Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Summary

Descrevemos dois métodos complementares usando o indicador de ciclo celular de ubiquitinação de fluorescência (FUCCI) e análise de imagem ou citometria de fluxo para identificar e isolar células nas regiões internas de G1 presas e externas de proliferação de esferoides 3D.

Abstract

Os esferoides tumorais tridimensionais (3D) são utilizados na pesquisa do câncer como um modelo mais preciso do microambiente tumoral in vivo, em comparação com a cultura de células bidimensional (2D) tradicional. O modelo esferóide é capaz de mimetizar os efeitos da interação célula-célula, hipóxia e privação de nutrientes e penetração de drogas. Uma característica deste modelo é o desenvolvimento de um núcleo necrótico, circundado por um anel de células presas G1, com células proliferantes nas camadas externas do esferóide. De interesse no campo do câncer é como diferentes regiões do esferóide respondem a terapias medicamentosas, bem como à manipulação genética ou ambiental. Descrevemos aqui o uso do sistema indicador de ciclo celular de ubiquitinação de fluorescência (FUCCI) juntamente com citometria e análise de imagem usando software comercial para caracterizar o status do ciclo celular das células em relação à sua posição dentro dos esferoides do melanoma. Esses métodos podem ser usados para rastrear mudanças no status do ciclo celular, expressão gênica / proteica ou viabilidade celular em diferentes sub-regiões de esferóides tumorais ao longo do tempo e sob diferentes condições.

Introduction

Esferóides multicelulares 3D têm sido conhecida como um modelo de tumor durante décadas, no entanto, só recentemente é que eles tenham entrado em uso mais comuns, como um modelo in vitro para muitos cancros sólidos. Eles são cada vez mais utilizados em telas de alto rendimento de descoberta de drogas como um intermediário entre o complexo, caro e em modelos in vivo demorado e o simples, modelo de monocamada 2D baixo custo ^1-6. Estudos em cultura 2D são muitas vezes incapazes de ser replicado in vivo. Modelos esferóides de muitos tipos de cancro são capazes de imitar as características de crescimento, de sensibilidade a d....

Protocol

1. FUCCI Transdução e Cultura de Células

1. Transdução FUCCI
   1. Criar linhas de células que expressam estavelmente o FUCCI constrói mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) ^{15 utilizando} co-transdução de lentivírus, como descrito anteriormente ^7.
      Nota: O sistema FUCCI já está disponível comercialmente.
   2. Gerar sub-clones com fluorescência brilhante pela triagem de uma única célula. Ordenar as células individuais positivas tanto para AG e KO (amarelo) por fluorescência de células activadas por triagem em uma placa de 96 poços como anteriormente descrito ^7,16.
2. A cultura de células de melano....

Results

Existem vários métodos de produção de esferóides tumorais, este protocolo utiliza o método de crescimento não-aderente, em que as células são cultivadas em agar ou agarose ^3,7,9. A Figura 1 mostra um exemplo de um esferóide melanoma C8161 após 3 dias em agar. Esferóides C8161 formar esferóides de tamanho regular com um diâmetro de 500-600 mm (média = 565, SD = 19, n = 3) após 3 dias. Outras linhas de células de melanoma que irão formar esferóides incluem: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu .......

Discussion

Análise de imagens semi-automatizado identificou a região G1 presos interior esferóide, proliferando e camadas exteriores. Este método pode ser usado em esferóides vivo usando uma secção óptica, ou em secções fixas esferóides, para identificar mudanças na não só o ciclo celular, mas a expressão do marcador (por imunofluorescência), a morte celular, ou a morfologia das células nestas regiões diferentes. Motilidade celular dentro de diferentes regiões esferóides podem também ser quantificada - se as imagens ao vivo confoc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose baixo ponto de fusão	Life Technologies	16520-050	Para seccionamento
de ágar nobre	Sigma	A5431	Para fazer esferoides
agarose para esferoides	Fisher Scientific	BP1356-100	Para fazer esferoides
0,05% tripsina/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalina	Sigma	HT5014-1CS	CUIDADO: Nocivo, corrosivo. Use Equipamento de Proteção Individual, faça   não fumaça de hálito (aberto em uma hotte).
vivo/morto perto de IR	Life Technologies	L10119
vibratomo	Technical Products International, Inc
copo de coulture	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Molde para seccionamento de esferóides
hemocitômetro	Sigma	Z359629
placa de cultura de tecidos de 96 poços	Invitro	FAL353072
colagenase	Sigma	C5138
microscópio confocal	Leica	TCS SP5
Analisador de citômetro de fluxo	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocidade	PerkinElmer		Software de imagem
flowjo	Tree Star		Software de citometria de fluxo
Graxa de vácuo	Sigma	Z273554
Mídia de montagem	Vetor Laboratórios	H1000
FUCCI (construções comerciais)	Life Technologies	P36238	Apenas transfecção transitória
Filtro de células 70 μ m	In Vitro	FAL352350
Tubos de 5 ml com fundo redondo (estéreis)	In Vitro	FAL352003
Tubos com fundo redondo de 5 ml (não estéreis)	In Vitro	FAL352008