Artigo de método

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

DOI:

10.3791/53494

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28 de janeiro de 2016

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1Center for Nano Science and Technology @PoliMi, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano

Neste artigo

Resumo

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Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Resumo

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As interfaces híbridas entre semicondutores orgânicos e tecidos vivos representam uma nova ferramenta para aplicações in vitro e in vivo. Em particular, os polímeros conjugados apresentam várias propriedades ótimas como substratos para sistemas biológicos, como boa biocompatibilidade, excelentes propriedades mecânicas, tecnologia de processamento barata e fácil e possibilidade de deposição em substratos leves, finos e flexíveis. Esses materiais têm sido empregados para interfaces celulares como sondas neurais, transistores para excitação e registro de atividade neural, biossensores e atuadores para liberação de fármacos. Experimentos recentes também demonstraram a possibilidade de usar polímeros conjugados para modulação totalmente óptica da atividade elétrica das células. Vários casos de estudo in vitro foram relatados, incluindo redes neuronais primárias, astrócitos e células de linha secundária. Além disso, a fototransdução de sinal mediada por polímeros orgânicos demonstrou restaurar a sensibilidade à luz em retinas degeneradas, sugerindo que esses dispositivos podem ser usados para próteses artificiais de retina no futuro. Em suma, os polímeros conjugados sensíveis à luz representam uma nova abordagem para a modulação óptica da atividade celular.

Neste trabalho, são descritas todas as etapas necessárias para fabricar uma interface de biopolímero para excitação óptica de células vivas. A função da interface ativa é transduzir o estímulo luminoso em uma modulação do potencial da membrana celular. Como um caso de estudo, útil para estudos in vitro, um filme fino de politiofeno é usado como camada funcional de absorção de luz, e células de rim embrionário humano (HEK-293) são empregadas como componente biológico da interface. São fornecidos exemplos práticos de controle bem-sucedido do potencial da membrana celular após estimulação com pulsos de luz de duração diferente. Em particular, é mostrado que os efeitos despolarizantes e hiperpolarizantes na membrana celular podem ser alcançados dependendo da duração do estímulo luminoso. O protocolo relatado é de validade geral e pode ser estendido diretamente a outras preparações biológicas.

Introdução

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A possibilidade de manipular a actividade celular com uma resolução espacial e temporal precisa representa uma estratégia importante na investigação neuroscientific e no tratamento de distúrbios neurológicos e psiquiátricos. 1 Os métodos tradicionais são baseados na estimulação eléctrica de células usando eléctrodos posicionado na proximidade ou em contacto com o sistema-alvo, 2 que pode ser de complexidade diferente (célula única rede celular, fatias de cérebro, in vivo tecidos cerebrais). Durante o século passado, o uso de patch-clamp, metal e eletrodos integrados de substrato proporcionaram um quadro detalhado da fisiologia e fisiopa....

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Protocolo

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1. Preparação de Substratos fotoactivos

  1. Prepara-se uma P3HT: PCBM solução (1: 1 w / w) em clorobenzeno a uma concentração P3HT a 20 g / L. Misture a solução com um agitador magnético durante pelo menos 4 h a 60 ° C. Considere-se um volume de 150 ul de solução para cada substrato a ser preparado.
  2. Limpas lâminas de vidro revestido de ITO (R-S = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, espessura 170 um) com lavagens sucessivas de água desionizada, acetona e isopropanol num sonicador (10 minutos para cada etapa). Seque as lamelas com uma arma de azoto. Coloque as amostras em um aspirador de plasma potência de 100 W durante 10 minutos.
  3. D....

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Resultados

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As células podem ser facilmente cultivadas em P3HT: substratos PCBM, desde que uma camada de adesão é depositado adequado (como a fibronectina usado no passo 3.2 do protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorção óptica na parte verde do espectro visível; No entanto, outros polímeros conjugados sensíveis à luz pode ser seleccionada, de acordo com a faixa de comprimentos de onda preferida fotoestimulação (Figura 2). A biocompatibilidade destes substratos foi demonstrada.......

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Discussão

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As etapas críticas do protocolo relatado para in-vitro estimulação óptica de células essencialmente com a escolha do polímero sensível à luz, os parâmetros de esterilização térmica, a intensidade ea duração dos estímulos luminosos. A P3HT: película fina PCBM foi selecionada aqui, uma vez que garante uma boa estabilidade temporal e eletroquímica. No entanto, deve-se notar que nem todos os polímeros sensíveis à luz pode oferecer performances analógicos, 22, mais especificamente, sobre a iluminação. Alé.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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O trabalho foi apoiado pela UE através do projeto FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA,

Telethon - Itália (concessões GGP12033 e GGP14022), Fondazione Cariplo (concessão ID 2013-0738).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
rr-P3HTSigma Aldrich698989-5G
substratos revestidos com ITONano-CSIT10300100
FibronectinaSigma AldrichF1141
clorobenzenoSigma Aldrich319996
PCBMNano-CNano-CPCBM-BF
acetona Sigma Aldrich270725
álcool isopropílicoSigma Aldrich563935
células HEKPadrões LGC srlATCC-CRL-1573
HEPESSigma AldrichH0887
PBSSigma AldrichP5244
E-MEMLGC padrões srlATCC-30-2003
EDTASigma AldrichE8008-FBS
LGC padrões srlATCC-30-2020

Referências

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  1. Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
  2. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
  3. Scanz....

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