O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

Resumo

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.

Resumo

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Para permitir a identificação não tendenciosa de moléculas que interagem com uma região genômica específica de interesse, desenvolvemos recentemente a técnica de imunoprecipitação de cromatina mediada por moléculas de ligação ao DNA (enChIP). Aqui, descrevemos como usar o enChIP para isolar regiões genômicas específicas e identificar as proteínas e RNAs associados. Primeiro, uma região genômica de interesse é marcada com uma proteína semelhante a um ativador de transcrição (TAL) ou um complexo de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) consistindo de uma forma cataliticamente inativa de Cas9 e um RNA guia. Posteriormente, a cromatina é reticulada e fragmentada por sonicação. O locus marcado é então imunoprecipitado e a reticulação é revertida. Finalmente, as proteínas ou RNAs associados à cromatina isolada são submetidos a análises de espectrometria de massa ou sequenciamento de RNA, respectivamente. Essa abordagem permite a identificação bem-sucedida de proteínas e RNAs associados a uma região genômica de interesse.

Introdução

A identificação de moléculas associadas com as regiões genómicas específicas de interesse é necessária para compreender os mecanismos de regulação das funções genómicas, tais como transcrição e regulação epigenética. Embora tenham sido desenvolvidas várias técnicas para análise bioquímica de regiões genômicas específicas ^1-7, eles não são amplamente utilizados nesta fase por causa de seus problemas intrínsecos, tais como aplicação limitada (por exemplo, apenas para-elevado número de cópias ou loci loci com repetições) e muito tempo e esforço necessário.

Para realizar a análise bioquímica de regiões genômicas específicas facilmente, nós desenvolvemos duas tecnologias específicas do locus de cromatina imunoprecipitação (chip), nomeadamente insercional chip (Ichip) ^8-13 e engenharia mediada por molécula de ligação a DNA ChIP (enChIP) ^14-17 . Em Ichip, um lugar de interesse é marcado por sequências de reconhecimento de inserção de uma proteína de ligação de DNA exógeno, como LexA. O locus é então isolado através de purificação por afinidade, utilizando a proteína de ligação de ADN marcado. Em enChIP, modificadas moléculas de ligação a ADN, tais como proteínas de dedos de zinco, proteínas (Tal) de activador do tipo de transcrição, e agrupados regularmente interspaced repetições palindr�icas curtas (CRISPR) complexos, são utilizados para marcar um local de interesse (Figura 1). Subsequentemente, a região genómica que é isolado através de purificação por afinidade das moléculas de ligação de ADN marcados.

Uma das vantagens de enChIP sobre ichip é que a inserção de sequências de reconhecimento de uma proteína de ligação do ADN exógeno não é necessário. Segmentação de loci CRISPR usando complexos que consistem em uma forma cataliticamente inactivo de Cas9 (dCas9) e um guia de RNA (gRNA) é muito mais fácil do que a segmentação dessas regiões por iChip ou enChIP utilizando proteínas TAL e zinc-finger. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para enChIP combinada com a espectrometria de massa e sequenciação de RNA (RNA-Seq) para identificar lócus associa-proteínas e RNAs ted, respectivamente.

Protocolo

1. Projeto de Engineered moléculas de DNA-binding Reconhecendo o alvo Locus

1. Para enChIP usando complexos CRISPR, use a ferramenta web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) para identificar sequências alvo gRNA candidato na região genômica de interesse descrito como anteriormente ^18. Esta ferramenta da web retorna locais genómicos 23 pb da forma 5'-N ₂₀ NGG-3 ', na região de alvo.
2. Sintetizar um gBlock incluindo a sequência de promotor U6 e a sequência de 5'-N _{20 em} 5'-N ₂₀ NGG-3 ', utilizando serviços comerciais (ver Figura 2) ^19,20. Para fins de subclonagem, incluem sítios de enzimas de restrição adequados fora do gBlock.
3. Inserir o gBlock num vector apropriado tal como previamente descrito ^16. Vários vetores retrovirais para gBlocks estão disponíveis (ver Materiais).
4. Para enChIP utilizando proteínas TAL, projetar proteínas TAL reconhecendo a target loci. Gerar plasmídeos que codificam proteínas TAL usando serviços comerciais. Gerar vectores de expressão que contêm as proteínas fundidas TAL com uma ou mais marcas, tais como 3 × marcar como previamente descrito ^15.

2. Criação de Células para Análise enChIP

1. Express 3 × FLAG-dCas9 e o gRNA (procedimento baseia-CRISPR) ou 3 × FLAG-Tal (à base de proteínas procedimento TAL) nas células a serem analisadas conforme descrito anteriormente ^14-17.
   1. Use transfecção transiente, se a eficiência de transfecção é alta. Um vector de expressão contendo 3 × FLAG-dCas9 e o promotor CMV está disponível (ver Materiais).
   2. Considerar a criação de transformantes estáveis ​​usando métodos convencionais, se a eficiência de transfecção transitória é baixa. Para além dos vectores retrovirais acima mencionados para gBlock, vectores retrovirais de 3 × FLAG-dCas9 estão disponíveis (ver Materiais).
2. Confirmar a expressão da 3xFLAG-dCas9 ou proteína 3xFLAG-TAL nas células transfectadas por análise de imunotransferência utilizando um anticorpo anti-FLAG (Ab) tal como descrito anteriormente ^14-17.
   Nota: A expressão destas proteínas marcadas também podem ser confirmadas por coloração intracelular com anti-FLAG-FITC e uma análise de FACS subsequente. Um protocolo para a coloração intracelular pode ser baixado do nosso homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Confirmar a expressão do gRNA pela norma técnica de RT-PCR.
4. Para a identificação quantitativa de proteínas que interagem com a região genômica de interesse, considere o uso de uma rotulagem isótopo estável por aminoácidos em cultura de células (SILAC) análise combinada com enChIP (enChIP-SILAC).
   Nota: Os Meios para a análise SILAC podem ser adquiridos de fornecedores comerciais. SILAC é poderosa para detectar interacções específicas.
   1. Células de cultura em SILAC meio pesado. Prepare células cultuvermelho em meio luz SILAC como controle negativo. Utilize pelo menos 5 × 10 ⁷ células para cada meio SILAC (leve ou pesada). Para a rotulagem eficiente, adicione tanto L-Lisina-2HCl, ¹³ C _{6 e} L-Arginina-HCl, ¹³ C _{^6, 15 N} 4 na mídia SILAC pesados. Nota: Pelo menos cinco divisões celulares são necessárias para proteínas de etiquetas.
      1. Por exemplo, células de cultura humanas fibrossarcoma HT1080 que expressam estavelmente 3xFLAG-dCas9 e um gRNA a 37 ° C e 5% de CO ₂ em meio DMEM durante SILAC e soro fetal de bovino dialisado com Lisina-2HCl mais L-arginina-HCl (média de luz) ou ¹³ _C 6 L-Lisina-2HCl mais ¹³ _C 6 ^{15 N} _{4 L-Arginina-HCl} (meio-pesado) (veja Materiais) ^16. Adicionam-se 50 mg de leve ou pesada de L-Lisina-2HCl e L-Arginina-HCl em 500 ml de meio.
      2. Células Trypsinize e replate antes de se tornarem confluentes, de modo que as células manter growt exponencialh.

3. A ligação cruzada de células com formaldeído

1. Para as células em cultura em suspensão, de transferência de 2 x 10 ⁷ células que expressam proteínas 3xFLAG-Tal ou 3xFLAG-dCas9 mais gRNA e suspender em 30 ml de meio de cultura regular em um tubo de centrífuga de 50 ml. Quando são usadas mais células, aumentar os volumes e as quantidades de reagentes proporcionalmente. Para as experiências de SILAC, misturar as células cultivadas em meio pesado ou médio da luz (5 x 10 ⁷ células cada) e dividir o total de 1 x 10 células em ⁸ 5 tubos contendo 2 x 10 ⁷ células.
2. Adicionar 810 ul de 37% de formaldeído a 30 ml de suspensão celular (concentração final 1%) e incuba-se a 37 ° C durante 5 min. Para as células aderentes, fixar directamente as células em placas de cultura pela adição de 810 ul de 37% de formaldeído a 30 ml de meio de cultura.
3. Pare a reticulação por adição de 3,1 ml de 1,25 M de solução de glicina (127 mM de concentração final), eincubar à TA durante 10 min.
4. Recolher as células por centrifugação (300 x g durante 5 min a 4 ° C). Cuidadosamente descarte o sobrenadante incluindo formaldeído e armazená-lo em um frasco adequado de lixo.
   1. Para as células aderentes, separar as células com um raspador de células e colheita em um tubo de 50 ml, e recolher as células, tal como descrito neste passo.
   2. Para as experiências de SILAC, misturar as células isoladas em cultura em meio pesado ou meio de luz (5 x 10 ⁷ células cada), dividir o total de 1 x 10 ⁸ células em 5 tubos contendo 2 x 10 ⁷ células, e recolher as células tal como descrito no presente passo.
5. Lava-se a pelete de células com 30 ml de PBS duas vezes por tubo. Cuidadosamente descarte o sobrenadante incluindo formaldeído e armazená-lo em um recipiente adequado de resíduos bottle.Handle o formaldeído de acordo com as diretrizes de segurança de produtos químicos. As células fixadas podem ser congeladas e armazenadas a -80 ° C.

4. Preparação da Cromatina (por 2 x 10⁷ células)

1. Suspender as células fixadas em 10 ml de tampão de lise celular (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de IGEPAL CA-630, e 1 × inibidores da protease) e incubar em gelo durante 10 min.
2. Centrifugar a amostra (830 x g a 4 ° C durante 8 min) e o sobrenadante cuidadosamente descartar.
3. Suspende-se o sedimento em 10 ml de tampão de lise nuclear (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sódio a 0,5%, 0,5% lauroilsarcosina, e inibidores da protease 1x). Incubar em gelo durante 10 min e agitar no vortex todos os 2-3 minutos.
4. Centrifugar a amostra (830 × g a 4 ° C durante 8 min) e o sobrenadante cuidadosamente descartar.
5. Lava-se a pelete em 10 ml de PBS. O sedimento (fracção cromatina) pode ser armazenada a -80 ° C, após o congelamento imediato em azoto líquido.

5. Sonication de cromatina (por 2 x 10 ⁷ células)

1. Suspender a fracção cromatina em 800 ul detampão de lise modificada 3 (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, desoxicolato de sódio a 0,1%, 0,1% SDS e inibidores de protease 1x) e transferir para um tubo de 1,5 ml.
2. Sonicar a cromatina utilizando um sonicador (ver Materiais) e as seguintes condições: a saída: 3; dever: 100% (contínua); e tempo: livre. Realizar 10-18 ciclos de ultra-sons durante 10 segundos e arrefecimento em gelo durante 20 seg. Para evitar o aquecimento excessivo, incubar as amostras em gelo durante 2 minutos a cada 5-6 ciclos. Para evitar a formação de espuma, manter a posição da ponta da sonda de ultra-sons de 0,5 cm acima do fundo do tubo.
3. Centrifugar a amostra a (16000 x g a 4 ° C durante 10 min) e transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml. A cromatina sonicado pode ser armazenado a -80 ° C, após o congelamento imediato em azoto líquido.

6. Avaliação da cromatina Fragmentação

1. Misturar 10 ul da cromatina fragmentada com 85 ul de água destilada.
2. Adicione 4 ulde NaCl 5 M e incuba-se a 65 ° CO / N.
3. Adicionar 1 mL de 10 mg / ml de RNase A e incubar a 37 ° C durante 45 min.
4. Adicionar 2 ul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 pi de 1 M de Tris (pH 6,8), e 1 uL de 20 mg / ml de Proteinase K, e, em seguida, incuba-se a 45 ° C durante 1,5 h.
5. Separada de 10 ul da amostra por electroforese em um gel de agarose a 1% que não contém corantes de coloração tais como SYBR verde.
6. Corar o gel para avaliar a distribuição dos comprimentos da cromatina fragmentada. Condições que geram um comprimento médio de 0,5-2 kpb (gama de 0,2-4 kpb) são recomendados.
7. Purifica-se o ADN das amostras restantes por extracção com fenol-clorofórmio ou utilizando um kit de extracção de ADN (ver Materiais). O ADN purificado pode ser utilizado como o ADN de entrada para estimar os rendimentos de análises enChIP (ver 8.11).

7. Preparação de Dynabeads conjugado com anticorpos (por 2 x 10 ⁷ células)

1. Prépare duas 1,5 ml tubos, um para pré-limpeza utilizando IgG de rato normal e outra para incubação com o anti-FLAG Ab. Adicionar 150 ul de proteína G-conjugado esferas magnéticas (ver Materiais) para cada tubo.
2. Colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem.
3. Suspender as pérolas em 1 ml de PBS contendo 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Colocar os tubos em um suporte magnético e esperar por 2 min. Desprezar o sobrenadante por pipetagem, em seguida, repita o passo.
4. Suspender as pérolas em 1 ml de PBS-T contendo 0,1% de BSA.
5. Adiciona-se 15 ug de IgG de rato normal ou anti-FLAG Ab e girar a 4 ° CO / N.
6. Spin down brevemente, em seguida, colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem.
7. Suspender as pérolas em 1 ml de PBS-T. Inverta as várias vezes de amostra e girar rapidamente. Colocar os tubos em um carrinho ímã e esperar por 3 min, em seguida, descartar o sobrenadante por pipetagem. Repita a lavagemmais duas vezes com PBS-T (um total de três passos de lavagem).

8. imunoprecipitação da cromatina (por 2 x 10 ⁷ células)

1. Misture a cromatina fragmentada preparado em 5.3) (aproximadamente 800 ul) com um quinto do volume (aproximadamente 200 ul) de tampão de lise modificada contendo 3 5% de Triton X-100 (concentração final de 1% de Triton X-100).
2. Adicionar a solução da cromatina para o tubo em que contas magnéticas conjugadas com Proteína G conjugadas com IgG de ratinho normal foram preparados. Girar a 4 ° C durante 1 h.
3. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min.
4. Transferir o sobrenadante para dentro do tubo em que contas magnéticas conjugadas com Proteína G conjugadas com anti-FLAG Ab foram preparados. Girar a 4 ° CO / N.
5. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Descartar o sobrenadante por pipetagem.
6. Suspender as pérolas em 1 ml de tampão de baixa salinidade (20 mM de Tris (pH 8,0), EDTA a 2 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, 0,1% de SDS, e 1x inibidores de protease) e rodar a 4 ° C durante 5 min. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Desprezar o sobrenadante por pipetagem e repita o passo de lavagem.
7. Lavam-se as esferas com tampão de alto teor salino (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA a 2 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, e inibidores da protease 1x) duas vezes.
8. Lavam-se as esferas com tampão de LiCl (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM de LiCl, 0,5% de IGEPAL CA-630, desoxicolato de sódio a 0,5%, e inibidores de protease 1x) duas vezes.
9. Lavam-se as esferas com TBS-IGEPAL CA-630 (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, IGEPAL CA-inibidores 630, e 1x de protease a 0,1%) uma vez.
10. Suspender as pérolas em 200 ul de tampão de eluição (Tris a 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de IGEPAL CA-630, os inibidores da protease de 1x, e 500 ug / ml de 3 péptido × FLAG) e incubar a 37 ° C durante 20 min. Colocar o tubo em um carrinho ímã e esperar por 3 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e repetir o Elutpasso ion.
11. Purifica-se o ADN a partir de pequena porção (por exemplo, 5%) do eluato por extracção com fenol-clorofórmio ou utilizando um kit de extracção de ADN (ver Materiais). O ADN purificado pode ser utilizado para a PCR com conjuntos de iniciadores específicos para estimar os rendimentos de análises enChIP por comparação com o ADN de entrada, preparada na etapa 6.7, como descrito anteriormente ^14,16.

9. SDS-PAGE, coloração e análise de espectrometria de massa

1. Misturar o eluato (400 ul) com 1 ml de 2-propanol, 50 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2), e 5 ul de 20 mg / ml de glicogénio. Precipitar o cromatina a -20 ° CO / N.
2. Centrifugar a amostra (16000 x g a 4 ° C durante 30 min) e desprezar o sobrenadante. Lavar o sedimento com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se novamente (16000 x g a 4 ° C durante 10 min). Desprezar o sobrenadante completamente por pipetagem.
3. Suspende-se o sedimento em 40 ul de tampão de amostra 2x (Tris 125 mM (pH 6,8), 10% de 2-mercaptoethanol, SDS a 4%, sacarose a 10%, e 0,004% de azul de bromofenol). Vortex durante 5 min para dissolver o sedimento completamente, e, em seguida, incuba-se a 100 ° C durante 30 minutos para desnaturar as proteínas e inverter a reticulação.
4. Por SDS-PAGE, correr 40 ul da amostra no gel até o corante atinge 1 cm abaixo do poço. Nota: Normalmente, usamos 4-20% géis de gradiente, mas outros géis% pode ser usado.
5. Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue ou prata.
6. Corte o gel em cinco pedaços (2 mm de altura).
7. Realiza-se em digestão em gel e análise espectrométrica de massa, tal como descrito anteriormente ^13-16.
8. Para as experiências de SILAC com 5 x 10 ⁷ células cada (total de 1 x 10 ⁸ células), suspender a pelete a partir dos cinco tubos iniciais em 40 ul de tampão de amostra 2x (não é necessário para intensificar).

10. A purificação de RNA e Análise de RNA-Seq

1. Para purificar o ARN enChIP depois, adicionam-se 5 U / ml de ARNase Inibidor (SEe Materiais) para todas as soluções tampão, excepto tampão de lise modificada 3 e o tampão de eluição, para que adicionar 40 U / ml de RNase inibidor.
2. Misturar o eluato (400 ul) com 16 ul de NaCl 5 M e incuba-se a 65 ° C durante 2 horas.
3. Adicionar 1 ml de solução de ácido de guanidínio-fenol-base-(ver Materiais) para a amostra. Vortex durante 15 segundos e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5-15 min. Centrifugar a amostra durante 15 min a 12.000 x g e RT.
4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 5 uL de p-bromoanisole. Vortex durante 15 segundos e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 3-5 minutos. Centrifugar a amostra durante 10 min a 12.000 x g e RT.
5. Transferir o sobrenadante (aproximadamente 1 ml) para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1 ml de 2-propanol. Inverter o tubo e incubar à TA durante 10 min. Carregar a mistura numa coluna de um kit de purificação de RNA (ver Materiais). Centrifugar a coluna durante 1 min a 12.000 × g e RT.
6. lavagema coluna com 400 mL de RNA Wash Buffer em um kit de purificação de RNA (ver Materiais).
7. Adicionar 80 ul de ADNase I cocktail (mistura de 5 ul de DNase I (1 U / ul), 8 uL de 10 × ADNase I Tampão de Reacção, 3 ul de DNase / RNase isenta de água, e 64 ul de ARN do Tampão de Lavagem em um kit de purificação de RNA (ver Materiais)) para a coluna. Incubar a amostra a 37 ° C durante 15 min e em seguida centrifugar durante 30 segundos a 12.000 x g e RT.
8. Lavar a coluna com 400 mL de RNA pré-lavagem tampão em um kit de purificação de RNA (ver Materiais) duas vezes.
9. Elui-se o ARN com 50 ul de ADNase / ARNase isenta de água. O RNA eluído pode ser utilizado para a sequenciação de ARN.

Resultados

Em geral, 1-30% de regiões genómicas alvo pode ser purificado utilizando enChIP. Figura 3 inclui dados representativos mostram os rendimentos em enChIP análises de telómeros direccionamento e o promotor do interferão (IFN) reguladora factor-1 (IRF-1) gene. Como exemplos de resultados típicos, Tabela 1 lista as proteínas associadas com o IRF-1 promotor de uma forma de IFNy específico identificado por enChIP-SILAC, Tabela 2 lista as proteínas se ligam a telómeros identificados por enChIP combinada com espectrometria de massa (enChIP-MS) e Tabela 3 lista os RNAs associadas com telômeros identificados por enChIP-RNA-Seq.

Figura 1. Visão geral do enChIP. enChIP usando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Seqüência de gBlock. O promotor U6 (em preto), o G nucleotídeo bntes a sequência de guia (em azul), a sequência de guia (gRNA espaçador) (em vermelho), a sequência de suporte (em verde), e uma sequência de terminador (em laranja) são mostrados.

Figura 3. Rendimentos de análises enChIP representante. Insumos (A) Porcentagem para a meta de IRF-1 lócus ea Sox2 lócus não-alvo. Entradas (B) Porcentagem para os telômeros-alvo e não-alvo y-satélites. Os números foram adaptados e modificados a partir de publicações anteriores ^15,16.

Categorias	Proteínas
Transcrição	DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homólogo, PURβ, activado RNA polimerase II activador transcricional de p15, BTF3, Myb de ligação1A proteína
Desacetilação Histona, componentes corepressor	RBBP4, PA2G4, TBL3
Acetiltransferase	Proteína arginina metiltransferase N-1
DNA topoisomerase	DNA topoisomerase 2α
Histones	Histona H2A.Z, H3.2 histona

Tabela 1:. Exemplos de proteínas associadas com o promotor de IRF-1 humano região de uma forma de IFNy específico identificado por enChIP-SILAC A tabela foi adaptada de uma publicação anterior ^16.

Categorias	Proteínas
Proteínas se ligam a telómeros de mamíferos	PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Telômero-binding proteínas em levedura ou outros organismos	IMP4
As proteínas que interagem com o telómero de ligação proteínas [proteína de ligação dos telômeros associado]	DNA polimerase α (Pola1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [terc], GNL3L [TRF1], exportin-1 [terc], 14-3-3 [terc]
Proteínas que localizam a heterochromatin	BEND3
Proteínas reguladoras marcas epigenéticas	KDM5C
Proteínas cujas mutações afetam a função dos telômeros	Α DNA polimerase (Pola1), Hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamato-cisteína-ligase, glutarredoxina, SMRC1

Tabela 2:. Exemplos de proteínas associadas com telômeros rato identificadas por enChIP-MS A tabela foi adapted de uma publicação anterior ^15.

Categorias	RNAs
Componentes da telomerase	Terc, rMRP
Telomeric RNAs	Terras
scaRNAs	Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs	Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs	Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA	Neat1

Tabela 3: Exemplos de RNAs associadas com telômeros rato identificadas por enChIP-RNA-Seq A tabela foi adaptada de uma publicação anterior ^17..

Discussão

Aqui, descrevemos a purificação de regiões genômicas específicas usando moléculas de ligação ao DNA projetadas, como o sistema CRISPR e as proteínas TAL, e a identificação de proteínas e RNAs ligados a essas regiões genômicas. A ligação de moléculas de ligação ao DNA modificadas ao genoma pode afetar a estrutura da cromatina, incluindo o posicionamento do nucleossomo, e pode anular as funções genômicas, conforme descrito em experimentos de interferência CRISPR²¹. Para evitar esses potenciais efeitos aberrantes, propomos diretrizes específicas para a escolha de regiões genômicas alvo. Primeiro, para evitar a inibição potencial do recrutamento de RNA polimerases e fatores de transcrição, bem como a interrupção do posicionamento do nucleossomo em torno do local de início da transcrição, as regiões-alvo para análises de regiões promotoras devem estar várias centenas de pares de bases a montante de (5 'para) o local de início da transcrição. Por outro lado, ao analisar regiões genômicas com limites distintos, como intensificadores e silenciadores, as regiões genômicas que são diretamente justapostas a essas regiões podem ser direcionadas porque é menos provável que a ligação de moléculas de ligação ao DNA modificadas afete suas funções. Além disso, é melhor evitar o uso de regiões-alvo que são conservadas entre diferentes espécies, porque moléculas importantes de ligação ao DNA geralmente se ligam a regiões evolutivamente conservadas e a inibição de sua ligação pode interromper as funções das regiões genômicas alvo. Nesse sentido, é sempre necessário verificar se a função da região genômica alvo é mantida nas células estabelecidas usadas para análises de enChIP. Como vários gRNAs podem ser testados facilmente e é tedioso e caro gerar várias versões de proteínas TAL ou dedo de zinco reconhecendo diferentes regiões genômicas alvo, o enChIP usando CRISPR é mais vantajoso do que o enChIP usando outras proteínas.

Foi demonstrado que o dCas9 se liga a locais fora do alvo, embora a afinidade com esses locais possa ser mais fraca do que com os locais de destino^22-25. Existem várias maneiras de gerenciar a contaminação de moléculas ligadas a esses locais fora do alvo. Primeiro, o uso de vários, pelo menos dois, gRNAs diferentes seria recomendado. Essas moléculas comumente observadas em enChIP usando gRNAs distintos seriam verdadeiros positivos. Em segundo lugar, a comparação de diferentes condições para enChIP seria eficaz para cancelar a contaminação de moléculas não específicas e moléculas ligadas a locais fora do alvo. Exemplos desses conjuntos de comparação seriam (i) estimulação (-) e (+), ou (ii) diferentes tipos de células, como células T vs. células B. Finalmente, a análise quantitativa da ligação de moléculas candidatas deve ser realizada para confirmar sua ligação específica aos locais-alvo. É preferível preparar células que expressam apenas dCas9, mas não gRNA como controle negativo.

Usando análises enChIP, fomos capazes de identificar com sucesso uma série de moléculas conhecidas e novas interagindo com regiões genômicas específicas (Tabelas 1-3) ^14-17. No entanto, essa técnica não conseguiu detectar algumas outras proteínas conhecidas interagindo com essas regiões. Por exemplo, STAT1 supostamente se associa ao promotor IRF-1 após a estimulação de IFNγ⁸, mas nossa análise enChIP-SILAC não detectou STAT1 como uma proteína induzida a interagir com essa região genômica¹⁶. Além disso, na análise enChIP-MS dos telômeros, não detectamos proteínas shelterinas constituídas por TRF-1 e TRF-2¹⁵, que demonstraram interagir com os telômeros²⁶. Existem algumas razões potenciais para essas discrepâncias. Primeiro, a estequiometria de ligação de Stat1 ao promotor IRF-1 pode ser muito baixa. É razoável que o enChIP-MS, incluindo o enChIP-SILAC, detecte proteínas que estão mais abundantemente associadas às regiões genômicas alvo; portanto, a análise de mais células pode ser necessária para detectar essas proteínas. Aumentos nas sensibilidades dos instrumentos de EM também contribuiriam para a detecção eficiente de proteínas com baixa ligação estequiométrica. Em segundo lugar, algumas proteínas, possivelmente incluindo Stat1 e shelterinas, podem ser alvos difíceis para análises de EM. Em terceiro lugar, em nossa análise das proteínas de ligação aos telômeros¹⁵, as proteínas 3×FLAG-TAL que reconhecem os telômeros (3×FN-Tel-TAL) podem ter bloqueado a ligação de shelterinas aos telômeros de maneira competitiva.

Em contraste com a relativa dificuldade de detectar fatores de transcrição ligados a regiões genômicas específicas usando enChIP, identificamos com sucesso reguladores epigenéticos, como enzimas de modificação de histonas, usando análises enChIP. O sucesso desta técnica pode ser devido ao fato de que os reguladores epigenéticos se ligam a uma ampla gama de regiões genômicas; portanto, mais proteínas por região genômica estão disponíveis para EM. Como os reguladores epigenéticos são cada vez mais reconhecidos como alvos importantes para medicamentos contra doenças intratáveis, como o câncer, o enChIP seria uma ferramenta útil para a identificação de alvos de medicamentos epigenéticos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Serviço de síntese gBlock	Life	Technologies Gene Synthesis por GeneArt
Serviço de síntese gBlock	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Fragmentos de
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
Serviço de síntese de TAL	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3× FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3× FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3× FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3&vezes; FLAG-dCas9 / pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
anti-FLAG conjugado com FIT M2	Sigma-Aldrich	F4049
Meio DMEM para SILAC	Life Technologies	89985	Outro meio pode ser adquirido na Life
Technologies FBS dialisado para SILAC	Life Technologies	89986
L-Lisina-2HCl para SILAC	Life Technologies	89987	Para
L-Arginina-HCl de meio leve para SILAC	Life Technologies	89989	Para
L-Lisina-2HCl de meio leve, 13C6 para SILAC	Life Technologies	89988	Para
L-Arginina-HCl de meio pesado, 13C6, 15N4 para SILAC	Life Technologies	89990	Para meio pesado
Completo, mini,	Roche Diagnostics	4693159
Disruptor Ultrassônico UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrador	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inibidor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Kit Miniprep de RNA Direto-zol	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		Um componente de um sistema nanoLC-MS/MS para análise
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		Um componente de um sistema nanoLC-MS/MS para análise
Amostrador automático HTC-PAL	CTC Analytics		Um componente de um sistema nanoLC-MS/MS para análise MS