Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrospl�ico

Resumo

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Resumo

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite a aquisição de imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos (RSC) usando microscopia de dois fótons in vivo na linha de camundongos transgênicos Thy1-GFP. Essa abordagem cria a possibilidade de investigar a correlação de manipulações comportamentais com mudanças na morfologia neuronal in vivo.

O procedimento de implantação da janela craniana foi considerado limitado apenas às regiões do córtex de fácil acesso, como o campo do barril. Nossa abordagem permite a visualização de neurônios no RSC altamente vascularizado. A RSC é um elemento importante do circuito cerebral responsável pela memória espacial, anteriormente considerado problemático para imagens in vivo de dois fótons.

A implantação da janela craniana sobre o RSC é combinada com uma injeção de vírus adeno-associado recombinante que expressa mCherry (rAAV^mCherry) no hipocampo dorsal. O mCherry expresso se espalha para projeções axonais do hipocampo para o RSC, permitindo a visualização de mudanças nos botões axonais pré-sinápticos e nas espinhas dendríticas pós-sinápticas no córtex.

Esta técnica permite o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência no RSC.

Introdução

microscopia de dois fótons revolucionou a observação de atividade cerebral em viver e se comportar animais. Desde a sua introdução, em 1990, rapidamente ganhou popularidade e agora é implementado como uma das abordagens mais interessantes e inovadores no sentido de exame dos vários aspectos da atividade do cérebro in vivo ^1,2. Estas aplicações incluem medições de fluxo de sangue, ativação neuronal (por exemplo, usando indicadores de nível de cálcio ou genes precoces imediatos de expressão) e a morfologia das células neuronais. Um número crescente de laboratórios usam microscópios de dois fótons, implementando a técnica em todo o mundo científico como um novo padrão para in vivo de imagens do cérebro.

A abordagem padrão envolve o implante da janela cranial (um buraco redondo no crânio coberto com uma tampa de vidro) sobre o tambor ou córtex visual do cérebro do rato ^3. Em seguida, dependendo do protocolo experimental, o mouse sofre uma série de visualização e sessões de treinamento comportamental, permitindo monitorar as mudanças na atividade cerebral e morfologia neuronal ao longo do tempo ^4,5. Em ambos os casos, a craniotomia só afecta o osso parietal, sem atravessar as suturas. Acredita-se largamente que a principal desvantagem da técnica é a sua aplicação limitada a córtices facilmente acessíveis, tais como o barril ou córtex visual. Implantação da janela craniana sobre outras regiões levanta uma série de dificuldades, devido a hemorragia excessiva e / ou impedimento espacial.

Neste trabalho, propomos a implantação da janela do crânio acima do córtex retrospl�ico (RSC) como outra possível região de interesse para dois fótons em microscopia vivo ^6. RSC é um elemento importante do circuito do cérebro responsável pela formação da memória espacial. Anatomicamente, CER é uma parte de uma rede neuronal cortical de ligação, do hipocampo, do tálamo e as regiões ^7. Isto éfortemente envolvido em uma série de comportamentos, tais como a aprendizagem e extinção espacial, bem como navegação espacial ^6.

Para visualizar as alterações morfológicas dos neurônios usamos uma linha de rato transgénico expressando a proteína fluorescente verde (GFP) sob o promotor Thy1. Nestes ratos, GFP é expressa em aproximadamente 10% dos neurônios no cérebro que permitem a visualização clara dos axônios e dendritos corticais por meio de microscopia de dois fótons ^8. Uma outra inovação que propomos consiste na injecção de um adeno-associado recombinante de vírus de serotipo 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica uma proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob um promotor específico de neurónios CaMKII ⁹ nas estruturas mais profundas do cérebro que se projectam para RSC , tal como o hipocampo. A expressão de rAAV2 / 1 ^mCherry no hipocampo de rato Thy1-GFP permite a visualização simultânea de elementos pré- e pós-sinápticos do Hippocampo-Cortical sinapses ^10. A expressão de rAAV-driven de mCherry requer duas a três semanas para a proteína para alcançar um nível suficiente nos terminais axonais. Este período é consistente com o tempo habitual necessário para a recuperação de craniotomia.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Nencki of Experimental Biology, da Academia Polonesa de Ciências.

Nota: Algumas das cenas do vídeo associado são acelerados. fator de velocidade é indicado nestas cenas.

1. Cirurgia Preparação

1. Esterilizar todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas dispensáveis. Limpar a mesa cirúrgica, o quadro estereotáxico e toda a área circundante com 70% de etanol. Usar uma almofada cirúrgica estéril para criar um espaço estéril para todo o equipamento esterilizado. Corte gelfoam em pedaços pequenos e mergulhe-os em solução salina estéril.
   Nota: De acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o etanol não é nem um esterilizante nem um desinfectante de alto nível. Ele só deve ser usado como um agente de limpeza / desengorduramento em superfícies previamente esterilizados.
2. Coloque o animal em thcâmara de indução e e definir o nível de isoflurano a 5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min. Este procedimento deve demorar cerca de 3 min.
3. Levar o animal para fora da câmara de indução. Use cauda ou dedo do pé pitadas, a fim de assegurar que o animal é completamente sedado.
4. Usando um aparador preciso raspar o cabelo a partir da parte de trás da cabeça (entre as orelhas) até os olhos.
5. Colocar o animal na moldura estereotáxica e estabilizar a cabeça com barras de ouvido.
6. Definir níveis de anestesia para 1,5-2% isoflurano e 0,3 L / min de oxigênio.
7. Aplicar a pomada.
8. Injectar o animal com Tolfedine subcutaneamente (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) para prevenir a inflamação, dor e infecção, respectivamente.
9. Injectar a intramuscularmente animal com Dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar inchaço cérebro.
   Nota: É possível injectar dexametasona por via subcutânea ou por via intraperitoneal, para evitar danos do músculo.
10. Limpe a pele com scotonetes terile com Betadine seguido por 70% de etanol.
11. Alterar as luvas e pulverizá-los com 70% de etanol.
    Nota: Enquanto estiver usando luvas descartáveis ​​não toque no campo estéril. Toque o animal apenas com as pontas dos instrumentos cirúrgicos estéreis e compressas estéreis.

Cirurgia 2. Cranial Janela

1. Levantar a pele com fórceps e tesouras utilizando micro incisar a pele horizontalmente ao longo da base da cabeça e, em seguida, obliquamente para a frente ponto entre os olhos. Remova o retalho de pele.
2. Aplicar lidocaína pomada com uma zaragatoa estéril no periósteo para evitar sangramento excessivo e dor.
3. Use cotonetes estéreis ou um bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com compressas estéreis.
4. Usando uma agulha estéril aplicar cola de cianoacrilato densa sobre as bordas da pele para os imobilizar e para evitar o contacto com cimento dental. Aguarde até que a cola secar.
5. Coloque uma lamela 3 milímetros estéril sobre tele crânio anteriormente à sutura lambdoid. Centralizar a lamela na RSC coordenadas: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark as bordas lamela arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque a lamela de volta para o recipiente esterilizado com 70% de etanol.
6. Use uma broca dental de alta velocidade com pequenas rebarbas diâmetro para delinear um círculo 3 mm de diâmetro. Limpe o local de perfuração a partir do pó de osso com solução salina estéril cotonetes mergulhados. Use o gelfoam e cotonetes para parar o sangramento ocasional e limpar o osso.
7. No meio de perfuração verificar a espessura do osso com uma pinça fina, tocando suavemente o círculo óssea e verificar sua mobilidade. Tenha em atenção que o osso é mais espesso na área da sutura. Pare a perfuração quando o círculo osso é móvel e só um mesmo, fina camada de osso é deixado sobre a circunferência. Limpar o campo operacional de todos os pó de osso restante com compressas de soro fisiológico mergulhado.
8. Largue a solução salina estéril na área de perfuração, cobrindo o cir perfuradocle. Cuidadosamente retire o círculo osso com uma pinça fina e, em seguida, delicadamente mas com firmeza remover o osso, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não distorcer o círculo de osso ao levantar-lo para evitar possíveis danos ao dura.
9. Gentilmente aplicar o gelfoam embebido em soro fisiológico estéril sobre a dura para ajudar a parar o sangramento. Espere até que todos sangramento está totalmente parado. Retire cuidadosamente o gelfoam para não perturbar o processo de coagulação.
   Nota: A área de sutura é altamente vascularizado, de modo que o sangramento neste momento pode vir a ser profundo. É essencial para esperar o tempo suficiente para que o sangramento parar completamente. É útil para manter o Gelfoam embebido em solução salina arrefecido colocando-o sobre gelo.

Injeção 3. Virus

1. Fixe a bomba de infusão para a torre estereotáxica e ligar o controlador.
2. Inserir a agulha 35G para a seringa. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizar e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de eThanol. Retirar as bolhas de ar a partir da seringa. Inserir a seringa para dentro da bomba.
   Nota: Considere o uso de outros desinfectantes.
3. Descongelar uma dose única de rAAV2 / 1 Preparação ^mCherry (10 ¹² pfu é recomendado) e mantê-lo em gelo. Encher a seringa com a solução de vírus.
4. Centralizar a agulha na bregma e insira suavemente no hipocampo utilizando as seguintes coordenadas: AP -2, ML +/- 1.0, DV-1. Estas coordenadas será localizada perto da borda da craniotomia. Espera durante 5 min para o tecido para estabilizar.
5. Injectar 0,7 mL da solução rAAV2 / 1 ^mCherry à taxa de 50 nl / min. Esperar 10 minutos para que o vírus adsorver totalmente. Remova cuidadosamente a agulha. Seque com gelfoam se o sangramento ocorre. Repita com o site contralateral.

4. Cranial Janela Implantação

1. Colocar a lamela esterilizada, secou-se sobre a parte superior da dura-máter no quadro do círculo perfurado. Segure a lamela com a forceps para achatar suavemente a dura e trazer lamela 'bordas mais perto da superfície do crânio.
   Nota: É possível que a lamela perturba o coágulo e os currículos sangramento. Se for esse o caso, levantar a lamela, coloque-o em álcool, seco e volte para o passo 2.9.
2. Usando uma agulha estéril aplicar a cola de cianoacrilato densa nas bordas lamela para anexá-los ao crânio. Aguarde até que a cola secar.
3. Coloque uma barra de fixação (porca M2 ou um projeto feito sob encomenda) na parte frontal do crânio. Aplicar a cola de cianoacrilato sobre as bordas da barra. Aguarde até que a cola secar.
   1. Coloque a barra de fixação numa posição que permita o posicionamento horizontal da janela craniana durante a imagem sessão. Coloque-o tão distante quanto possível a partir da janela. Se for colocado muito perto da janela, o bar e o parafuso conectando-o com o porta-feito sob medida pode representar um obstáculo para o objectivo, durante o processo de imagem.
4. Prepara-se o acrílico dental e aplicá-lo sobre a superfície do crânio em torno do vidro. É útil para formar uma forma semelhante a cratera em torno da janela. Ele vai criar uma cavidade para água aplicada mais tarde para a imagem latente com o objetivo de água.
5. Criar um tampão com o acrílico dental, cobrindo o resto da área operacional, bordas da pele, barra de fixação, o que reforça a cratera em torno da janela craniana. Aguarde até que o cimento dental para endurecer.
6. Remover o animal a partir do quadro estereotáxico e colocá-lo na câmara de recuperação.
7. Aguarde até que o animal se recuperar da cirurgia, respeitando as funções fisiológicas.
8. Aplicar analgesia pós-operatória (carprofeno, 10 mg / kg) e tratamento antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas.

5. Imagiologia

1. Comece o laser de Ti: safira, poder-se o microscópio. O sistema utilizado nesta experiência é equipado com um laser de dois fotões, sistema OPO e PMT GaAsP dupla.
2. Coloque o animal no Induccâmara ção e induzir a anestesia.
3. Remover o animal a partir da câmara de indução e em lugar da máscara de anestesia de gás sob o microscópio. Diminuir o fluxo de oxigênio para 0,3 L / min ea concentração de isoflurano a 1,5-2%.
4. Corrigir o animal ao corpo do microscópio personalizado com um parafuso M2 (ou outro sistema personalizado). Nivelar o janela craniana.
   Nota: É possível usar o sistema de fixação de cabeça do fabricante do microscópio, embora a custom frame específica dá melhores resultados (maior estabilidade cabeça, posicionamento constante em várias sessões durante uma experiência crônica).
5. Usando as configurações de microscópio e uma ampliação widefield centro objectiva de baixa o ponto de vista de um dos lados do córtex retroesplenial e concentrá-la sobre a superfície da lamela.
6. Aplicar uma gotícula de água para dentro do poço acrílico tipo cratera. Mudar para uma objectiva de imersão em água de longa distância. Mova o objectivo para a janela do crânio até o menisco de água conNECTS o espécime e objetiva.
7. Mudar para as definições de dois fótons e começar a digitalizar o topo da amostra para baixo usando menor zoom. O cruzamento de dura-máter será visível como um brilho elevado de sinal não específico.
8. Ajustar as configurações de aquisição de microscópio em ambos os canais (GFP e mCherry) de acordo com a intensidade do sinal a partir de células fluorescentes, a fim de cobrir toda a gama dinâmica.
9. Depois de encontrar um neurônio adequado (com a árvore dendrítica separada de outras células) realizar uma verificação inicial usando apenas o filterset GFP com menor zoom e z-distância de 5 microns.
10. Obter uma projeção máxima da pilha digitalizado e imprimi-lo para anotações (usando cores invertidas).
11. Ajuste de zoom para um valor que irá permitir à imagem os detalhes morfológicos desejados. Imagem toda a árvore dendrítica nos canais GFP e mCherry usando projeção máxima como guia.

Resultados

A expressão de GFP em um subconjunto de neurónios no ratinho repórter Thy1-GFP permite a imagem in vivo dos dendritos corticais e projecções axonais locais no RSC. A Figura 1A mostra a projecção máxima de uma pilha de imagens múltiplas com dendrites GFP positivas visíveis. O corpo da célula é obscurecida por uma artéria. A Figura 1B mostra uma imagem ampliada único plano (zoom digital de 3x) do ramo dendríticas indicado no 1A. Detalhes da morfol...

Discussão

No presente trabalho apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de dois fótons de imagem in vivo das entradas sinápticas e metas pós-sinápticos em RSC através de uma janela craniana. O procedimento de implantação consistem em vários passos-chave. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado profundamente e fixada na moldura estereotáxica, em seguida, o crânio sobre RSC é diluído com uma broca ao longo das linhas circulares marcados e o osso circular é removido. Após a hemorragia é parada, o rAAV2 / 1 <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Medicamento
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pré-operatório
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% durante a cirurgia
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2mg/kg intramuscular
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg por via subcutânea
Tolfedina	Vetoquinol	4%	4 mg/kg por via subcutânea
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg por via subcutânea
Carprofeno	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg por via subcutânea
Lidocaína	Jelfa	Lignocainum	por via tópica
Lidocaína	Jelfa	20 mg/g	por via tópica
Cirurgia
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Pomada para os olhos	Dedra	Lubrithal	topicamente
CA cola	Pelikan Daniel	20G Huste
Acrílico dental	SpofaDental	Duracryl Plus
Moldura estereotáxica	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Aparelho	HSE-64-0720	Broca
odontológica	Sigmed	Keystone KVet
Barra de fixação Porcas	de	N/A	M2 ou M3 personalizadas podem ser usadas
Fórceps	Renex	PN-7B-SA
Micro tesoura	Falcon	BM.183.180
Microscópio de dissecção	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Feito sob medida	/A
Microscópio de dois fotões	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unidade do laser: Camaleão coerente 690-1040nm com oscilador paramétrico ótico 1050-1300nm. Objetivos: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0,1 e LD Plan-APOCHROMAT 20x/1,0. Detecção: Filtros passa-banda Zeiss BP 500-550 (GFP) e BP 570-610 (mCherry) separados por divisor de feixe a 560nm e acoplados a dois fotodetectores GaAsP.
Reagente
Vírus	presente de K. Deisseroth		Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) expressando a proteína fluorescente mCherry sob o controle do promotor CaMK

de 3 mm de diâmetro parafuso N