Análise comparativa da hormona de crescimento humano no soro utilizando SPRI, Nano-SPRI e ELISA Assays

Resumo

O trabalho proposto avalia o potencial de diagnóstico de superfície de ressonância de plasmon de imagem directa e amplificado (SPRI) ensaios, particularmente para a detecção da hormona de crescimento humana recombinante em soro humano cravada, comparando SPRI resulta directamente com comercialmente disponíveis de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) kit.

Resumo

Métodos sensível e selectivo para a detecção da hormona do crescimento humana (hGH) ao longo de uma vasta gama de concentrações (níveis elevados de 50-100 ng ml ^{- 1} e níveis mínimos de 0,03 ng ^ml - ¹⁾ no sangue circulante são essenciais como níveis variáveis ​​possam indicam fisiologia alterada. Por exemplo, perturbações do crescimento ocorrendo na infância pode ser diagnosticada através da medição dos níveis de hGH no sangue. Além disso, o uso indevido de hGH recombinante no esporte não só coloca uma questão ética também apresenta sérias ameaças para a saúde do abusador. Uma estratégia popular para a medição de hGH uso indevido, baseia-se na detecção da relação de 22 kDa hGH e hGH total, os níveis endógenos de 22 kDa não cair depois de hGH (rhGH) administração recombinante exógena. Superfície de ressonância de plasma de imagem (SPRI) é uma ferramenta analítica que permite o monitoramento e visualização de interações biomoleculares direto (sem rótulo) através da gravação de alterações da ind refraçãoex adjacente à superfície do sensor em tempo real. Em contraste, o método colorimétrico mais frequentemente utilizados, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) utiliza anticorpos de detecção marcado enzimaticamente para medir indirectamente a concentração do analito após a adição de um substrato que induz uma alteração de cor. Para aumentar a sensibilidade de detecção, amplificado SPRI usa um formato de ensaio sanduíche e infravermelho próximo pontos quânticos (QDs) para aumentar a força do sinal. Após a detecção direta da SPRI recombinante rhGH no soro humano espetado, o sinal SPRI é amplificado pela injeção sequencial de anticorpo de detecção revestido com infravermelho próximo QDs (Nano-SPRI). Neste estudo, o potencial de diagnóstico de SPRI directa e amplificado foi avaliada para medir o rhGH cravado no soro humano e comparado directamente com as capacidades de um kit de ELISA comercialmente disponível.

Introdução

Hormona de crescimento humano (HGH) é um péptido de 191 aminoácidos (22 kDa) produzida pela glândula pituitária e libertado directamente para a corrente sanguínea. As interações entre o eixo hipotálamo crescimento peptídeo liberador do hormônio hormônio (GHRH) e somatotropina induzir secreções pulsátil de hGH. Como resultado, os níveis de hGH pode variar de elevações nas 50-100 ng / ml a baixos na gama de 0,03 ng / ml ^1. A deficiência ou o excesso de hGH no corpo pode provocar uma vasta gama de sintomas fisiológicos anormais. Por exemplo, os níveis de excesso de hGH pode levar à diabetes e gigantismo ^{2 3.} Empobrecido níveis de hGH causar baixa de açúcar no sangue em recém-nascidos, e fraca densidade óssea e depressão em ^adultos 4.

A administração da forma de hGH recombinante (rhGH) melhora a massa muscular magra, enquanto a redução da gordura corporal. Como tal, esta substância se tornou a droga de escolha para atletas profissionais e amadores, uma vez que melhora a força física que confere um advantage em esportes competitivos. rhGH é proibida pela Agência Mundial Antidoping ^(WADA) 5,6 e muito esforço por pesquisadores internacionais tem sido focada em desenvolvimento de testes que podem detectar a sua presença ou efeito anabólico.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tem sido o método preferido para a determinação da hGH no sangue total ^7. Embora, ELISA é uma técnica confiável oferecendo boa sensibilidade e seletividade, é relativamente tempo e mão de obra intensiva. Em adição, a ELISA se baseia na detecção indirecta de hGH através do emprego de etiquetas enzimáticas. Em contraste, a ressonância de plasmon de superfície (SPR) permite a detecção de hGH directamente sem o uso de etiquetas em tempo real. O princípio de detecção de SPR por trás envolve uma superfície de detecção constituído por um prisma que está revestido com uma camada fina de metal (ouro ou prata); quando uma luz monocromática polarizada interage com a superfície metálica, "plasmons de superfície" são gerados. A ligação de um analitoa um receptor de superfície imobilizada na superfície do metal perturba as condições de ressonância, resultando em um mergulho de ressonância deslocada, que pode então ser correlacionado com a concentração do analito. Biosensores baseados em SPR agora estão comercialmente disponíveis que oferecem um real-time, técnica livre etiqueta para monitorar os eventos de ligação biomoleculares e reações bioquímicas ^8-10. Mais recentemente, SPRI foi desenvolvido em resposta à necessidade de multiplexação (ou seja, monitorando simultaneamente múltiplos eventos de ligação), o que não era possível em biossensores SPR clássicos. Assim, SPRI tem emergido como uma ferramenta para monitorar vários eventos de ligação simultaneamente. SPRI sistemas atuais são baseados em imagens microscópicas de uma superfície que é excitada com luz em um ângulo de ¹⁰ e comprimento de onda específico. A imagem é, então, capturado num dispositivo (CCD) matriz de acoplamento de carga.

Até à data, tem havido poucos ensaios baseados em SPR desenvolvidos para detectar hGH ^11-14. Uma estratégia particular, Conhecido como o método de isoforma ^15, baseia-se na detecção da relação de 22 kDa hGH e hGH total, os níveis endógenos não-22 kDa cair após a administração exógena de rhGH. Recentemente, de Juan-Franco et ai. Em ^{11 relataram} o desenvolvimento de um imunossensor baseado em SPR para a detecção selectiva da 22 kDa e 20 kDa isoformas da hGH em amostras de soro humano. Os anticorpos monoclonais específicos para cada uma das isoformas foram imobilizadas directamente sobre o sensor ouro permitindo a medição de ambas as isoformas simultaneamente numa única injecção com um limite de detecção de 0,9 ng mL ^-1. Alternativamente, SPR tem sido utilizado para rastrear anticorpos com especificidade elevada para a hGH ^13. Se a concentração do analito alvo desce abaixo do limite do sistema SPRI de detecção (16-19 para vIVERSOS tipos de analitos e superfícies.

Neste trabalho, o potencial de análise de biossensores baseados SPRI e Nano-SPRI foi examinada, em particular para a detecção de rhGH no soro humano cravado, e comparação da sua capacidade de detecção de ELISA directa. Os seguintes parâmetros serão examinados e considerados: tempo de detecção, sensibilidade, perfil cinético, reprodutibilidade e especificidade.

Protocolo

1. Preparação de Soluções e amostras de proteína para SPRI

1. Prepare a 100 ml de solução de baixo teor de sal de tampão fosfato salino (PBS) contendo 10 mM de fosfato, cloreto de sódio 150 mM, e pH 7,4.
2. Preparar 50 ml de uma solução de elevado teor de sal de PBS contendo 10 mM de fosfato, cloreto de sódio 750 mM, e pH 7,4.
3. Prepare 5 ml de acetato de sódio 10 mM.
4. Preparar um stock de 5 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) diluída em solução PBS de baixa concentração salina.
5. Prepara-se uma solução estoque de hormona de crescimento humano recombinante (rhGH) a uma concentração de 1 ug / mL em solução de PBS baixo teor de sal.
6. Preparar soluções de reserva de anti-rhGH e o anticorpo de controlo negativo, a uma concentração de 100 ug / ml.

2. Prepare SPRI Chip para matriz de anticorpo

1. Limpar o chip por ultra-sons em 120 mL de solução piranha estabilizado (3: 1 de ácido sulfúrico concentrado a 30% de peróxido de hidrogénio) durante 90 min a 50 ° C e segue por enxaguamentoe sonicação com água durante 5 min. Em seguida, enxágüe chip com etanol e seco, com corrente de azoto.
2. Colocar o chip de ouro numa câmara de UV / ozono durante 30 min para remover quaisquer contaminantes.
3. Adicionar 150 mg de ácido 11-mercaptoundecanóico a 20 ml de etanol num tubo de ensaio que contém uma barra de agitação e uma tampa do tubo.
4. Coloque chip no tubo de ensaio e tubos de microondas / chip a 50 W e 50 ° C durante 5 min.
5. Enxágüe chip com etanol e mergulhar em etanol durante 5 min.
6. Siga por uma lavagem com água e molho em água por 5 min.
7. Adicionar 150 mg de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida e 20 ml de água num tubo de ensaio que contém uma barra de agitação e uma tampa do tubo. Chip de microondas como no passo 2.4.
8. Lavar com água e chip de molho em água por 5 min.
9. Adicionar 150 mg de N-hidroxissuccinimida em 20 ml de água num tubo de ensaio que contém uma barra de agitação e uma tampa do tubo. Chip de microondas como no passo 2.4.
10. Lavar com água e chip de molho em água por 5 min.
11. Prepare polietileno glicol 250 uM (PEG, de 800 Da) em 20 ml de água num tubo de ensaio que contém uma barra de agitação e uma tampa do tubo. Chip de microondas como no passo 2.4.
    Nota: Microwaving PEG800 na superfície do sensor é realizada como um passo de bloqueamento para impedir a ligação não específica de proteínas séricas e complexos de quantum dot usado mais tarde na experiência. Isto é conseguido através PEG800 reagir com sítios nua ouro não-ocupados no chip.
12. Lavar com água e chip de molho em água por 5 min.
13. Prepare a 15 ug / ml de anti-rhGH solução de anticorpo de controlo negativo e solução de anti-imunoglobulina G (IgG anti-) e adicionar 10 ul de cada solução de anticorpo a um poço na placa de 384 cavidades.
14. Projetar o padrão de manchas na microarrayer (4 x 7 quadrantes para cada amostra) e chip local com anticorpos usando um 500 mm Teflon pino derrubado.
15. Incubar chips manchado durante 2 horas à temperatura ambiente e sob uma atmosfera húmida de 75% ou superior.
16. Enxágue e mergulhe em água por chip de5 min. Então, Chip Dry com corrente de azoto.

3. SPRI configuração da experiência e Bloqueio

1. Inicializar o instrumento e selecione diretório. Escolha de câmara em tempo real e ligar a bomba de seringa a 1 ml / min para 10 ml de água desgaseif içada. Inserir o chip no instrumento e manter a água até que todas as bolhas de injectar são removidos.
2. Depois de enxaguar chip com 10 ml de água, iniciar a aquisição de imagem, e segue, alternando o tampão de baixa concentração salina PBS e permitir que ele seja executado a 1 ml / min para 5 ml e taxa de fluxo, em seguida, abrandar a 20 ul / min durante 20 min .
3. Seleccionar a imagem de alto contraste, que mostra os anticorpos imobilizados manchado no chip.
4. Selecionar e definir os 400 mm manchas circulares individuais correspondentes aos anticorpos imobilizados.
5. Após o instrumento rastreia as curvas de plasmons, escolha um ângulo de trabalho que tem a maior inclinação nas curvas de refletividade.
6. Fluxo de um tampão de corrida a 20 mL / min de baixas salt PBS através do sistema até que o sinal de todos os pontos seleccionados estabiliza.
7. Carregar a BSA (100 ug / ml) em tampão de corrida para o circuito de amostra (150 ul) com a válvula de injecção na posição de carga. Em seguida, alternar a válvula para a posição de injecção para injectar a solução para a célula de fluxo.
   Nota: A BSA é injectado para se ligar covalentemente a superfície reactiva a amina, o remanescente de BSA não ligado vai lavar a superfície por meio de lavagem com tampão.
8. Injectar 150 ul de uma solução de acetato de sódio 10 mM ao longo da superfície e seguir por uma injecção de 150 ul de PBS elevado teor de sal.
9. Injectar 150 ul de etanolamina (1 mM) para desactivar superfície reactivo a amina.
10. Injectar 150 ul de acetato de sódio 10 mM para lavar a superfície.
11. Em seguida, mudar o tampão de corrida de PBS com 50 ug / ml de BSA a uma taxa de fluxo de 250 mL / min durante um total de 5 ml.
    Nota: 50 ug / ml de BSA é adicionada ao tampão de operação para bloqueio adicional do surrosto por não-covalentemente ocupando os sítios não específicos, e isto é feito para reduzir ainda mais a ligação não específica de proteínas à superfície do soro.
12. Alterar a taxa de fluxo de 5 uL / ​​min e permitir que a estabilizar durante 20 min.

4. Detecção SPRI de Hormônio do Crescimento Humano

1. Prepara-se uma solução de uma concentração conjunto de rhGH (30.000 pg / ml; 250 pg / ml; 25 pg / mL; 2,5 pg / ml e 0,25 pg / ml) em 10% de soro e diluiu-se em PBS contendo 1 mg / ml de BSA.
2. Prepara-se uma solução de 2: 1 por adição de 1 ml de marcado com biotina anticorpos de detecção anti-rhGH (6 mM) a 3 mL de estreptavidina revestidas perto de infravermelhos quantum dots (1 uM) em um tubo de 0,5 mL de microcentrífuga e incubar durante 30 min para o acoplamento eficaz .
3. Injectar 150 ul da solução de hGH cravado soro humano no circuito de injecção. Isto resulta em forte aumento de sinal seguido por uma queda lenta a partir do soro não especificamente ligada de enxaguar a superfície.
4. Uma vez que o sinalai estabiliza, lava-se a superfície com uma solução de 450 mM de cloreto de sódio adicionado ao tampão de corrida.
5. Dilui-se a solução de detecção de anticorpos anti-rhGH e quantum dots a uma concentração de 10 nM (2: 1) com tampão de corrida (PBS com 50 ug / ml de BSA) e injectar dentro da célula de fluxo.

5. SPRI Análise de Dados

Nota: Após a injecção da rhGH cravado soro humano e potenciador quantum dot, um aumento na reflectância mudança ocorre devido à mudança das curvas amplificado plasmon. Isto resulta uma imagem de diferença que mostra uma imagem em escala de cinza correlacionando com o sinal de no chip.

1. Importar os dados para um programa de análise de dados. Representar graficamente o sinal SPRI (% reflectividade) em função do tempo (s) e determinação da diferença entre a rhGH e anti-manchas negativas para anticorpos de controlo após a lavagem de alto teor salino.

6. ELISA Protocol (Dia 1)

1. Armazenar todos os componentes do ensaio incluído in o kit ELISA rhGH a 2-8 ° C. Isto inclui o anticorpo anti-rhGH placas revestidas assim, os padrões (0-5) em soro de ovelha, controlos (1 e 2) no soro humano, tampão conjugado, (200x) de tampão de lavagem, o cromogénio TMB (tetrametilbenzidina) e parar de reagente.
2. Configuração dos reagentes e seguir os métodos, tal como descrito no protocolo do kit de ELISA comercial.
3. Em primeiro lugar, permitem que o anticorpo anti-rhGH revestido 96 poços a aquecer até à temperatura ambiente antes de abrir a embalagem de película metálica.
4. Em seguida, retire o número desejado de tiras de 8 poços para o ensaio e feche a embalagem de protecção com os restantes poços e conservar a 2-8 ° C.
5. Preparar padrões por reconstituição em 2 ml de água destilada para padrão # 0, em 1 ml de água destilada para padrões (1-5), e em 1 ml de água destilada para os controlos (1 e 2). Abaixo está uma tabela das concentrações correspondentes dos padrões e controles (Tabela 1):

Padrões	Concentração (ng / ml)
0	0
1	0,17
2	0,94
3	2.63
4	10,4
5	26,9
Controle # 1	1,22 ± 0,33 ng / ml
Controle # 2	4,97 ± 1,25 ng / ml

Tabela 1. Concentrações dos padrões e controlos incluídos no kit de ELISA comercial.

6. Preparar as amostras que consistem em a hormona de rhGH em 10% de soro humano em concentrações que se seguem (Tabela 2):

Amostra	Concentração (ng / ml)
1	0,025
2	0,2
3	0,5
4	2.5
5	10
6	30

Tabela 2. Concentrações de rhGH as amostras preparadas em 10% de soro.

7. Adicionar 50 ul de cada padrão, de controlo e de amostra a cada poço (em triplicado). Selar os poços e incubar com as normas, controles e amostras de rhGH O / N a 4 ° C, sob agitação suave.

7. ELISA Protocol (Dia 2)

1. Remova a placa do agitador e permitir que ele se aquecer até à temperatura ambiente (15-20 min) antes de começar o ensaio.
2. Remova o Anti-rhGH-HRP, tampão conjugado, tampão de lavagem (200x), cromogénio TMB (tetrametilbenzidina), umd reagente de paragem a partir do frigorífico e deixar aquecer até à temperatura ambiente.
3. Preparação de reagentes: (de acordo com as especificações do fabricante)
   1. Diluir o anti-rhGH-HRP 40x com o tampão de conjugado. Preparar o tampão de lavagem por diluição 200x com água destilada.
4. Adicionar 50 ul de conjugado anti-rhGH-HRP a cada poço, vedar os poços e incubar à TA durante 30 min, agitando suavemente.
5. Decantar a solução dos poços e inverter a placa e bater seco sobre um papel absorvente. Em seguida adicionar 200 ul de tampão de lavagem em cada poço.
6. Decantar a solução de lavagem e toque seco sobre um papel absorvente. Repita este passo 3 vezes.
7. Adicionar 100 ul de cromogénio em cada cavidade dentro de 15 minutos após o passo de lavagem. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro, agitando suavemente. As soluções virar de incolor a azul.
8. Adicionar 100 uL de reagente de paragem a cada poço. As soluções mudam de azul para amarelo. Imediatamente, leia the absorvância de cada poço a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
9. Traçar a curva padrão para as normas previstas (0-5). Em seguida, traçar a densidade óptica da rhGH em amostras de soro de 10% em função da concentração de cada amostra.

Resultados

O desempenho de SPRI e Nano-SPRI (SPRI empregando os NanoEnhancers) foi comparada com o ELISA para a detecção de rhGH num ambiente complexo. As diferenças na configuração destes métodos são descritos aqui brevemente. Para SPRI (detecção directa, figura 1), o anticorpo de captura é imobilizado na superfície e, em seguida, a amostra é injectada e a ligação do analito à superfície do detector é medida directamente e em tempo real e de maneira livre de marcador. No entanto, com nano-SPRI (Figura 1), depois de a substância a analisar liga-se à superfície do sensor, uma injecção consecutivo é seguido com pontos quânticos revestidos com anticorpos de detecção para amplificar o sinal SPRI.

Figura 1. Uma representação esquemática comparando-modo direto (SPRI) e de modo amplificado (Nano-SPRI) de detecção de rhGH em c amostras rude. ligandos (rhGH ou IgG anticorpos específicos) foram imobilizadas num formato de matriz no biochip SPRI. Proteína alvo (rhGH) cravado no soro humano introduzido à superfície do sensor são detectados diretamente (SPRI) e sequencialmente com destaque NanoEnhancers (Nano-SPRI). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tal como para o ELISA, as placas com múltiplas cavidades chegam já pré-funcionalizado com o anticorpo de captura e, em seguida, é introduzido amostra, o analito de interesse se ligará. Um anticorpo de detecção é introduzido, seguido pela adição de substrato. A densidade óptica é medida a 450 nm. Neste estudo, um kit comercial de ELISA (Figura 2) foi usada para medir a rhGH cravado em 10% de soro humano.

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Figura 2. Representação esquemática do processo de ensaio de ELISA. proteína de rhGH (ovais azul) é introduzido para poços que foram pré-funcionalizado com anticorpos monoclonais específicos (amarelo) de rhGH. Interacções não específicas são eliminados por lavagem dos poços com tampão de lavagem, seguido pela introdução de um anticorpo de detecção prefunctionalized com peroxidase de rábano (HRP, roxo). A solução vai mudar de cor após a adição do substrato tetrametilbenzidina (TMB, ouro). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 representa a curva de titulação de rhGH cravado em 10% de soro humano e é representada graficamente contra a densidade óptica obtida a 450 nm. Uma boa resposta linear foram observadas e o limite de detecção foi determinado como sendo de 1 ng / ml. O coeficiente de variation (CV) foi de 6,5%, sugerindo boa reprodutibilidade.

Figura 3. ELISA Análise de dados. A concentração de rhGH cravado no soro é plotado contra o OD obtidos a 450 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, a detecção de rhGH cravado no soro humano foi avaliada com SPRI. A detecção directa de rhGH resultou com a curva de gradiente de concentração correspondente (Figura 4), ​​cada ponto representa o valor médio da diferença de reflectividade calculado a partir SPRI três curvas cinéticas para cada concentração. O limite de detecção (LOD) foi determinado como sendo 3,61 ng / ml. O ensaio de detecção direta SPRI foi altamente reprodutível como o CV do ensaiofoi apenas 4,1%.

Figura 4. Detecção directa de hGH SPRI cravado em 10% de soro humano. A trama normalizada SPRI cinética resultante depois da injecção de diversas quantidades de hGH cravado no soro humano, seguido pela injecção de um tampão de alto teor salino (linha vertical a tracejado) para remover não interações espec�icos. A curva de gradiente de concentração que representa a ligação de várias quantidades de hGH cravado no soro humano para a superfície do sensor que foi prefunctionalized com biotinilado específico-hGH-anticorpo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para aumentar a sensibilidade do biossensor SPRI, NanoEnhancers (QDs pré-funcionalizado com anticorpos de detecção) são sequencialmenteintroduzidas à superfície do sensor, a fim de evidenciar a presença de rhGH cravado no soro humano. Após subtracção do fundo, os NanoEnhancers foram capazes de amplificar a resposta biossensor até 7,9%, no entanto, com o mínimo sinal de mudança (imunoglobulina G (IgG) anticorpo específico, a mudança de 0,38% em reflectividade; Figura 5 em regiões controladas de interesse da imagem latente. a superfície do sensor revelou que apenas as regiões de interesse que têm anticorpos específicos rhGH imobilizado experiência da maior variação do contraste corroborando diretamente com a resposta sensorgrama cinética.

Figura 5. Detecção de rhGH utilizando um ensaio de sanduíche cravado em 10% de soro humano. SPRI trama cinética depois da injecção de rhGH (30 ng / ml) em tampão (10 mM PBS, cloreto de sódio 150 mM, pH = 7,4) para um pré chip de -functionalized com ácido 11-mercaptoundecanóico / rhGH-anticorpo específico e controle dos anticorpos IgG depois bloqueadas com BSA seguido pela adição de detecção revestidas com anticorpo pontos quânticos (NanoEnhancers). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstrar a praticabilidade do biossensor Nano-SPRI, a faixa de medição de rhGH em amostras brutas foi avaliada. Uma gama de trabalho prolongado de 30.000 pg / ml a 0,25 pg / ml resultou como resposta à adição de NanoEnhancers (Figura 6). É importante notar que cada ponto na curva de titulação é feita a média de três experiências independentes. Consequentemente, o limite inferior de detecção foi calculada como sendo de 9,20 pg / ml e o coeficiente de variação foi de 20%.

Figura 6.Nano-SPRI detecção de hGH cravado no soro humano. SPRI representação cinética Normalizada trama de sinal hGH_specific_Anti-QDs-amplificado para amostras de soro humano enriquecida com diferentes concentrações de hGH. Uma linha vertical tracejada (cinzento) representa o ponto de injecção do tampão de corrida. (b) Uma curva de gradiente de concentração que representa a ligação de NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) depois da injecção de diversas quantidades de hGH cravado no soro humano à superfície do sensor que foi prefunctionalized com ácido 11-mercaptoundecanóico / hGH anticorpo específico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, a modificação que ocorre na curva de ref lectividade de SPR como uma função da concentração foi comparado entre o directa e o método de bioensaio NanoEnhancer (Figura 7). Para o direto detécnica de protecção entre 25 e 0,25 pg / mL, o sinal começou a estagnar e isto não é surpreendente uma vez que estas concentrações de cair abaixo do limite de detecção de 3 ng / ml (Figura 7). Da mesma forma, para a técnica de amplificação, concentrações inferiores a LOD de sinal de 9,2 pg / ml começou a planalto e mostraram praticamente nenhuma variação.

Figura 7. Uma análise comparativa da SPRI com nano-SPRI. Este gráfico de barras que ilustra a percentagem de variação da reflectividade (% R), após a introdução de rhGH cravado no soro humano (detecção directa) seguida pela injecção de detecção amplificado (NanoEnhancers) para 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml e 0,25 pg / ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, a especificidade do biossensor Nano-SPRI foi avaliada. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) no soro humano cravado foi injectada como um controle uma vez que a hGH estimula a secreção de IGF-1 através do receptor de hormona de crescimento na membrana do hepatócito. Depois da injecção do IGF-1 no soro, os NanoEnhancers foram sequencialmente injectadas e a resposta do sinal de SPR não mostrou qualquer ligação específica (Figura 8). No entanto, quando rhGH cravado na amostra de soro foi injectada para o mesmo local funcionalizado com rhGH anticorpo, o aumento do sinal foi observado. Em conclusão, a plataforma Nano-SPRI demonstrou excelente especificidade e selectividade para a rhGH.

Figura 8. Avaliação dos nano-SPRI selectividade para rhGH. A resposta biossensor Nano-SPRI depois da injecção de rhGH (preto) e IGF-1 (vermelho) em sPiked soro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A análise de correlação foi realizada através do coeficiente de correlação de Pearson para determinar a correlação entre a intensidade do sinal SPRI e ELISA valores de densidade óptica (Figura 9). Um valor de p <0,01 foi considerado significativo. Tal como ilustrado neste gráfico, há uma boa correlação entre os níveis de rhGH no soro humano cravado medidos por SPRI e ELISA. O valor de r era 0,9263 para 9 diferentes amostras.

Figura 9. A análise de correlação de Pearson entre ELISA e Nano-SPRI. A trama correlaciona-se a intensidade do sinal Nano-SPRI (eixo-y) com valores de densidade óptica de ELISA (eixo x). (Perasno coeficiente de correlação n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A constante de equilíbrio de dissociação (K _D) foi determinada utilizando o software GraphPad por ELISA. O valor de K _D calculada foi de aproximadamente 79 nM (Tabela 3). Os em (K _{a) e} fora (K _d) as taxas não pôde ser determinada através de ELISA. No entanto, utilizando o software de análise de dados, o método de detecção directa resultou com valor K _D, de 23 pM utilizando a massa molecular de 22 kDa, que corresponde a uma molécula de rhGH. O ligar e desligar as taxas foram calculadas para ser de 6,1 x10 ⁷ M ^{-1 s} -1 e 1,33 x 10 ^-3 s ^-1, respectivamente. Este inerentemente traduz que 0,13% da decadência rhGH e complexos anticorpo por segundo. Tal como para o ummplified SPRI experimento, foi observada uma interação global mais forte entre NanoEnhancers e rhGH como a afinidade de ligação calculada foi determinada como sendo 16:03. Além disso, uma velocidade de associação mais forte foi observada para NanoEnhancers e rhGH do que o anticorpo de captura / rhGH, no entanto, a taxa de dissociação sugere que 0,26% de NanoEnhancer / rhGH / anticorpo de captura deterioração por segundo.

Método	K D (Affinity)	K um (taxa on-)	K d (off-rate)	LOD
ELISA	79,45 x 10 -9 M	N / D	N / D	1 ng / mL
SPRI	23,2 x 10 -12 M	6,1 x 10 7 M -1 seg -1	1.33 x10 -3 seg -1	3,61 ng / ml
Nano-SPRI	4,33 x 10 -12 M	7,54 x10 8 M -1 seg -1	2,62 x10 -3 seg -1	0,0092 ng / ml

Tabela 3. Análise cinética de dados completa. Avaliação da afinidade, a taxa de associação e a taxa de dissociação das respostas de anticorpos utilizando GraphPad (ELISA) e análise de dados de software (SPRI e Nano-SPRI). A determinação da avidez usando a massa molecular de 22 kDa, que corresponde a uma molécula de rhGH foi escolhido. Os limites de detecção foram determinados para todos os três estudos usando o Excel.

Discussão

Níveis irregulares de hGH, uma hormona que ocorre naturalmente, tem sido associada a numerosas desordens médicas que afectam o crescimento e desenvolvimento humano. Além disso, a administração exógena de rhGH é normalmente utilizado por atletas, embora seja proibido, tal como um agente de dopagem para aumentar o seu desempenho. Desafios na detecção de resultado utilização indevida rhGH da dificuldade em distinguir exógena hGH de forma endógena. Como tal, a técnica actual aprovado para a detecção de hGH exógena baseia-se na medição da relação entre a hGH de 22 kDa isoforma em relação à isoforma de 20 kDa. Desde as demandas de teste isoform para a medição de múltiplos hGH isoformas simultaneamente dentro de um curto período de tempo em uma ampla gama de concentrações, por isso, considerou-se a plataforma de SPRI como uma combinação perfeita. Além disso, o nível de hGH endógena flutuar a um nível muito baixo (0,03 ng / ml) na corrente sanguínea, por conseguinte, o sistema de detecção deve ser capaz de medir esta gama confortavelmente com alta specificity. Como resultado, nós também investigada neste estudo o potencial de Nano-SPRI como uma ferramenta de diagnóstico para hGH e comparou-o diretamente com SPRI e imunoensaio ELISA clássico.

Com base nos resultados obtidos a partir deste estudo, a principal vantagem do método SPRI e Nano-SPRI é que as concentrações de rhGH pode ser medido de uma forma mais rápida em comparação com o método mais convencional de ELISA. A duração padrão para medição dos níveis de rhGH em uma amostra com o método directo de detecção era de 1 hr ao passo que o nano-SPRI necessário 2 h, devido aos passos adicionais no processo. Em geral, as experiências com SPRI e Nano-SPRI, antes da injecção de uma amostra, um passo de calibração é altamente recomendável. Além disso, a injecção de uma amostra em bruto como resultados de soro humano em algumas interacções não específicas, como resultado, é imperativo para injectar um tampão de lavagem a alta sal só revelam interacções específicas. Também é importante notar que uma etapa de lavagem é absolutamente necessárioapós a introdução de moléculas de bloqueio para a superfície do sensor, para remover moléculas não ligadas. Tal como para os requisitos de tempo de ELISA são muito maiores (~ 16-18 h) para a análise de uma amostra. É necessário um tempo de incubação mais longo como a sensibilidade do ensaio é aumentada especialmente para este estudo, como o foco foi comparar o limite inferior de detecção.

A escolha de uma química de superfície pode variar de uma aplicação para outra e isto poderia ser realizado como uma limitação da técnica da SPRI. Neste estudo, uma ampla gama de ligantes e combinação de produtos químicos e as moléculas de bloqueio foram avaliadas para conseguir a combinação direita, a fim de observar a eficiência de ligação óptima de rhGH à superfície do sensor. Por exemplo, no presente estudo, a combinação de BSA e PEG serviu também para minimizar interacções não específicas. No entanto, num estudo anterior ^17, em que o ligando de captura era um aptâmeros, PEG sozinho serviram como o melhor molécula de bloqueio. As variáveisque afectam a eficiência de ligação do analito ao ligando também é dependente do pH, tampão e temperatura. Portanto, com qualquer aplicativo, essas variáveis ​​precisam ser otimizados. Além disso, é crítico para determinar a concentração óptima de mancha do ligando à superfície do chip. Uma experiência de titulação com uma gama de concentrações de ligandos imobilizados é realizado antes de se iniciar o estudo. Quanto ELISA, uma etapa crucial no procedimento foi a decantar o tampão de lavagem dos poços batendo a microplaca como esta garantida nenhum líquido residual é sobra. Remover o tampão de lavagem com pipeta não foi suficiente como qualquer líquido residual interferiu com a leitura do sinal da amostra-alvo.

Em referência à sensibilidade, ELISA (1 ng / ml) é comparável à SPRI (3,61 ng / ml) mas nano-SPRI (9,20 pg / ml) melhora a sensibilidade por três ordens de magnitude, permitindo assim medições nos níveis biológicos inferiores de rhGH 0,03 ng / mL. Como já relatado anteriormente ¹6,17, o aumento do sinal transmitido pelo NanoEnhancers é atribuída a um efeito de carga em massa e o forte acoplamento que existe entre fluorophores NIR e propagando os plasmons de superfície para nanoestruturas película de ouro. Mesmo assim, Nano-SPRI adiciona um passo extra para o procedimento, este nível de sensibilidade pode alargar as aplicações da tecnologia SPRI em vários pontos de venda.

SPRI proporciona aos cientistas um perfil completo cinética (K _D, K e _um K _d) do anticorpo interação / rhGH Considerando ELISA pode relatar apenas os valores de afinidade. O coeficiente de variação (CV) foi inferior a 10% para SPRI (4,1%) e ELISA (6,5%), sugerindo boa reprodutibilidade. Os valores de afinidade e ELISA SPRI são diferentes porque os anticorpos de captura imobilizadas no chip do sensor são diferentes de anticorpos imobilizados no ELISA de 96 poços da placa. Quanto Nano-SPRI um valor CV elevado (20%) foi observada. Existem vários parâmetros que podem contribuir como uma fonte de Errors para determinação CV. Por exemplo, com o experimento Nano-SPRI uma concentração muito menor de analito a ser medido é, a adição de NanoEnhancers adiciona mais um passo no processo e a experiência foi realizada manualmente. Uma boa correlação entre nano-SPRI e ELISA foi atingida para a detecção de rhGH no soro humano cravado. Finalmente, ELISA pode ser uma técnica de confiança no entanto, o próprio método é demorado, o que torna difícil a sua utilização em situações que requerem a monitorização em tempo real e de multiplexagem, como é o caso com a hGH. Além disso, uma característica mais atraente que não foi investigada neste estudo directamente SPRI que oferece mais de ELISA, é a capacidade de medir simultaneamente centenas de interacções em tempo real. Portanto, no futuro, método Nano-SPRI serão avaliados para detectar biomarcadores múltiplos, simultaneamente, em tempo real (multiplexing) presentes no soro em várias concentrações a fim de examinar o seu potencial como uma ferramenta de diagnóstico clínico viável.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Somatotropina Hormônio do Crescimento (GH1) captura anticorpo	Anticorpos Acris	DM1015
Soro Bovino Albumina	Biorreagentes Fisher	BP671-10
Anticorpo de detecção de hormônio do crescimento de somatotropina marcado com biotina (GH1)	Anticorpos Acris	AM09304BT-N
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida	TCI America	D1601
Etanolamina	Acros Organics	141-43-5
Etanol	Fisher Chemicals	BP2818-4
Kit ELISA HGH Humano	invitrogen
Soro Humano	Sigma Aldrich	H4522
Anticorpo IgG de Coelho	Sigma Aldrich	I5006
Ácido 11-mercaptoundecanóico	Sigma Aldrich
Nanostrip	Cyantek
N-hidroxisuccinimida	Sigma Aldrich
Tampão de fosfato salina	Invitrogen	00-3002
Polietilenoglicol (800 Da)	Sigma Aldrich
Hormônio do Crescimento Humano Recombinante	Calbiochem	869008
Acetato de Sódio	Sigma Aldrich	127-09-3
Cloreto de Sódio	Fisher Chemicals	7647-14-5
Pontos quânticos de infravermelho próximo revestidos com estreptavidina	Tecnologias de Vida
Limpador de Ozônio e UV	Bioforce Nanosciences
Reator de micro-ondas	CEM Corporation		Descubra o sistema
SPRi-Arrayer	Sistema de Microarray LabNext Xactll
Biochip SPR	HORIBA
Leitor de microplacas multimodo SPRi-Lab+	HORIBA
Synergy Mx	BioTek
Software de análise de dados	ScrubberGen	HORIBA