Method Article

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

DOI:

10.3791/53510

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January 20th, 2016

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1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

In This Article

Summary

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Identificar os alvos diretos de moléculas-alvo do genoma permanece um grande desafio. Para compreender como as moléculas de ligação de ADN envolver o genoma, foi desenvolvido um método que se baseia em ligação cruzada de moléculas pequenas para isolar cromatina (cósmica).

Abstract

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O genoma é o alvo de alguns dos mais eficazes agentes quimioterapêuticos, mas a maior parte destes fármacos não têm especificidade de sequência de ADN, que conduz a toxicidade dose-limitante e muitos efeitos colaterais adversos. Segmentação do genoma com pequenas moléculas específicas para a sequência pode permitir que moléculas com elevação do índice terapêutico e menos efeitos fora do alvo. -methylpyrrole N / N poliamidas -metilimidazole são moléculas que podem ser racionalmente concebidos para dirigir sequências de ADN específicos com precisão requintado. E diferentemente da maioria dos fatores de transcrição naturais, poliamidas podem se ligar ao DNA metilado e chromatinized sem perda de afinidade. A especificidade da sequência de poliamidas tem sido extensivamente estudada in vitro com a identificação do local cognato (CSI) e com abordagens bioquímicas e biofísicas tradicionais, mas o estudo de poliamida de ligação para alvos genómicos em células permanece indefinida. Aqui nós relatamos um método, a reticulação de moléculas pequenas para Isolate cromatina (COSMIC), que identifica os locais de ligação de poliamida em todo o genoma. Cósmica é semelhante a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), mas difere em dois aspectos importantes: (1) um photocrosslinker é empregue para permitir a captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de ligação de poliamida, e (2) a afinidade punho biotina é utilizada para purificar poliamida -ADN conjugados sob condições semi-desnaturante para diminuir o ADN que não é ligada de forma covalente. Cósmica é uma estratégia geral que pode ser usado para revelar os eventos de ligação de poliamidas e outros agentes quimioterapêuticos-alvo do genoma de todo o genoma.

Introduction

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A informação para fazer cada uma das células no corpo humano é codificado no DNA. A utilização selectiva de informação que governa o destino de uma célula. Os factores de transcrição (TFS) são proteínas que se ligam a sequências específicas de ADN para expressar um subconjunto particular dos genes no genoma, e o mau funcionamento do TFS está associada ao aparecimento de uma ampla variedade de doenças, incluindo defeitos no desenvolvimento, cancro e diabetes 1,2. Estamos interessados ​​em desenvolver moléculas que podem se ligam selectivamente ao genoma e modulam redes reguladoras de genes.

Poliamidas composto de N -met....

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Protocol

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1. A reticulação em células vivas

  1. Comece com 2,5x10 ~ 7 células H1, ​​ou outras células cultivadas.
    NOTA: O número de células H1 corresponde a cinco placas de 10 cm (aproximadamente 40% de confluência).
  2. Cultivar células em meio E8 em pratos revestidos sobre uma superfície que suporta as células estaminais pluripotentes (ver lista de materiais), e incubar a 37 ° C em atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Células colheita enzimática (ver Lista de Materiais). Nota: Não permitir que as células H1 exceder 90% de confluência; confluência induz a diferenciação de células espontânea H1. Para contar as células, crescer um extr....

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Results

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Para ter em conta a fragmentação genoma não uniforme e outras variáveis, o ADN purificado deve sempre ser normalizadas contra uma referência de ADN de entrada. Os iniciadores específicos para um locus de interesse pode ser utilizado. É também útil para analisar um locus em que não se espera que a molécula para se ligar, como um controlo negativo. Vemos um aumento> 100 vezes na ocupação de poliamida, após irradiação com luz de 365 nm (Figura 2).

DNA enriquecido também pode.......

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Discussion

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Um dos principais desafios do ChIP convencional é a identificação de anticorpos adequados. O ChIP depende muito da qualidade do anticorpo, e a maioria dos anticorpos comerciais é inaceitável para o ChIP. Na verdade, o consórcio Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) descobriu que apenas 20% dos anticorpos comerciais são adequados para ensaios ChIP. 50 Com o COSMIC, os anticorpos são substituídos por estreptavidina. Como as poliamidas são funcionalizadas com biotina, a estreptavidina é usada no lugar de um antic.......

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Disclosures

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A.Z.A. é o único proprietário da Vista Motif, LLC e WINStep Forward.

Acknowledgements

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Agradecemos aos membros do laboratório Ansari e ao Prof. Parameswaran Ramanathan pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH CA133508 e HL099773, a bolsa do corpo docente HI Romnes e o Prêmio de Pesquisa Médica WM Keck para A.Z.A. G.S.E. foi apoiado por uma bolsa Peterson do Departamento de Bioquímica e Biociências Moleculares Bolsa de Treinamento NIH T32 GM07215. AE foi apoiado pela Morgridge Graduate Fellowship e pela Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, e DB foi apoiado pela bolsa NSEC da NSF.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)qualquer fonte
Benzamidinaqualquer fonte
Pepestatinaqualquer fonte
Proteinase Kqualquer fonte
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023Outras fontes podem ser usadas
Reagente de Dissociação Celular Accutase StemProLife TechnologiesA1110501
Kit de Purificação de PCR QIAquickQiagen28104Tentamos outros fabricantes de colunas de DNA com sucesso.
Kit de Preparação de Amostras TruSeq ChIPIlluminaIP-202-1012Este Kit pode ser usado para preparar DNA CÓSMICO para sequenciamento de próxima geração
Matriz de Membrana Matrigel Basement BDBiosciences356231Usado para revestir placas para cultivar H1 ESCs
pH papelqualquer fonte
tubos de microcentrífuga âmbarqualquer fonte
qualquer fonte
filtro de pirexqualquer fonteAs assadeiras de pirex são adequadas
qPCR master mixqualquer fonte
RNasequalquer fonte
HCl (6 N)qualquer fonte
Placas de cultura de tecidos de 10 cmqualquer fonte
Pipetas serológicasqualquer fonte
Pipetas Pasteurqualquer fonte
Pontas de pipetaqualquer fonte
Tubos cônicos de 15 mlqualquer fonte
centrífugaqualquer fonte
microcentrífugaqualquer fonte
nutatorqualquer fonte
Magnético rack de separaçãoqualquer fonte
Fonte UVCalSunB001BH0A1AOutras fontes UV podem ser usadas, mas o tempo de reticulação deve ser otimizado empiricamente
Misonix SonicatorQsonicaS4000 com chifre de copo 431C1Outros sonicadores podem ser usados, mas as condições de sonicação devem ser otimizadas empiricamente
Incubadora de CO2 umidificadaqualquer fonte
Armário de segurança biológica com saída de vácuo,qualquer fonte
tubos de microcentrífuga qualquer fonte

References

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  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet<....

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COSMICPolyamide BindingDNA CrosslinkingChromatin IsolationUV CrosslinkingStreptavidin BeadsNext Generation SequencingQuantitative PCRGenome wide MappingDrug DNA Interactions

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