Artigo de método

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 de janeiro de 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os fosfoinositídeos (PtdInsPs) são lipídios sinalizadores essenciais responsáveis por recrutar efetores específicos e conferir às organelas identidade e função molecular. Cada um dos sete PtdInsPs varia em sua distribuição e abundância, que são rigidamente regulados por quinases e fosfatases específicas. A abundância de PtdInsPs pode mudar abruptamente em resposta a vários eventos de sinalização ou perturbação da maquinaria reguladora. Para entender como esses eventos levam a mudanças na quantidade de PtdInsPs e seu impacto resultante, é importante quantificar os níveis de PtdInsP antes e depois de um evento de sinalização ou entre o controle e as condições anormais. No entanto, devido à sua baixa abundância e semelhança, quantificar as quantidades relativas de cada PtdInsP pode ser um desafio. Este artigo descreve um método para quantificar os níveis de PtdInsP marcando metabolicamente as células com 3H-mio-inositol, que é incorporado ao PtdInsPs. Os fosfolipídios são então precipitados e desacilados. Os 3H-glicero-inositídeos solúveis resultantes são posteriormente extraídos, separados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) e detectados por cintilação de fluxo. A rotulagem e o processamento de amostras de levedura são descritos em detalhes, bem como a configuração instrumental para o HPLC e o cintilador de fluxo. Apesar de perder informações estruturais sobre o conteúdo da cadeia acila, este método é sensível e pode ser otimizado para quantificar simultaneamente todos os sete PtdInsPs nas células.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os fosfoinositídeos (PtdInsPs) são importantes fosfolipídios sinalizadores que ajudam a regular uma variedade de funções celulares, incluindo transdução de sinal, tráfego de membrana e expressão gênica, que então modulam o comportamento celular de ordem superior, como divisão celular, identidade de organelas e atividade metabólica1-3. Existem sete espécies de PtdInsPs que são derivadas da fosforilação das posições 3, 4 e/ou 5 do grupo de cabeça de inositol do fosfatidilinositol (PtdIns), o fosfolipídio original. É importante ressaltar que os sete PtdInsPs são distribuídos de forma desigual e a concentração local de cada espécie de PtdInsP pode aumentar ou diminuir em locais subcelulares específicos, onde eles se ligam a um conjunto distinto de efetores de proteínas, o que juntos permite que cada PtdInsP controle a identidade e função de sua membrana hospedeira3,4. Além disso, os níveis de cada PtdInsP precisam ser rigidamente controlados, pois isso pode afetar significativamente a intensidade do sinal produzido por um PtdInsP. A localização e os níveis de cada PtdInsP dependem do direcionamento e da atividade de numerosas quinases lipídicas, fosfatases e fosfolipases que medeiam a síntese e o turnover de cada PtdInsP3,4. Assim, a má regulação da maquinaria regulatória do PtdInsP pode perturbar a função celular, levando a doenças como câncer e doenças degenerativas2,5,6. Para entender completamente os papéis e funções dos PtdInsPs e seu maquinário regulatório, técnicas baseadas em microscopia e bioquímicas foram desenvolvidas para rastrear e quantificar PtdInsPs.

Em muitos casos, os PtdInsPs se ligam aos seus efetores proteicos por meio de um domínio proteico específico7-9. Esses módulos de proteína geralmente retêm suas propriedades adequadas de dobra e reconhecimento de lipídios quando expressos separadamente de toda a proteína. Isso deu origem a sondas PtdInsP fundindo um domínio específico de proteína de ligação a PtdInsP a uma proteína fluorescente (FP) como a proteína fluorescente verde (GFP) para a detecção subcelular de PtdInsPs por microscopia. De fato, muitos estudos usaram módulos de proteína de ligação a PtdInsP fundidos com FP para identificar a localização e a dinâmica de espécies específicas de PtdInsP por imagens de células vivas1,10. Por exemplo, o domínio de homologia de Pleckstrin (PH) da fosfolipase C δ1 (PLCδ1) fundido à GFP reconhece especificamente o fosfatidilinositol-4,5-bifosfato [PtdIns(4,5)P2] na membrana plasmática, enquanto cópias em tandem do domínio FYVE do antígeno 1 do endossomo inicial (EEA1) foram empregadas para rastrear fosfatidilinositol-3-fosfato (PtdIns3P) nos endossomas10-13. No geral, as técnicas baseadas em microscopia são ótimas para visualizar a localização e a dinâmica do PtdInsP, mas há várias ressalvas, incluindo que os domínios de ligação ao PtdInsP também podem interagir com outros fatores além das espécies alvo de PtdInsP e que não podem detectar alterações abaixo da fluorescência citosólica das sondas FP.

Técnicas bioquímicas, incluindo cromatografia em camada delgada, espectrometria de massa e marcação de radioisótopos, também podem ser usadas para caracterizar e quantificar os níveis de cada PtdInsP14-16. Esses métodos requerem o isolamento de lipídios para a detecção dos níveis celulares de PtdInsPs. A espectrometria de massa pode ser usada para caracterizar fosfolipídios de extratos lipídicos e é inestimável para determinar a composição da cadeia acila de PtdInsPs14,17. No entanto, a espectrometria de massa é principalmente semiquantitativa e permanece difícil de resolver e quantificar simultaneamente espécies de PtdInsP com o mesmo peso molecular14,17. Em comparação, a marcação de radioisótopos de PtdInsPs seguida de cintilação de fluxo acoplada à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é útil para a separação e quantificação simultânea de todas as sete espécies de PtdInsPs18. O uso de HPLC com uma coluna de troca aniônica forte (SAX) alcança a separação com base no peso molecular, carga e forma, fracionando assim PtdInsPs (Gro-InsPs) desacilados mesmo com o mesmo peso molecular e carga. O acoplamento do eluente de HPLC a um cintilador de fluxo gera picos de sinal baseados em radioatividade para cada espécie de Gro-InsPs em relação ao glicerol-inositol original (Gro-Ins) 18 . Em última análise, isso corresponde a níveis relativos de PtdInsPs nas células.

A radiomarcação de PtdInsPs e cintilação de fluxo acoplada a HPLC é uma ferramenta útil para investigar a regulação e função do fosfatidilinositol 3,5-bifosfato [PtdIns(3,5)P2], um PtdInsP que constitui apenas ~0,1-0,3% de PtdIns16,19,20. A síntese de PtdIns(3,5)P2 é realizada pela PtdIns3P 5-quinase chamada Fab1 em levedura e PIKfyve em mamíferos21. Esta reação é neutralizada por uma PtdIns(3,5)P2 5-fosfatase chamada Fig4 em leveduras ou mFig4/Sac3 em mamíferos22-24. Curiosamente, tanto PIKfyve / Fab1 quanto mFig4 / Fig4 / Sac3 existem em um único complexo e são regulados pela proteína adaptadora de andaime, Vac14 em levedura ou mVac14 / ArPIKfyve em mamíferos25,26. Em células de levedura deletadas por VAC14, Fab1 não funciona eficientemente, levando a uma diminuição de 90% nos níveis de PtdIns (3,5) P2 27,28. Por outro lado, Atg18 é uma proteína efetora PtdIns(3,5)P2 que pode controlar a fissão vacuolar 29. Atg18 também é um regulador negativo de PtdIns(3,5)P2, uma vez que a deleção de seu gene, ATG18, causa um aumento de 10 a 20 vezes nos níveis de PtdIns(3,5)P2 29,30. No geral, mudanças nos níveis de PtdIns(3,5)P2 afetam severamente a função do vacúolo de levedura e dos lisossomos de mamíferos, consequentemente afetando processos como tráfego de membrana, maturação de fagossomos, autofagia e transporte de íons 6,19,21,31.

Este artigo descreve o processo de marcação de radioisótopos de PtdInsPs com 3H-mio-inositol em leveduras para detectar os níveis relativos de PtdIns(3,5)P2 em cepas de leveduras selvagens, vac14Δ e atg18Δ. Usando isso como exemplo, são mostradas as capacidades de resolução da HPLC para a separação de PtdInsPs individuais, bem como a sensibilidade da cintilação de fluxo para detecção de vestígios de 3H-mio-inositol. Também elaboramos como otimizar a metodologia para rotular e separar 3PtdInsPs marcados com H de células de mamíferos, cujas amostras tendem a ser mais complexas, uma vez que essas células possuem todas as sete espécies de PtdInsP.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: O texto abaixo descreve em pormenor um método para medir PtdInsPs em leveduras. Ele fornece os detalhes experimentais para as células de levedura de rotulagem com 3 H- mio-inositol, extraindo e desacilando lipídios e um protocolo de HPLC-eluição para fracionar e quantificar PtdInsPs desacilados. Por favor, note que a rotulagem, a desacilação, resolução e quantificação de PtdInsPs em células de mamíferos requerem otimização e perfis de HPLC-eluição mais longos. Esses detalhes podem ser encontrados em outros lugares, embora nós discutir alguns dos aspectos na discussão. Em geral, a metodologia para extrair os lípidos, desacilar e extrair o solúvel em água Gro-InsPs de levedura é determinada e é ilustrada na Figura 1.

1. Protocolo para Rotulagem e Análise PtdInsPs em leveduras

  1. Cultura de células e a marcação radioactiva
    1. Cresce de 20 ml de cultura líquido do SEY6210 estirpe de levedura a 30 ° C com agitação constante em sintético completomeios para a fase mid-log ou uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de cerca de 0,6-0,7.
      Nota: Não use mídia YPD como isso pode afetar 3 H- mio-inositol incorporação. Este tamanho de cultura deve fornecer material suficiente para 2-3 corridas de HPLC.
    2. Pellet um total de 10-14 OD das células de levedura (note que 1 mL de cultura com uma DO600 = 1 contém ~ 1x10 7 células) por centrifugação a 800 xg durante 5 min num tubo de 12 ml de fundo redondo. Ressuspender com 2 ml de livre-inositol mídia (IFM) (ver Tabela 1 para composição IFM).
    3. Repita centrifugação e aspirar a mídia. Ressuspender o sedimento com 440 ul de MFI e incubar à TA durante 15 min.
    4. Adicionar 60 ul de 3 H-mio-inositol (1 mL = 1 uCi) a cada amostra e incubar à temperatura crescente de 30 ° C durante 1 a 3 horas com agitação constante.
      Cuidado: 3 H- mio-inositol é um companheiro radioativorial que deve ser tratado após o treinamento apropriado. Além disso, todos os produtos de consumo que fazem contacto com material contendo 3 H deve ser descartado de forma apropriada e designados como resíduos radioactivos.
      Nota: A temperatura de crescimento podem ser alterados conforme necessário, desde que todas as estirpes a serem comparadas são cultivadas à mesma temperatura.
    5. Transferir a suspensão de células (500 uL) para um tubo de microcentrifugadora contendo 500 ul de ácido perclórico a 9% e 200 uL de esferas de vidro lavadas com ácido. Misturar por inversão e incubar em gelo durante 5 min.
    6. Vortex a amostra à velocidade máxima durante 10 minutos e transferir os lisados ​​para um novo tubo de microcentrífuga utilizando uma ponta de gel de carregamento a fim de evitar as esferas de vidro.
    7. Pellet da amostra a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
    8. Ressuspender o sedimento por banho de ultra-sons em 1 ml de EDTA a 100 mM arrefecido em gelo. Agregar novamente como antes.
  2. Desacila�o e extração
    1. Recentemente preparar 5,0 ml do reagente de desacilação por combinação de 2,3 ml de metanol, 1,3 ml de metilamina a 40%, 0,55 ml de 1-butanol e 0,80 mL de água. Inverta para misturar.
    2. Aspirar o EDTA e sonicar o sedimento em 50 ul de água.
    3. Adicionar 500 ul de reagente a desacilação e sonicar a mistura. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
    4. Lípidos calor durante 50 min a 53 ° C num bloco de aquecimento. Secam-se as amostras completamente por centrifugação de vácuo ao longo de 3 horas ou O / N.
      1. Assegure-se que uma armadilha química está instalado entre o vácuo por meio de centrífuga e a bomba de vácuo, para evitar a entrada de vapores no ar.
    5. Ressuspender o sedimento com 300 ul de água por banho de sonicação e incubar à TA durante 20 min. Secam-se as amostras por centrifugação a vácuo durante 3 horas ou O / N. Repita este passo mais uma vez.
    6. Sonicar o sedimento com 450 ul de água. Esta é a fase aquosa durante a extracção.
    7. Recém preparar 10 ml da extraction reagente pela adição de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml de éter etílico e 0,40 ml de formato de etilo. Inverta para misturar.
    8. Adicionar 300 ul de reagente de extracção para a fase aquosa. Vortex a mistura à velocidade máxima durante 5 min e separar as fases por centrifugação a velocidade máxima (18.000 x g) durante 2 min.
    9. Recolher a fase aquosa inferior para um novo tubo de microcentrifuga, evitando a camada superior orgânica, a interface, e o sedimento. Repetir a extracção da fase aquosa mais duas vezes com reagente de extracção fresco.
    10. Completamente seca a camada aquosa recolhida por centrifugação a vácuo. Dispersa-se o sedimento em 50 ul de água por banho de sonicação.
    11. Adicionar 2 mL de cada amostra a 4 ml de fluido de cintilação num frasco de cintilação de 6 ml de polietileno. Determinar o número de contagens (em cpm) em cada amostra por cintilação líquida usando uma janela aberta.
    12. Armazenar as amostras a -20 ° C até estar pronto para a HPLC.
  3. Separação de3H-glicero-inositides por HPLC
    1. Preparar tampão A por filtração 1 L de água ultrapura com uma garrafa topo filtro de 0,22 um vácuo, seguida de desgaseificação.
    2. Preparar tampão B, fazendo uma solução de 1 L de 1 M de fosfato de amónio dibásico (APS, MW 132,06) em água e ajustar o pH para 3,8 com ácido fosfórico. Filtra-se o fosfato de amónio com um frasco de topo filtro de 0,22 um vácuo, seguida de desgaseificação.
    3. Monte o frasco para injectáveis ​​equipando um frasco de 2 ml com uma inserção de 250 ul volume pequeno de mola. Carga de 10 milhões de CPM e adicionar água para um volume total de 55 ul. Prepare um frasco vazio com 55 mL de água.
    4. Tapar os frascos com tampas de rosca equipado com um septo PTFE / silicone (lado vermelho de frente para o interior do frasco). Coloque cada frasco na bandeja de auto-amostragem do HPLC, começando com o frasco em branco.
    5. Use um HPLC e software associado que controla o fluxo de buffer, degasses buffers e controles de amostra injectiligar. Use um cintilador fluxo on-line e seu software associado para regular o caudal de cintilante e para monitorar o sinal de 3 H-decadência.
      1. Utilizar uma coluna de cromatografia líquida SAX com dimensões de 250 mm x 4,6 mm e contendo 5 uM de sílica na resina de HPLC. Equipar a coluna com uma coluna de guarda para evitar a injecção de contaminantes.
      2. Instalar uma célula compatível H-3 de fluxo de 500 uL na cintilador de fluxo.
        NOTA: O fraccionamento pode ser realizado com um sistema de HPLC Agilent 1200 series infinito controlado por software Chemstation ou com outros sistemas de HPLC disponíveis comercialmente. Fluxo de cintilação do eluente de HPLC pode ser feito com um fluxo de cintilador β-RAM controlado pelo software Laura ou outro cintilador de fluxo disponível comercialmente ou software compatível.
    6. Inicializar a bomba quaternária, a uma taxa de fluxo de 1,0 ml / min com 100% de tampão A.
    7. Definir um perfil de equilíbrio no HPLCpara controlar o gradiente de tampões A e B (chamada de "Um protocolo de equilíbrio"): 1% de tampão B, durante 5 min, 1-100% de B durante 5 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 5 min, 1% de B durante 20 min. Definir o limite de pressão a 400 bar, 1,0 ml / min caudal, e 30 min tempo de execução.
    8. Defina-se um perfil de eluição (Figura 2) no HPLC para controlar o gradiente de tampões A e B (chamar este "Protocolo A"): 1% de B durante 5 min, 1-20% de B durante 40 min, 20-100% B durante 10 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 20 min, 1% de B durante 10 min. Definir o limite de pressão a 400 bar, 1,0 ml / min caudal, e 90 min tempo de execução.
    9. Configurar um protocolo de detecção no cintilador de fluxo (chamo isso de "Protocolo A detecção") para ser executado durante 60 minutos, com uma taxa de fluxo de fluido de cintilação de 2,5 ml / min e um tempo de permanência 8,57 seg.
    10. Programar uma sequência de injecção automática no HPLC para começar com o espaço em branco na água "Protocolo Um equilíbrio", seguido de each radiomarcado amostra em "Protocolo A". Inicializar a seqüência quando estiver pronto.
    11. Enquanto a corrida ainda está no protocolo de equilíbrio, criar um lote no cintilador fluxo para medir todas as amostras com "Protocolo A detecção." A injeção de cada nova amostra irá inicializar "Protocolo A" no HPLC, enquanto acionando o cintilador fluxo para começar "Protocolo A detecção."
    12. Após a conclusão de todas as corridas, lave a HPLC, a coluna eo fluxo cintilador com 100% de Tampão A durante 30 minutos a 1,0 ml / min caudal.
  4. Análise de dados
    1. Use um software de Laura ou qualquer outro software que pode quantificar o espectro de cromatografia. Os passos descritos nesta secção são representados na Figura 3.
    2. Abra os arquivos clicando em "Arquivo", "Abrir" e selecione o arquivo de dados brutos para cada amostra.
    3. Na aba "cromatogramas", zoom a esticar em cada um dos picos menores (cerca de 1000 contagens [eixo y]), mantendo a resolução de tempo. Zoom em cada pico indivíduo, se necessário.
    4. Realce cada um dos picos para a análise usando a opção "Adicionar ROI" ferramenta. Identificar picos por tempo de eluição: Parental Gro-Ins em 10 min, Gro-Ins3P aos 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 aos 29 min e Gro-Ins (4,5 ) P 2 em 32 min.
    5. Na aba "mesas regiões", gravar a "área (contagem)" de cada pico. Observe o "start (mm: ss)" o tempo eo "fim (mm: ss)" tempo de cada pico.
    6. Por subtracção do fundo, destacar uma região adjacente ao pico abrangendo a mesma quantidade de tempo. Subtrair o número de contagens do pico correspondente.
    7. Normalizar a área de cada pico parental contra Gro-Ins (expressa como "% do total de PtdIns"). Em seguida, normalizar cada um dos picos em cada condição experimental contra a condição de controle (expresso como "nfold aumento em relação ao controle ").
      NOTA: Normalização de cada pico pode também ser feito contra as contagens totais, mas uma vez que o parental Gro-Ins é muito mais abundante do que todos os outros PtdInsPs os resultados tendem a ser semelhante.
    8. Exportar os dados para os cromatógrafos pressionando "Arquivo", "Salvar como ...", e escolha a opção "CSV (separados por vírgula)" formato de arquivo. Plotar os dados em uma planilha e apresentar, se necessário.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este método, PtdInsPs de levedura foram marcadas metabolicamente com H-3 mio-inositol. Após marcação, os fosfolípidos foram precipitados com ácido perclórico, seguida por desacilação e fosfolípido extracção do Gro-InsPs solúvel em água (Figura 1). Nesta fase, é importante para quantificar o sinal radioactivo associado ao total de extraiu-Gro-InsPs por cintilação líquida para garantir suficiente rácio de sinal para ruído para os PtdInsPs muito b...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo detalha o protocolo experimental necessária para quantificar os níveis celulares de PtdnsPs por acoplado-HPLC fluxo de cintilação de levedura. A metodologia permite que a marcação metabólica de PtdInsPs com 3 H-mio-inositol, seguido de processamento e extracção de lípido solúvel em água 3H-Gro-InsPs, fraccionamento por HPLC e análise. Usando este método, os níveis relativos de PtdInsPs em células sob várias condições pode ser quantificada, como é mostrado para PtdIns (3,5) P

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação de Ontário do Governo de Ontário. Este artigo foi possível graças ao financiamento mantido pela R.J.B. do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia, do Programa de Cátedras de Pesquisa do Canadá e da Universidade Ryerson.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-ButanolBiobasicBC1800Fosfato
de amônio de grau reagente dibásicoBioshopAPD001Sulfato de amônio de grau ACS
BiobasicADB0060Amostrador automático de grau ultra puro
AgilentG1329BAgilent 1260 série infinita
BiotinaSigmaB4501
Ácido bóricoBiobasicBB0044de grau de biologia molecular
BiobasicCT1330Anidro,
pantotenato de cálcioSigmaC8731
Sulfato de cobre (II)Sigma451657anidra
BiobasicGB0219Anidro, modificação
Dulbecco de grau biotecnológico de Eagle's MediumLife11995-065Com 4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruato, L-glutamina
Modificação de Dulbecco da Eagle's MediumMP biomedicals0916429 Com 4,5 g/L de glicose, sem L-gluatamina, sem inositol
EDTABiobasicEB0107Éter etílico ultra puro livre de ácido
Caledon labs1/10/4700Formato etílico de grau reagente
Sigma112682grau reagente
Wisent080-450Origem dos EUA, qualidade premium, inativado por calor
Soro fetal bovino, Vida Dialisada26400044EUA origem
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Fluido de cintilação para cintilação de fluxo 
Ácido fólicoBiobasicFB0466
USP grau HEPES solução tampão15630080 vida útilM solução
Inositol, Myo- [2-3H (N)]Perkin ElmerNET114005MC9: 1 etanol para água
Insulina-Transferrina-Selênio-EtanolaminaVida 51500056solução 100x
Cloreto de ferro (III)Sigma157740Reagente grau
Laura - Software de coleta e análise de dados de cromatografiaLabLogic Systems LtdVersão 4.2.1.18Software de cintilador de fluxo
L-glutaminaSigmaG7513200  mM, em solução, filtrado estéril, BioXtra, adequado para cultura de células
Cloreto de magnésioSigmaM8266
Sulfato de manganêsBiobasicMB0334Monohidratado, grau ACS
MetanolCaledon labs6701-7-40HPLC
Grau solução de metilaminaSigma42646640% (v/v)
Fosfato monopotássicoBiobasicPB0445Anidro, Ácido nicotínico de grau ACS
BiobasicNB0660Grau de reagente
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 Software para HPLC
ácido p-aminobenzóico (PABA)BioshopPAB001.100
Penicilina-estreptomicinaSigmaP4333100X, líquido, estabilizado, filtrado estéril, testado em cultura de células
Ácido perclóricoSigma244252reagente ACS, 70%
PhenoSpher SAX colunaPhenomenex00G-315-E05 µ m, 80 &, 250 x 4,6 mm
Ácido fosfóricoCaledon labs29/01/8425de grau reagente
BiobasicPB0440de grau ACS
BiobasicPB0443de grau ACS
SigmaP9755
Bomba quaternáriaAgilentG1311CAgilent 1260 série infinita
RiboflavinaBioshopRIB333.100
Cloreto de sódioBiobasicDB0483
Molibdato de sódioSigma243655
Compartimento de coluna termostatizadoAgilentG1316AAgilent 1260 série infinita
Cloridrato de tiaminaSigmaT4625Grau de reagente; fazer solução de 0,02% (p / v), forma uma suspensão. misture e congele alíquotas
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Coquetel de cintilação para contagem de cintilação líquida
Sulfato de zincoBiobasicZB2906Heptahidratado, grau de reagente
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µ l célula de fluxo; Analisador de Cintilador de Fluxo Radiomático alternativo da Perkin Elmer;
Cloreto de cálcio de grau industrial D-glicose de Soro fetal bovino de 1 anidro de ácido livre Cloreto de potássio Iodeto de potássio Cloridrato de piridoxina de grau USP de grau biotecnológico

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

Artigos relacionados