peixes fornecidos de forma mais eficaz e eficiente para analisar o comportamento do esturjão natação. Embora o procedimento destacado natação comportamento de um peixe, personalizando para outros organismos, tais como anfíbios e invertebrados aquáticos exigiriam modificações simples. Dependendo do que endpoin comportamentalts estão a ser tratadas, sistemas de design e câmera experimentais podem ser desenvolvidos para uso com praticamente qualquer pacote de software de rastreamento disponíveis comercialmente.

O método é demonstrado usando cobre dissolvido, mas é aplicável a outros contaminantes aquosas ou características tais como a temperatura ou teor de oxigénio. Os protocolos desenvolvidos e apresentados neste trabalho utilizou uma câmera de vídeo digital simples como o dispositivo de gravação. Os arquivos digitais são facilmente transferidos para um computador e enviados para o software de análise de movimento. Os métodos estão sendo constantemente modificado e refinado para agilizar o processo de quantificação. É imperativo que a qualidade do vídeo estar em alta definição para que o software de análise para identificar cada peixes individuais para acompanhamento. Qualquer fundo que não contrastam com o peixe vai causar problemas ao tentar processar os arquivos de dados. Outro problema comum com os dois rastreamento de vídeo dimensional é identificar indivíduosquando os caminhos de natação atravessar. Isso pode ser corrigido manualmente através da identificação de cada peixe durante a travessia caminho e ligando-se os segmentos de caminho dentro do software. Alternativamente, a actividade total pode ser determinada a partir de cada câmara de replicar como uma média do grupo. Várias câmaras individuais com cada um contendo um peixe pode ser filmado no mesmo campo de visão para calcular os movimentos de peixes individual.

Atualmente, temos atualizado para usar uma série de câmeras de vigilância gerais acima das câmaras de exposição que estão ligados a um dispositivo de gravação de vídeo digital de alta definição (HD-DVR). No entanto, o uso de qualquer sistema de câmera que pode gravar em alta definição vídeos MPEG-4 vai funcionar. O HD-DVR pode ser configurado para gravar em um determinado momento e programado para até 7 dias. Este hands-off abordagem automatizada permite a captura de vários vídeos ao mesmo tempo, para manter a consistência, minimizando perturbações externas que possam comprometer o comportamento dos peixes. O syste HD-DVRms estão conectados a uma rede interna de modo a transferência de arquivos é relativamente simples. Enquanto o sistema de câmera automatizado é uma melhora técnica muito para quantificar o comportamento de natação, ainda é benéfico para realizar observações visuais para servir informação de apoio como adicional para documentar comprometimento comportamental durante os testes de toxicidade.

Há uma longa história da literatura documenta o comportamento dos peixes alterado resultante da exposição a metais que datam do início dos anos 1960 ^19,20,21. O cobre tem sido demonstrado que causam alterações nos níveis de atividade, tais como hipoatividade em bluegill ²² (Lepomis macrochirus Rafinesque) e alterações no aparelho locomotor e atividade alimentar de truta ²³ (Salvelinus fontinalis). Pelo menos alguns peixes juvenis confiar em seu sentido de cheiro para detectar e evitar predadores, e induzida por cobre privação quimio pode impactar comportamentos relacionados com a detecção de produtos químicos de alarme ^24,25,26 . O epitélio olfativo está danificado devido a exposição ao cobre afectando assim os mecanismos sensoriais que poderiam resultar em desorientação, evitação comportamental, alimentação reduzida e quaisquer outros comportamentos que são guiados pelo olfato ^27. Esses comportamentos alterados foram consistentes com o que foi observado durante as exposições.

O comportamento de natação do esturjão branco foi impactado significativamente durante a exposição sub-letal para as concentrações de cobre aquosas .. Estes resultados ilustram como o comportamento é afetado em concentrações subletais de cobre e pode ser usado como um indicador de estresse tóxico. A análise baseada em vídeo mostrou-se eficaz em quantificar o comportamento de natação e também serviu como documentação visual qualitativa dos impactos severos sobre esturjão expostos ao cobre. O software de análise também é capaz de quantificar outros pontos de extremidade comportamentais. Por favor, consulte a Tabela 1 para obter uma lista. O sistema de exposição pode ser modificada para resolver em cada ponto de extremidademodo de tempo real e pode ser utilizado para quantificar as diferenças no comportamento associado com a exposição a vários contaminantes de interesse.

O uso de terminais de comportamento em pesquisa toxicológica aquático é cada vez mais empregado e deve ser considerado quando se avalia os efeitos de contaminantes porque a função comportamental adaptativa é crucial na determinação do prejuízo ambiental ^9. Os impactos de contaminantes ambientais para o comportamento dos peixes é muitas vezes subjetiva e desafiando particularmente quando se trata de endpoints subletais na ausência de métodos padrão ..

Natação atividade quantificada usando esses métodos podem ser rigorosamente seguidos, é não-destrutiva com o mínimo de stress para o organismo e pode ser repetido. Natação comportamento é um índice válido e consistente de toxicidade sub-letal que devem ser incorporados nos protocolos de teste para expandir a sensibilidade dos testes de toxicidade padrão ^5.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
sulfato de cobre II pentahidratado	Sigma-Aldrich		contaminante de preocupação
dispensador de seringas	Hamilton MicroLab 600 Series		aparelho para espigão químico
Recipiente de frasco			para solução de estoque
24-1,5 L frascos			câmara de teste para câmera de vídeo de esturjão de 2 dph
	Sony Handycam Software de rastreamento digital HDR-CX550V
	Noldus Ethovision
3-17 "monitores de tela plana
24 câmeras de vigilância	Modelo CL101
3-16 canais dispositivos
DO medidor	YSI
medidor de pH	Orion 940
sonda de ph	Orion
			de amônia
sonda de amônia	Orion
chiller unit
bomba