Artigo de método

Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray

DOI:

10.3791/53536

⸱

8 de janeiro de 2016

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Neste artigo

Resumo

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A caracterização de complexos formados em diferentes proporções relativas de mercúrio(II) para tetrapeptídeos dicilenil por espectrometria de massa orbitrap de ionização por eletrospray é apresentada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo avaliamos um método para a caracterização de complexos, formados em diferentes proporções relativas de mercúrio(II) para dicilenil tetrapeptídeo, por espectrometria de massas orbitrap de ionização por eletrospray. Essa estratégia é baseada na caracterização anterior bem-sucedida de complexos de mercúrio-dicileinil envolvendo tripeptídeos, utilizando espectrometria de massa entre outras técnicas. O cloreto de mercúrio (II) e um tetrapeptídeo dicilenil foram incubados em meio tamponado desgaseificado em proporções estequiométricas variadas. Os complexos formados foram posteriormente analisados em um espectrômetro de massa por eletrospray consistindo de um analisador de massa híbrido linear de armadilhas iônicas e orbi-trap. Os espectros de espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS) foram adquiridos no modo positivo e os picos observados foram então analisados quanto a padrões distintos de distribuição isotópica de mercúrio e pico monoisotópico associado. Este trabalho demonstra que uma estequiometria precisa de mercúrio e peptídeo nos complexos formados sob condições especificadas de ionização por eletrospray pode ser determinada usando ESI MS de alta resolução com base em padrões distintos de distribuição isotópica de mercúrio.

Introdução

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Os medicamentos clínicos atuais prescritos para terapia de quelação de envenenamento por mercúrio1 contêm grupo(s) tiol, que é(são) responsável(is) pela ligação e sequestro de íons de mercúrio2,3. No entanto, estudos mostraram que esses pequenos compostos de tióis [ácido dimercaptosuccínico (DMSA) e ácido dimercaptopropano-sulfônico (DMPS)] não são ideais para a terapia de quelação de mercúrio4-6. Portanto, é necessário entender a associação e as tendências de formação complexa do mercúrio com os tióis para melhorar o design racional de compostos de tióis para quelação de mercúrio. Recentemente, relatamos que os tripeptídeos de n-alquil e aril dicilenil com grupos ditiol podem servir como "âncoras duplas" eficazes para acomodar os locais de coordenação do mercúrio (II) para formar complexos 1: 1 mercúrio (II) :p eptídeo e 1: 2 mercúrio (II) :(peptídeo)2 7. Além disso, estudamos o efeito do aumento dos resíduos de cisteína em formações de tipos complexos8. Neste estudo, investigamos a associação de mercúrio(II) com dois tetrapeptídeos dicilenil, onde os resíduos de cisteína são separados por dois resíduos de aminoácidos. Para avaliar o efeito dos grupos auxiliares de ligação ao mercúrio, os aminoácidos intervenientes são dois resíduos de glicina (não substituídos) ou dois resíduos de ácido glutâmico (gama-carboxilado).

A reação do peptídeo cisteínil com mercúrio (II) requer condições que impeçam a oxidação dos grupos cisteínil tióis para formar ligações dissulfeto9. Além disso, a associação de mercúrio (II) com peptídeos de cisteína para formar vários tipos de complexos de mercúrio-peptídeo depende da proporção inicial de mercúrio (II): peptídeo na mistura de reação7,8. Os tipos de complexos peptídicos de mercúrio formados nessas misturas de reação podem ser analisados por espectroscopia de massa por ionização suave, que é uma ferramenta analítica sensível para determinar as interações das espécies entre íons metálicos e peptídeos10-14. Assim, ele fornecerá um perfil dos vários tipos de adutos peptídicos mercuriados que são formados sob uma condição de ionização por eletrospray especificada. Aqui, mostraremos como peptídeos de cisteínila e soluções de cloreto de mercúrio (II) podem ser preparadas em solução tampão de formato de amônio desgaseificada coberta com argônio para minimizar a oxidação. Ao reagir vários equivalentes molares de mercúrio (II) com tetrapeptídeos dicilenil, mostraremos como a proporção inicial de mercúrio (II) :p eptídeo afeta os tipos de complexos formados. Também mostraremos como a espectrometria de massa por ionização por eletrospray (ESI) pode ser usada como uma ferramenta de caracterização para fornecer uma estequiometria precisa de mercúrio para peptídeo nos complexos formados. O protocolo de vídeo associado demonstrará as condições experimentais para a preparação dos complexos de mercúrio, o procedimento para analisar as misturas de reação sob condições especificadas de ionização por eletrospray e a caracterização das estequiometrias dos complexos de mercúrio (II)-dicileniltetrapeptídeo, com base nos distintos padrões de distribuição de isótopos de mercúrio, usando o programa ChemCal15. Destina-se a auxiliar aqueles que estão interessados em usar a espectrometria de massa ESI orbitrap para analisar vários complexos formados por íons metálicos que existem em diferentes formas isotópicas.

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Protocolo

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Nota: Por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança do material (MSDS) relevantes antes de usar. Cloreto de mercúrio é uma substância química tóxica. Equipamentos de proteção individual (luvas, óculos de segurança, e jaleco) deve ser usado durante a entregá-lo e todas as soluções associadas. Descarte as soluções em frascos de resíduos químicos claramente identificados designados para os metais pesados.

1. Preparação de 5 mM de formato de amónio desgaseificada tampão, pH 7,5

  1. Dissolve-se 0,1576 g de tampão de formato de amónio em 450 ml de água de qualidade para HPLC. Ajustar o pH da solução acima referida com 1 M de ácido fórmico e 1 M de hidróxido de amónio a 7,5. Transferir esta solução para um balão volumétrico de 500 ml e adicionar água HPLC para a linha de calibração para fazer uma solução de formato de amónio 5 mM.
  2. Desgasificar o tampão de formato de amónio 5 mM sob um sistema de vácuo durante 10 min e purga com árgon. Repita duas vezes e solução de loja sob árgon. No dia da utilização, filtrar a solução tampão através de um filtro de 0,2 mícron antes da suauso e.

2. Preparação de mercúrio (II) Cloreto de Soluções

  1. Pesar 0,2375 g de mercúrio (II) cloreto. Dissolve-lo em 25 ml de tampão de formato de amónio 5 mM, para produzir uma solução de cloreto de 0,035 M de mercúrio (II).
  2. Adicionar 0,214 ml de uma solução M de mercúrio (II), cloreto de 0,035 para 9.785 ml de 5 mM de tampão de formato de amónio para criar uma solução de 7,5 x 10 -4 M. Cobertor a solução de 7,5 x 10 -4 M de mercúrio (II) com gás árgon.

3. Preparação de Solução Stock CGGC

  1. Dissolve-se 2,0 mg do tetrapéptido dicysteinyl, CGGC, em 0,118 ml de acetonitrilo de grau HPLC e, em seguida, adicionar 1,0647 ml de formato de amónio 5 mM, pH 7,5 tampão que foi desgaseif içada em árgon para se obter uma solução estoque 5 mM CGGC.
  2. Adicionar 225 ul da solução-mãe 5 mM a 1,275 CGGC ul de 5 mM de formação de amónio pH 7,5 tampão para dar uma solução de 7,5 x 10 -4 M CGGC.

4. Preparaçãode várias misturas de reacção de mercúrio (II) e CGGC

  1. Preparação de 1: 0,5 razão de mercúrio (II): solução CGGC
    1. Coloque 255 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 15 ul de 7,5 x 10 -4 M solução CGGC na microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex a solução durante 10 seg. Deixar a solução repousar durante 10 minutos antes da injecção no espectrómetro de massa.
  2. Preparação de 1: 1 razão de mercúrio (II): solução CGGC
    1. Coloque 240 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. depoisadicionar 30 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.
  3. Preparação de 1: 2 proporção de mercúrio (II): solução CGGC
    1. Coloque 210 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 60 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.

5. Preparação de Solução Stock PECO

  1. Dissolve-se 3,5 mg do tetrapéptido dicysteinyl, PECO, em 0,145 ml de acetonitrilo de grau HPLC para dissolver o péptido. Em seguida, adicionar 5 ml de 13,067 formato de amónio mM, pH 7,5 tampão que foi desgaseif içada em árgon para produzir 0,5 mSolução M PECO.
  2. Vortex a solução até todo o péptido estar dissolvido. Adicionar 1,125 ml de solução 0,5 mM PECO e 0,375 ml de 5 mM de formato de amónio, pH 7,5 tampão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para dar uma solução de 7,5 x 10 -5 M PECO. Vortex até misturado.

6. Preparação de várias misturas de reacção de mercúrio (II) e solução PECO

  1. Preparação de 1: 0,5 razão de mercúrio (II): solução PECO
    1. Coloque 255 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 15 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.
  2. Preparação de 1: 1 razão de mercúrio (II): solução PECO
    1. Coloque 24081; l de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 30 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.
  3. Preparação de 1: 2 proporção de mercúrio (II): solução PECO
    1. Coloque 210 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 60 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.

7. Analyzing as misturas de reacção de mercúrio (II) e as amostras CGGC por Espectrometria de Massa ESI Orbitrap

  1. Preparar o espectrómetro de massa ESI 16
    1. Desenhar 100 ul de padrões de calibração para uma seringa de vidro de 500 ul.
    2. Coloque a seringa no berço seringa da bomba MS, conectar o tubo e injetar no espectrofotômetro de massa.
    3. Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
    4. Selecione o botão de dados adquirem no módulo de aquisição de dados e recolher 150 varreduras.
    5. Analisar o cromatograma para verificar os padrões de calibração, abrindo módulo de processamento de dados do software. Abra o módulo, vá ao menu Arquivo e selecione "abrir", e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verificar que os picos no cromatograma correlacionam-se com a massa para razões de carga dos padrões.
    6. Limpe a seringa de vidro de 500 mL através da elaboração de 500 ul grau HPLC metanol e, em seguida, distribuir a metanol dentro de uma proveta.
    7. Elaborar 500 mL de metanol de grau HPLC para a seringa de vidro e lave o sistema de acordo com o passo 7.1.2.
    8. Selecione o módulo de configuração do método de o software para definir os parâmetros. Escolha o menu do modo de digitalização e identificar o analisador como FTMS, e depois clique em "OK". Em seguida, clicando sobre os vários ícones na página espectro de visão em tempo real, definir os seguintes parâmetros: Bainha caudal do gás: 10, temperatura Fonte: 0, a tensão capilar: 37 V, lente Tubo: 95 V, tensão Spray: 4.20 kV , taxa de fluxo 10.00 l / min, Analyzer: FTMS, Número de análises: 150.
  2. Correr amostras CGGC no espectrômetro de massa ESI
    1. Executar o formato de amónio, pH 7,5 tampão de 5 mM.
      1. Coloque 500 mL de tampão formato de amónio 5 mM para a seringa de vidro de 500 ml, coloque-o no suporte da bomba de seringa MS, e anexar a tubulação.
      2. Tampão executado através da tubulação para 1-2 min.
      3. Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
      4. Selecione o botão de dados adquirem no módulo e recolher 150 varreduras.
      5. Clique no botão Executar para parar a coleta depois de 150 scans são coletados.
      6. Abra o módulo do navegador de dados, em seguida, vá ao menu Arquivo e selecione "Abrir" e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verificar que não há picos a 483, 683, 1.163 e 1.363 m / z estão presentes que assemelham-se o péptido ou de mercúrio (II) -péptido.
    2. Executar a 1: 0,5 de mercúrio (II): solução proporção CGGC.
      1. Coloque 250 ul de 1: 0,5 de mercúrio (II): proporção CGGC da amostra para a seringa.
      2. Coloque a seringa no suporte de seringa da bomba de MS, conectar o tubo, e preparar o aparelho.
      3. Escolha um nome de arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
      4. Pressione o botão adquirir dados no módulo de aquisição de dados e recolher 150 scans e clique no botão de execução para parar a coleção.
      5. Abra o módulo, vá ao menu Arquivo e selecione "abrir", e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verifique se o cromatograma contém picos incluindo aquela para o peptídeo CGGC sozinho.
      6. Lava-se a seringa por aspiração com tampão de formiato de amónio e, em seguida, 500 ul de tampão de distribuir o formato de amónio para um copo.
      7. Selecione o botão de resíduos no MS e lave o tubo três vezes com 500 ul de tampão formato de amónio.
      8. Lava-se a seringa por aspiração com 500 ul de metanol e, em seguida, a distribuição do metanol para uma proveta.
      9. Lave a tubulação de uma vez com 500 mL de metanol.
      10. Escolha um botão detector carga sobre os MS.
      11. Adicionar 500 ul de tampão de formato de amónio para a seringa.
      12. Coloque a seringa no suporte de seringa da bomba de MS, conectar o tubo, e preparar o aparelho.
      13. Escolha um nome de arquivo para o buffer de executar, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
      14. pressioneo botão e dados adquirem coletar 150 scans e, em seguida, clique no botão de parada de execução.
      15. Abra o módulo do navegador de dados, vá ao menu Arquivo e selecione "Abrir" e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verifique se o cromatograma é nula de picos do anterior Hg: run CGGC.
    3. Executar a 1: 1 de mercúrio (II): solução proporção CGGC.
      1. Coloque 250 ul de 1: 1 de mercúrio (II): CGGC razão amostra para a seringa.
      2. Repita de uma maneira semelhante ao descrito para Passos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.
    4. Executar a 1: 2 de mercúrio (II): solução proporção CGGC
      1. Coloque 250 ul de 1: 2 de mercúrio (II): CGGC concentração da amostra para a seringa.
      2. Repita de uma maneira semelhante ao descrito para Passos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.

8. Analisando as misturas de reacção de Mercúrio e amostras dos PECO por Orbitrap ESI Espectrometria de Massa

  1. Correr amostras dos PECO no espectrômetro de massa ESI
    1. Procedimento de análise de repetição (Passos 7.1 para 7.2) usando amostras PECO e misturas de reacção de mercúrio (II) e em vários PECO proporções estequiométricas.

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Resultados

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Foi realizado um estudo para caracterizar a composição complexa de mercúrio de peptídeo possível que dois tetrap�tidos, CGGC e PECO (Figura 1) por espectrometria de massa ESI. Complexos de mercúrio (II) com CGGC ou PECO foram investigados por meio de reacção das misturas de mercúrio (II) e as soluções de péptidos em diferentes relações molares: 1: 0,5, 1: 1 e 1: 2 (mercúrio (II): péptido) . A concentração de mercúrio (II) foi de 7,5 x 10 -6 M e a concentraçã...

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Discussão

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O tetrapéptido dicysteinyl hidrofóbico CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; PM = 338) (Figura 1), forma complexos com o mercúrio (II) como mostrado na Figura 2 e Tabela 1 Além disso, forma-se dímeros de péptidos e trímeros. incremental à medida que aumenta a quantidade de de péptidos na mistura de reacção. Como mostrado pelos valores de m / z dos dimeros associados [(2M + H) + = 677] e trímeros [...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há divulgação para o trabalho relatado.

Agradecimentos

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MN-S reconhece o apoio da National Science Foundation, RUI conceder CHE 1011859. Os autores agradecem a Facilidade Triad Espectrometria de Massa da Universidade de Carolina do Norte em Greensboro para uso do espectrômetro de massa Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Os autores agradecem Daniel Todd, Vincent Sica, e Brandie Erhmann na Universidade da Carolina do Norte em Greensboro para sugestões e comentários sobre este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de mercúrio (II)Sigma-Aldrich429724Altamente tóxico
Formiato de amônioSigma-Aldrich516961
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507
Hidróxido de amônioFisherA512-P500
HPLC águaFisherW5-4
HPLC AcetonitrilaFisherBP2405-1
HPLC MetanolFisherA452-4

Referências

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