Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Resumo

Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Resumo

As interfaces híbridas entre semicondutores orgânicos e tecidos vivos representam uma nova ferramenta para aplicações in vitro e in vivo. Em particular, os polímeros conjugados apresentam várias propriedades ótimas como substratos para sistemas biológicos, como boa biocompatibilidade, excelentes propriedades mecânicas, tecnologia de processamento barata e fácil e possibilidade de deposição em substratos leves, finos e flexíveis. Esses materiais têm sido empregados para interfaces celulares como sondas neurais, transistores para excitação e registro de atividade neural, biossensores e atuadores para liberação de fármacos. Experimentos recentes também demonstraram a possibilidade de usar polímeros conjugados para modulação totalmente óptica da atividade elétrica das células. Vários casos de estudo in vitro foram relatados, incluindo redes neuronais primárias, astrócitos e células de linha secundária. Além disso, a fototransdução de sinal mediada por polímeros orgânicos demonstrou restaurar a sensibilidade à luz em retinas degeneradas, sugerindo que esses dispositivos podem ser usados para próteses artificiais de retina no futuro. Em suma, os polímeros conjugados sensíveis à luz representam uma nova abordagem para a modulação óptica da atividade celular.

Neste trabalho, são descritas todas as etapas necessárias para fabricar uma interface de biopolímero para excitação óptica de células vivas. A função da interface ativa é transduzir o estímulo luminoso em uma modulação do potencial da membrana celular. Como um caso de estudo, útil para estudos in vitro, um filme fino de politiofeno é usado como camada funcional de absorção de luz, e células de rim embrionário humano (HEK-293) são empregadas como componente biológico da interface. São fornecidos exemplos práticos de controle bem-sucedido do potencial da membrana celular após estimulação com pulsos de luz de duração diferente. Em particular, é mostrado que os efeitos despolarizantes e hiperpolarizantes na membrana celular podem ser alcançados dependendo da duração do estímulo luminoso. O protocolo relatado é de validade geral e pode ser estendido diretamente a outras preparações biológicas.

Introdução

A possibilidade de manipular a actividade celular com uma resolução espacial e temporal precisa representa uma estratégia importante na investigação neuroscientific e no tratamento de distúrbios neurológicos e psiquiátricos. ¹ Os métodos tradicionais são baseados na estimulação eléctrica de células usando eléctrodos posicionado na proximidade ou em contacto com o sistema-alvo, ² que pode ser de complexidade diferente (célula única rede celular, fatias de cérebro, in vivo tecidos cerebrais). Durante o século passado, o uso de patch-clamp, metal e eletrodos integrados de substrato proporcionaram um quadro detalhado da fisiologia e fisiopatologia de neurônios individuais e dos mecanismos de funcionamento das redes neurais. No entanto, a estimulação elétrica sofre de limitações importantes. O primeiro está relacionado com uma resolução espacial geralmente pobres devido às dimensões físicas dos eléctrodos e sua geometria fixa, que não pode ser facilmente adaptadopara sistemas complexos organizados como tecidos biológicos. Além disso, os problemas relacionados com a impedância de eléctrodos e de conversas cruzadas entre os sistemas de estimulação e de registo pode deteriorar-se a proporção final de sinal-para-ruído das medições. ³ Por outro lado, o uso de luz para a estimulação pode ajudar a superar muitas limitações da abordagem eléctrica. Primeiro de tudo, oferece espacial sem precedentes (<1 mm) e a resolução temporal (<1 ms), tornando-se possível para atingir tipos celulares específicos ou mesmo compartimentos sub-celulares. Além disso, é altamente não-invasivo, uma vez que evita qualquer contacto físico com o tecido de interesse e disentangles estimulação de gravação. Além disso, tanto a intensidade da luz de comprimento de onda e pode ser regulada com precisão e, consequentemente, diferentes protocolos de estimulação pode ser aplicada. ^3,4

No entanto, a grande maioria das células de animais não apresentam sensibilidade específica à luz. Várias estratégias para stimulatio ópticoN foram assim propostas, quer explorando mediadores moleculares sensível à luz próxima ou no interior das células, ou utilizando um dispositivo fotoactivo colocado externamente, perto da célula. A primeira categoria refere-se a mecanismos endógenos como a estimulação através de (IR) de luz infravermelha ou visível, bem como a utilização quer de compostos photoisomerizable / fotoclivável ou a expressão genética de actuadores moleculares fotossensíveis (Optogenetics). Esta última classe inclui técnicas de estimulação exógena alcançado com o uso de nano / micro-partículas inorgânicas ou substratos de silício fotocondutoras. ⁵ No entanto, todos estes sistemas têm lados e inconvenientes brilhantes. Em particular, a absorção de células endógenas na gama do visível é fraco e não é fiável, e a geração concomitante de espécies de oxigénio reactivas pode ser prejudicial para a célula. Em geral, RI é usado para a indução de aquecimento térmico local, devido à absorção de água, mas o coeficiente de extinção de água é pequena, necessitando assim de rRong luz infravermelha (a partir de dezenas a centenas de W / ^mm2), que é difícil de entregar através de microscopia óptica padrão e podem representar as preocupações de segurança para aplicações in vivo. Por outro lado, os compostos de enjaulamento foto-comutável têm uma ação limitada de tempo e muitas vezes necessitam de luz UV que é difícil de entregar devido à penetração nos tecidos limitado. Além disso, eles sofrem de problemas de difusão dos compostos activada após fotólise fora da área iluminada. Finalmente, ferramentas optogenética permitiram aos cientistas direcionar subpopulação celular específica e sub-compartimentos e estão a emergir rapidamente como uma das tecnologias-chave na pesquisa neurocientífica. No entanto, a inserção de um segmento de DNA exógeno através de um vetor viral levanta questões importantes de segurança, especialmente em vista da adopção, em pacientes humanos. ^5,6 Por estas razões, a investigação sobre novos materiais e dispositivos capazes de manipulação óptica celular é um tema extremamente quente.

Recentemente, um romanceabordagem com base na utilização de polímeros conjugados sensíveis à luz, capaz de transduzir eficientemente um estímulo óptico numa modulação da actividade eléctrica da célula, tem sido proposto. A estimulação das células por Polymer fotoexcitação (CSPP) técnica explora muitas características-chave de habilitação típico de semicondutores orgânicos: são intrinsecamente sensível à luz na faixa visível; ⁷ eles são biocompatíveis, macio e moldável e sua flexibilidade mecânica permite uma interface íntimo com o tecido tanto in vitro e in vivo ^8-10. Além disso, eles podem ser facilmente funcionalizados para uma melhor adaptação à interface com células vivas, e para permitir a excitação específica, sentindo capacidades sondagem e ^11,12. Além disso, eles oferecem suporte electrónico, bem como transporte iônico, tornando-os ideais para a combinação da biologia anúncio eletrônica ^13,14 Curiosamente., eles podem trabalhar no modo fotovoltaico, evitando a necessidade de aplicar um viés externo f¹⁵ ou a estimulação da célula óptica eficiente.

A fiabilidade da técnica CSPP foi anteriormente demonstrada em vários sistemas, incluindo neurónios primárias, ^15,16 astrócitos, ¹⁷ linhas de células secundárias ¹⁸ e tecidos da retina explantados. ¹⁶ Neste trabalho, todos os passos necessários para o fabrico de um bio-polímero sensível à luz de interface ¹⁹ para a estimulação óptico de sistemas in vitro são descritos em detalhe. Como estudo de caso, uma mistura fotovoltaica orgânica prototípico da região regular poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), funcionando como o doador de elétrons, e éster de fenil-C61-butírico-ácido-metil (PCBM), atuando como o receptor de elétrons é empregado. À medida que o sistema biológico, rim embrionário humano (HEK-293), as células são usadas. Um exemplo de um protocolo fotoestimulação com a gravação relativa da actividade das células através de medições electrofisiológicas é fornecido.

A plataforma descritoNo entanto, é de aplicabilidade geral, e pode ser facilmente adaptado para o uso de outros polímeros conjugados (ajustando adequadamente o processo de solução de preparação e os parâmetros de deposição), diferentes tipos de células (por mudar apropriadamente o protocolo de cultura de células, chapeamento procedimento e tempo requerido para semeadura e proliferação celular) e diferentes protocolos de estimulação (comprimento de onda de luz, estímulos de frequência e duração, densidade fotoexcitação).

Protocolo

1. Preparação de Substratos fotoactivos

1. Prepara-se uma P3HT: PCBM solução (1: 1 w / w) em clorobenzeno a uma concentração P3HT a 20 g / L. Misture a solução com um agitador magnético durante pelo menos 4 h a 60 ° C. Considere-se um volume de 150 ul de solução para cada substrato a ser preparado.
2. Limpas lâminas de vidro revestido de ITO _{(R-S =} 10 Ω / sq, 18x18 mm ^2, espessura 170 um) com lavagens sucessivas de água desionizada, acetona e isopropanol num sonicador (10 minutos para cada etapa). Seque as lamelas com uma arma de azoto. Coloque as amostras em um aspirador de plasma potência de 100 W durante 10 minutos.
3. Depositar uma película fina de a camada activa sobre os substratos limpos através de spin-coating.
   1. Com uma ponta de diamante, corte uma lâmina de vidro de microscópio, (≈ espessura 1 mm) para as mesmas dimensões laterais dos substratos revestidos com ITO. Remover o P3HT: PCBM solução de a placa de aquecimento e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente.
   2. Definir um dois-steps programa spin-coater: i) 30 segundos a 800 rpm; ii) 30 segundos a 1.600 rpm. Coloque o slide no mandril do spin-coater e iniciar o vácuo para corrigi-lo. Colocar uma gota de acetona na corrediça e, em seguida, o substrato limpo, com o lado do ITO voltado para cima-revestido. Comece a rotação spin-coater para se livrar do excesso de acetona.
   3. Coloque 150 ul de P3HT: solução PCBM sobre os substratos e começar de novo o spin-coater (usar o mesmo protocolo descrito em 1.3.2).
   4. Após o spin-coater tiver terminado, retire a amostra e retire cuidadosamente o substrato revestido a partir da lâmina de vidro. Limpar a parte de trás do substrato com um cotonete de sala limpa embebido em acetona.
      Nota: Os substratos fotoactivos pode ser armazenado durante alguns dias numa caixa escura até à sua utilização. Para períodos mais longos, mantê-los em uma caixa de luvas com gás inerte.

2. Preparação de Cultura de Células de médio e Eletrofisiologia Solutions

1. Prepara-se o meio de crescimento completo (CGM) paraCélulas HEK-293: Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) inactivado pelo calor não, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Esteriliza-se o meio com um sistema de filtração de 0,2 um e armazenar a 4 ° C.
2. Preparar a solução extracelular em água ultrapura (concentrações em mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 5 HEPES, 10 de glucose, 1,8 CaCl _{2, 1 MgCl2.} Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Esterilizar a solução com um sistema de filtração de 0,2 um e armazenar a 4 ° C.
3. Preparar a solução intracelular em água ultrapura (concentrações em mM): KCl 12, 125 K-gluconato, 1 _de MgCl2, 0,1 _de CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 de _ATP-Na2. Note-se que o ATP-Na _{2 é} sensível ao calor e adicioná-lo pela última vez. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Esterilizar a solução com um sistema de filtração de 0,2 um, da alíquota em tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C.

3. chapeamento HEK-293sobre os substratos Activo

1. Colocar o substrato fotoactivo em um copo de vidro coberto com alumínio ou uma placa de Petri fechada e colocar num forno a 120 ° C durante 2 horas, para a esterilização. A partir desse momento, realizar todas as operações em condições estéreis. Coloque as amostras em uma capa estéril e deixe-os arrefecer.
2. Revestir o substrato fotoactivo com uma camada de adesão para reduzir a hidrofobicidade de superfície e para promover a adesão celular.
   1. Coloque os substratos ativos em uma placa de Petri P35 ou uma placa com múltiplas cavidades 6. Dada a hidrofobia da camada de polímero conjugado, fazer um polidimetilsiloxano (PDMS) também para fixar a amostra e confinar as soluções.
      1. Misturar PDMS e catalisador em uma mistura 10: 1 de proporção com uma vareta de vidro para se obter uma suspensão viscosa.
      2. Verter a suspensão em uma placa com múltiplas cavidades 6, distribuir uma quantidade suficiente para cobrir a metade de cada poço.
      3. Espere por polimerização PDMS em RT.
      4. Corte as PDMS curado no meio para obtaining uma forma quadrada da mesma dimensão da amostra de polímero.
      5. Esteriliza-se o PDMS poços por imersão em uma mistura de etanol-água a 70% durante pelo menos 30 min.
   2. Se bem usando os PDMS, arranhar a camada fotoactivo ao longo de toda a borda do poço com uma pinça de pontas, a fim de evitar o desprendimento da camada inteira quando a remoção do PDMS bem após a cultura de célula.
   3. Cobrir toda a superfície de cada uma das amostras com uma solução de fibronectina (2 mg / L em PBS). Um volume entre 500-750 mL por amostra é geralmente suficiente se um PDMS bem é utilizado (superfície clara do bem: 15x15 mm ^2). Sem o PDMS assim, cerca de 2 ml de solução de fibronectina são necessárias para imergir completamente a amostra; prestar atenção que o substrato não flutua na adição da solução. Incubar as amostras a 37 ° C durante pelo menos 1 h.
   4. Remover a solução de fibronectina com uma pipeta de vidro e lavar uma vez com 2 ml de PBS.
3. PlComeram células HEK-293 em amostras tratadas com fibronectina a uma densidade de 15.000 ^células / cm2 em meio de crescimento completo. Utilizar um volume de 750-1.000 ul de CGM para cada amostra, se um PDMS poço é usado, caso contrário, 2-3 ml de CGM são necessárias. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 24-48 horas.

4. Optical Stimulation Protocolo e Medidas eletrofisiológicas

1. Coloque a solução extracelular num banho de água a 37 ° C a thermalize; descongelar a solução intracelular, colocá-lo em uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 34 e mantê-lo em contato com o gelo para evitar a degradação do ATP.
2. Tomar um substrato revestido de células a partir do incubador e remover cuidadosamente o PDMS bem se presente. Remova o meio de crescimento com uma pipeta de vidro e enxaguar a amostra com solução extracelular. Prossiga lentamente para evitar desprendimento de células.
3. Coloque o dispositivo para dentro do porta-amostras da estação de electrofisiologia com solutio extracelularn eo eletrodo de referência. Preparar uma solução de micropipetas de vidro para patch-clamp com um puxador (resistência ideal é na gama de 2-4 MQ). Encha metade da pipeta com solução intracelular e montá-lo na micromanipulador.
4. Procure uma célula saudável para patch no dispositivo. Para evitar a excitação não desejada do substrato fotoactivo, utilize iluminação IR para a imagiologia, a colocação de um filtro de passagem de comprimento de onda longo (por exemplo, um corte de comprimento de onda λ = 750 nm, pode ser utilizado para os polímeros de absorção no visível) na frente do iluminador microscópio.
5. Remendo da célula seleccionada e aplicar o protocolo desejado para a estimulação óptica através da apresentação de luz para a amostra através do caminho de excitação de fluorescência do microscópio (Figura 1). Uma descrição detalhada do protocolo de patch-clamp podem ser encontrados na referência 20.
   1. Posicionar a pipeta de adesivo em estreita proximidade com a membrana celular com um manipulador micrométrica. Durante o posicionamento, aplicar overpressurE para a pipeta, a fim de evitar a aderência sujidade na ponta. A pipeta deve ser alguns mícrons acima da célula.
   2. Começar a baixar a pipeta para a membrana celular, enquanto controla a resistência pipeta sobre o software de controle de patch. Quando a resistência da pipeta aumentou cerca de 1 mohms, remover a sobrepressão da pipeta durante a aplicação de uma sucção suave, a fim de formar o gigaseal entre a pipeta e a membrana da célula (isto é, a resistência medida deve aumentar para valores superiores a 1 GÊ) .
   3. Aplicar um potencial negativo para a pipeta junto à célula esperado potencial de repouso (por célula HEK293 um potencial de -40 mV podem ser usados) para ajudar a estabilizar o vedante. Compensar os transientes capacitivos devido à capacitância pipeta com os comandos relativos, o amplificador de patch e / ou o software de controlo de remendo.
   4. Quebrar a membrana para permitir o acesso eléctrico para o citoplasma da célula por aplicação de um breve pulso de sucção e intensapara a pipeta. Definir o amplificador de patch para o modo de fixação de corrente (i = 0, ou seja, sem corrente injectada para dentro da célula) para controlar o potencial de membrana celular. Espera alguns minutos para ver se o potencial da célula é estável.
   5. Aplicar o protocolo de iluminação desejado para a célula e registar o efeito sobre o potencial de membrana.
      Nota: A iluminação pode ser entregue à amostra, quer a partir do fundo ou do topo, dependendo da arquitectura do microscópio.
      1. Seleccionar um comprimento de onda de excitação que é bem absorvido pelo material activo; para o P3HT: PCBM mistura, um comprimento de onda na gama de 450-600 nm podem ser usados. Densidades fotoexcitação adequados estão na gama de 10-100 mW / mm ^2.
         Nota: pulsos curtos de luz (abaixo de 10-20 ms) resultam de uma despolarização transiente da célula, enquanto que com iluminação prolongada (centenas de milisegundos ou mais) de pulsos hiperpolarização prolongada é observado até que a luz é desligada.

Resultados

As células podem ser facilmente cultivadas em P3HT: substratos PCBM, desde que uma camada de adesão é depositado adequado (como a fibronectina usado no passo 3.2 do protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorção óptica na parte verde do espectro visível; No entanto, outros polímeros conjugados sensíveis à luz pode ser seleccionada, de acordo com a faixa de comprimentos de onda preferida fotoestimulação (Figura 2). A biocompatibilidade destes substratos foi demonstrada...

Discussão

As etapas críticas do protocolo relatado para in-vitro estimulação óptica de células essencialmente com a escolha do polímero sensível à luz, os parâmetros de esterilização térmica, a intensidade ea duração dos estímulos luminosos. A P3HT: película fina PCBM foi selecionada aqui, uma vez que garante uma boa estabilidade temporal e eletroquímica. No entanto, deve-se notar que nem todos os polímeros sensíveis à luz pode oferecer performances analógicos, ^22, mais especificamente, sobre a iluminação. Alé...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
substratos revestidos com ITO	Nano-CS	IT10300100
Fibronectina	Sigma Aldrich	F1141
clorobenzeno	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetona	Sigma Aldrich	270725
álcool isopropílico	Sigma Aldrich	563935
células HEK	Padrões LGC srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC padrões srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-FBS
	LGC padrões srl	ATCC-30-2020