Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrospl�ico

Resumo

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Resumo

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite a aquisição de imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos (RSC) usando microscopia de dois fótons in vivo na linha de camundongos transgênicos Thy1-GFP. Essa abordagem cria a possibilidade de investigar a correlação de manipulações comportamentais com mudanças na morfologia neuronal in vivo.

O procedimento de implantação da janela craniana foi considerado limitado apenas às regiões do córtex de fácil acesso, como o campo do barril. Nossa abordagem permite a visualização de neurônios no RSC altamente vascularizado. A RSC é um elemento importante do circuito cerebral responsável pela memória espacial, anteriormente considerado problemático para imagens in vivo de dois fótons.

A implantação da janela craniana sobre o RSC é combinada com uma injeção de vírus adeno-associado recombinante que expressa mCherry (rAAV^mCherry) no hipocampo dorsal. O mCherry expresso se espalha para projeções axonais do hipocampo para o RSC, permitindo a visualização de mudanças nos botões axonais pré-sinápticos e nas espinhas dendríticas pós-sinápticas no córtex.

Esta técnica permite o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência no RSC.

Introdução

microscopia de dois fótons revolucionou a observação de atividade cerebral em viver e se comportar animais. Desde a sua introdução, em 1990, rapidamente ganhou popularidade e agora é implementado como uma das abordagens mais interessantes e inovadores no sentido de exame dos vários aspectos da atividade do cérebro in vivo ^1,2. Estas aplicações incluem medições de fluxo de sangue, ativação neuronal (por exemplo, usando indicadores de nível de cálcio ou genes precoces imediatos de expressão) e a morfologia das células neuronais. Um número crescente de laboratórios usam microscópios de dois fótons, implementando a técnica em todo o mundo cie....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Nencki of Experimental Biology, da Academia Polonesa de Ciências.

Nota: Algumas das cenas do vídeo associado são acelerados. fator de velocidade é indicado nestas cenas.

1. Cirurgia Preparação

1. Esterilizar todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas dispensáveis. Limpar a mesa cirúrgica, o quadro estereotáxico e toda a área circundante com 70% de etanol. Usar uma almofada cirúrgica estéril para criar um espaço estéril para todo o equipamento es....

Resultados

A expressão de GFP em um subconjunto de neurónios no ratinho repórter Thy1-GFP permite a imagem in vivo dos dendritos corticais e projecções axonais locais no RSC. A Figura 1A mostra a projecção máxima de uma pilha de imagens múltiplas com dendrites GFP positivas visíveis. O corpo da célula é obscurecida por uma artéria. A Figura 1B mostra uma imagem ampliada único plano (zoom digital de 3x) do ramo dendríticas indicado no 1A. Detalhes da morfol.......

Discussão

No presente trabalho apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de dois fótons de imagem in vivo das entradas sinápticas e metas pós-sinápticos em RSC através de uma janela craniana. O procedimento de implantação consistem em vários passos-chave. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado profundamente e fixada na moldura estereotáxica, em seguida, o crânio sobre RSC é diluído com uma broca ao longo das linhas circulares marcados e o osso circular é removido. Após a hemorragia é parada, o rAAV2 / 1 <.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Medicamento
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pré-operatório
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% durante a cirurgia
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2mg/kg intramuscular
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg por via subcutânea
Tolfedina	Vetoquinol	4%	4 mg/kg por via subcutânea
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg por via subcutânea
Carprofeno	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg por via subcutânea
Lidocaína	Jelfa	Lignocainum	por via tópica
Lidocaína	Jelfa	20 mg/g	por via tópica
Cirurgia
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Pomada para os olhos	Dedra	Lubrithal	topicamente
CA cola	Pelikan Daniel	20G Huste
Acrílico dental	SpofaDental	Duracryl Plus
Moldura estereotáxica	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Aparelho	HSE-64-0720	Broca
odontológica	Sigmed	Keystone KVet
Barra de fixação Porcas	de	N/A	M2 ou M3 personalizadas podem ser usadas
Fórceps	Renex	PN-7B-SA
Micro tesoura	Falcon	BM.183.180
Microscópio de dissecção	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Feito sob medida	/A
Microscópio de dois fotões	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unidade do laser: Camaleão coerente 690-1040nm com oscilador paramétrico ótico 1050-1300nm. Objetivos: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0,1 e LD Plan-APOCHROMAT 20x/1,0. Detecção: Filtros passa-banda Zeiss BP 500-550 (GFP) e BP 570-610 (mCherry) separados por divisor de feixe a 560nm e acoplados a dois fotodetectores GaAsP.
Reagente
Vírus	presente de K. Deisseroth		Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) expressando a proteína fluorescente mCherry sob o controle do promotor CaMK

de 3 mm de diâmetro parafuso N