Para identificar novas mutações que afetam a mecanosensação, projetamos um ensaio que mede a resposta comportamental à estimulação tátil de cerdas de moscas em clones mutantes gerados pelo método MARCM. A combinação de técnicas permite a identificação de mutações mecanossensíveis que, de outra forma, seriam letais.
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Artigo de método
Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em
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Resumo
Resumo
Devido à homologia estrutural e funcional para as células ciliadas do ouvido interno de mamífero, os neurónios que enervam os órgãos dos sentidos de Drosophila externos proporcionam um excelente sistema modelo para o estudo de mechanosensation. Este protocolo descreve um comportamento simples toque na mosca da fruta, que podem ser utilizados para identificar as mutações que interferem com mechanosensation. A estimulação táctil de um macrochaete cerdas sobre o tórax de moscas provoca um reflexo da preparação a partir de qualquer da primeira ou terceira perna. As mutações que interferem com mecanotransdutores (tais como NOMPC), ou com outros aspectos do arco reflexo, pode inibir a resposta de preparação. Uma tela tradicional de comportamentos adultos teria perdido mutantes que têm papéis essenciais durante o desenvolvimento. Em vez disso, este protocolo combina a tela de toque com a análise do mosaico com um marcador de células repressible (MarcM) para permitir apenas regiões limitadas de células mutantes homozigotos para ser gerado e marcado pela exprESSÃO da proteína verde fluorescente (GFP). Ao testar clones MarcM para respostas de comportamento anormal, é possível rastrear um conjunto de mutações letais p-elemento de pesquisa para novos genes envolvidos no mechanosensation que teriam sido perdidas por métodos mais tradicionais.
Introdução
Os humanos contam com a capacidade de converter estímulos mecânicos de seu ambiente, como toque, pressão, vibração ou ondas sonoras, em informações sensoriais que podem ser processadas pelo sistema nervoso, em um processo denominado mecanotransdução. Muitas das características mecanicistas gerais da mecanotransdução entre humanos e invertebrados são as mesmas1, tornando a Drosophila um modelo útil para estudar os mecanismos moleculares da mecanotransdução. Drosophila melanogaster contém dois conjuntos de órgãos sensoriais especializados (Tipo I e II) que são capazes de converter estímulos mecânicos em potenciais de ação. Os mecanorreceptores tipo I possuem um neurônio com um único dendrito ou processo sensorial, circundado por três células de suporte2. Os mecanorreceptores Tipo I incluem mecanorreceptores de cerdas, órgãos cordotonais sensíveis à audição (órgão de Johnston) e sensilas campaniformes que transmitem informações sobre batimentos de asas3. As cerdas que cobrem o lado dorsal da mosca são as mais abundantes e facilmente acessíveis dos órgãos do Tipo I. Semelhante ao ambiente extracelular das células ciliadas associadas à audição e ao equilíbrio em vertebrados, as células de suporte ao redor dos neurônios mecanossensíveis da mosca secretam uma alta endolinfa de potássio que cria um gradiente de concentração incomum para o potássio1. Os neurônios mecanossensíveis, tanto do sistema de mamíferos quanto dos de moscas, utilizam esse alto potássio extracelular para despolarizar a célula. Em resposta à estimulação mecânica das cerdas dos macroquetas em direção à parede corporal, os neurônios sensoriais respondem com uma explosão de potenciais de ação impulsionados por essa despolarização de potássio da membrana celular4. Os neurônios sensoriais da Drosophila que inervam as cerdas se assemelham às células mecanossensíveis de outros organismos, incluindo células ciliadas de vertebrados, tanto em estrutura quanto em função1,5. A acessibilidade dos órgãos sensoriais externos da Drosophila à manipulação experimental e a abundância de técnicas genéticas disponíveis para os pesquisadores tornam a Drosophila um excelente sistema modelo para investigar os fundamentos moleculares da mecanosensação.
Na mosca, a estimulação de um único neurônio sensorial que inerva uma cerda leva a uma resposta comportamental observável. A estimulação de diferentes cerdas evoca respostas comportamentais específicas e reprodutíveis, dependendo da cerda que é estimulada. Após a estimulação tátil, as moscas decapitadas do tipo selvagem exibem um reflexo de limpeza complexo, no qual limpam a área próxima à cerda estimulada com um conjunto padronizado de movimentos das pernas5-7. Quando homozigotos para mutações conhecidas de um único gene que interferem no aprendizado7 ou na coordenação e atividade locomotora5, as moscas respondem de forma anormal à estimulação mecânica. Esse reflexo de aliciamento é, portanto, uma ferramenta útil para estudar os efeitos de mutações de um único gene em um comportamento específico e replicável.
A resposta comportamental robusta à estimulação de uma única cerda de macroqueta tem o potencial de auxiliar na identificação de novos genes envolvidos na mecanotransdução. Este protocolo está sendo usado para testar uma coleção de moscas mutantes quanto à ausência de uma resposta comportamental para indicar que a mutação interfere na mecanosensação. Na coleção de mutantes selecionada para triagem, as mutações causam letalidade antes da idade adulta e, portanto, seriam impossíveis de testar usando as telas tradicionais de comportamento adulto. Originalmente, essa coleção de elementos p letais foi combinada com locais de recombinação de FRT para testar defeitos de crescimento celular em clones. Os clones foram feitos especificamente no olho porque as moscas adultas podem sobreviver no ambiente de laboratório sem visão funcional8. No entanto, a remoção de todas as mecanossensações pode fazer com que os adultos fiquem gravemente descoordenados ou morram antes da eclosão5. Este protocolo usa uma abordagem de mosaico para contornar a letalidade das mutações e permitir testes em estágio adulto. Uma técnica genética chamada Análise de Mosaico com um Marcador de Células Repressíveis (MARCM)9 é usada para gerar células mutantes homozigóticas em um número limitado de órgãos sensoriais de moscas adultas, enquanto o resto do organismo permanece heterozigoto. Essas moscas MARCM sobrevivem prontamente até a idade adulta, mas as cerdas são homozigotas para os genes letais de interesse.
MARCM permite que regiões de células mutantes homozigóticas sejam geradas e marcadas pela expressão da proteína fluorescente verde (GFP), enquanto o resto do organismo permanece heterozigoto naquele locus específico e não marcado9. O MARCM combina mutações individuais do elemento p com cinco elementos genéticos comuns: GFP sob o controle de uma sequência ativadora a montante (UAS-GFP), proteína repressora Gal80 sob controle de um promotor geral (tub-Gal80), fator de transcrição Gal4 sob controle de um promotor geral (tub-Gal4), a enzima FRT recombinase expressa por meio de um promotor controlado por choque térmico e um local de recombinação FRT10. Ao conduzir a recombinação mitótica por meio de uma recombinase ativada por choque térmico, um número limitado de células é homozigoto para a mutação e marcado com GFP. A expressão de GFP é reprimida em células heterozigóticas pela presença de Gal80 na cópia do cromossomo do tipo selvagem.
Um protocolo de choque térmico para MARCM foi otimizado para induzir a recombinação nos órgãos sensoriais externos das cerdas da mosca, enquanto grande parte do organismo permanece heterozigoto e, portanto, não marcado com GFP. As moscas do mosaico geradas usando este protocolo continham mutações homozigóticas mais frequentemente nas cerdas centrais pós-alares ou dorsais na superfície do notum.
Testamos a utilidade dessa combinação de MARCM e a tela de comportamento de limpeza com um mutante mecanossensível conhecido, NOMPC. O canal iônico, sem potencial mecanorreceptor C (NOMPC), é um componente essencial da via de mecanotransdução em Drosophila5,11-13. O NOMPC pertence à superfamília de canais catiônicos5 do potencial receptor transitório (TRP) e satisfaz todos os critérios para se qualificar como um canal mecanossensível em Drosophila14,15: 1) O NOMPC é expresso nas pontas ciliadas dos neurônios sensoriais tipo 1 de Drosophila 13,16-18, 2) As larvas nulas do NOMPC não têm uma resposta elétrica à estimulação tátil13, 3) A expressão ectópica de NOMPC em células insensíveis ao toque pode induzir sensibilidade à estimulação mecânica13, 4) a expressão heteróloga de NOMPC em células Schneider 2 produz um canal mecanossensível13 e 5) os mutantes adultos NOMPC exibem defeitos em sua resposta à estimulação mecânica5. Dada essa evidência, previmos que os clones mutantes do NOMPC mostrariam uma resposta de limpeza alterada ou inibida em resposta à estimulação mecânica das cerdas.
Um estoque MARCM contendo a mutação NOMPC foi desenvolvido para uso em um experimento de prova de princípio do ensaio de aliciamento. As moscas-mosaico foram estimuladas em cerdas de macroquetas contendo células mutantes homozigóticas de NOMPC. Esperávamos uma inibição da resposta de limpeza após a estimulação das cerdas dos macroquetas. Descobrimos que apenas 2 das 14 moscas de cerdas mutantes testadas deram uma única resposta à estimulação repetida; A maioria não respondeu à estimulação da cerda mutante homozigótica. Tendo confirmado que este ensaio comportamental baseado em MARCM produz um reflexo de limpeza anormal em um mutante de mosaico mecanossensível conhecido, esta técnica pode ser usada em uma triagem para mutações mecanossensíveis adicionais.
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Protocolo
1. Cruzes para gerar Flies MarcM
- Manter moscas em meios de fubá melaço (6,5 g / L de agar; 23,5 g / L de levedura; 60 g / L da farinha de milho; 60 ml / L de melaço; 4 ml / mistura de ácido L; 0,13% Tegosept) ou mídia Drosophila padrão a 22 graus Celsius num ciclo luz / escuro de 12 h.
Nota: A Baixa de temperatura padrão é usado para manter MarcM-stocks saudável. Isso amplia o tempo de desenvolvimento entre ovo e idade adulta para 14 dias. - Use fêmeas virgens (cerca de 1 - 8 dias de idade) a partir de um estoque MarcM-pronto contendo os elementos genéticos necessários (GFP sob o controlo de uma sequência a montante activadora (UAS-GFP), a proteína repressora Gal80, o factor de transcrição Gal4, uma de choque térmico recombinase com motor, e um local de recombinação FRT).
Nota: Nossa MarcM prontos-existências conter os seguintes genótipos: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb.
Nota: O local DRF específico dependerá da localização da mutaçãono genoma. Por exemplo, FRT40A é usado para testar as mutações no braço esquerdo do cromossoma 2, tal como NOMPC (ver 10 para mais detalhes sobre os protocolos MarcM). - Fêmeas virgens Cruz MarcM pronto para homens que contêm uma mutação de interesse e seu correspondente local DRF (por exemplo, w-; NOMPC3, FRT40A / CYO; + / +). Para controlar a indução MarcM eficaz, definir uma segunda cruzada usando as moscas macho contendo o mesmo local DRF, mas sem uma mutação. Use uma proporção aproximada de 5 fêmeas: 1 macho em cruzamentos.
2. Temporário postura de ovos
- Depois de permitir que as moscas para acasalar para pelo menos uma noite, mover adultos em novos tubos de ensaio com meio fresco. Permitir moscas para colocar ovos em um ambiente escuro por cerca de 4 horas antes de voltar a transferir as cruzes em novos frascos. Observe os horários de início e de término do período de postura de ovos.
Nota: Intervalos mais curtos são aceitáveis quando parece haver um elevado número de ovos sobre a mídia antes do final do interva 4-hreu.- Mantenha os frascos com um número suficiente de ovos (aproximadamente superior a 20) e armazenar em um ciclo claro / escuro de 12 horas a 22 graus Celsius para ser a choque térmico posterior.
Nota: Os frascos com um baixo número de ovos na mídia (menos de cerca de 20) não são susceptíveis de produzir um número suficiente de moscas adultas para o teste comportamental e no interesse da eficiência, recomenda-se não ser retidos por mais testes.
Nota: Os nossos moscas são levantadas com as luzes acesas 08:00-20:00. Nós descobrimos que o tempo do entardecer pontos levam a densidades mais elevadas de ovos, por isso costumam realizar cruzamentos programados entre 4-8 pm e 8:00-meia-noite. As moscas põem os seus ovos à temperatura ambiente numa câmara escura e, em seguida, são devolvidos para a incubadora no dia seguinte, de modo a não perturbar o ciclo de luz-escuro normal na incubadora.
- Mantenha os frascos com um número suficiente de ovos (aproximadamente superior a 20) e armazenar em um ciclo claro / escuro de 12 horas a 22 graus Celsius para ser a choque térmico posterior.
3. Execute choque térmico para induzir Mitotic Recombinação
- Cerca de 85-100 horas após a postura dos ovos, lugar vIals num banho de água a 37 graus Celsius durante 1 hora. Certifique-se que o nível da água atinge acima da altura dos meios de comunicação nos frascos, mas não submergir totalmente os frascos para evitar que as larvas do afogamento.
- Remova frascos de banho de água e permitir um período de recuperação de 1 hora em temperatura ambiente.
- Colocar os frascos de volta para 37 graus Celsius banho de água durante 1 h.
- Remova frascos de banho de água e guarde na incubadora em 12 horas ciclo claro / escuro, a 22 graus Celsius até eclosão.
4. Preparação para o Teste Comportamental
- Seguindo eclosão, anestesiar moscas no gelo. Selecione moscas com genótipos que contêm todos os elementos genéticos para MarcM e indicam clones marcados de expressão GFP provavelmente será observado com base nos marcadores fenotípicos observáveis usados nos estoques pai. Decapitar moscas com iridectomy tesoura.
Nota: Por exemplo, foram selecionados para as moscas sem os marcadores genéticos CYO (asas chaves) e Sb (cerda restolho) a identimoscas fy que contêm todos os elementos genéticos necessários para criar regiões de mosaico marcadas com GFP.
Nota: decapitação é necessário para evitar que os adultos de voar para longe quando estimulados. - Coloque moscas sem cabeça em um ambiente fechado, úmido e permitir que cerca de 10-20 horas de recuperação. Só uso voa esse direito-se quando perturbado por mais testes. Teste voa dentro de 30 horas de decapitação.
5. Teste Comportamental
- Ao observar moscas decapitados sob um microscópio de fluorescência de dissecação, os clones homozigóticos identificar marcadas com GFP nas cerdas órgãos sensoriais externas. Grave o nome de cerdas e do lado esquerdo ou direito. Para eliminar qualquer viés potencial, o membro do laboratório de realizar a estimulação de cerdas devem ser cego para o genótipo da cerda, do tipo selvagem ou mutante.
- Provocar um reflexo aliciamento, desviando o GFP marcado cerda para o corpo da mosca com um cabelo duro ou uma pinça fina e observar a re pernasponse. Dê uma nota de um a moscas que levantar a perna em resposta à estimulação de cerdas e uma pontuação de zero a moscas que não se movem as suas pernas.
Nota: Anterior estudos 6,7 caracterizaram a resposta perna que é provocada por estimular uma cerda particular. Isto inclui a perna que responde a cada cerda e a percentagem de moscas que respondem à estimulação de cerdas que em particular. Nós só marcou para os movimentos da perna que o esperado para responder baseado na classificação de Vandervorst 6. - Realizar cinco ensaios espaçados 2 min de intervalo.
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Resultados
O sucesso deste protocolo depende em grande medida o rendimento global de moscas testáveis, a eficácia do choque térmico para induzir a recombinação mitótica, e a capacidade de obter uma resposta comportamental robusto em moscas estimuladas em intervalos de 2 min. Dado que cerca de 12,5% de embriões conter os elementos necessários MarcM e estima-se que 16,67% da população adulta que EFeche têm o potencial para a expressão de GFP, que é fundamental para obter um elevado número de ovos dur...
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Discussão
Este protocolo utiliza um ensaio comportamental adulto para o rastreio de mutações que afectam mechanosensation em Drosophila. Uma vez que a colecção de mutantes contém letais mutações P-elemento, que evitarão a rastreio como adultos, este protocolo faz uso de uma técnica genética complexa primeiro descrito por Lee e Luo , (1999) e detalhada como um protocolo por Wu e Luo, (2006) para contornar adulto letalidade. MarcM induz recombinações mitóticas entre cromossomos homólogos para gerar regiões clonais de célul...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam agradecer o centro de Bloomington estoque, Liqun Luo, Charles Zuker, e Lily e Yuh Nung Jan para a partilha generosa de ações da mosca ea seguinte para financiamento: SOMAS-URM (de JD e SW), Bacharel Ford Faculdade de Verão Fellowship (a sudoeste), BD Corporação Verão Research Fellowship (a CL e DL), The Renee e Anthony M. Marlon, MD '63 Verão Research Fellowship (a DL) James C. '75 e Jane Colihan Verão Research Fellowship (TO) através os alunos / pais Fundo do College of the Holy Cross Research Verão e da Fundação Stransky Research Fellowship Verão (a TO). Um agradecimento especial ao Departamento de Biologia e Gabinete do Reitor da College of the Holy Cross para o apoio de todo o trabalho no laboratório.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Levedura de Cerveja (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Comida para moscas |
| Milho (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Comida para moscas |
| Ágar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Comida para moscas |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Melaço |
| para moscas (1 galão) | Marca Sugarmill - Thomsen Food Service | 0 2625 | Comida |
| moscas Ácido propiônico | Fisher | A258-500 | Comida para moscas |
| Ácido fosfórico | Fisher | A260-500 | |
| Frascos de Drosophila para comida para moscas, estreitos (PS) | Genesee | 32-109 | Culturas de moscas |
| Garrafa de Fundo Quadrado de 6oz (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Garrafas de Plástico para Moscas | Genesee | 49-100 Bolas de | Rayon para Culturas |
| Moscas, Grande | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Estreito | Genesee | 59-168 Preparação de | Alimentos para Moscas |
| Droso-Filler, Garrafas | Genesee | 59-170 | Comida para Moscas Preparação |
| 8A-C / agitador de laboratório acionado por engrenagem com montagem c-clamp 1/15 HP, velocidade variável de 700 rpm, 115 V, 50/60 Hz | Misturador Cleveland | 8A-C | Preparação de Alimentos para Moscas |
| com camisa de água | |||
| Crescimento Diurno | Forma Científica | Controlado por temperatura e ciclo claro/escuro | |
| Banho-maria | VWR | Para calor | |
| choque MicroTesouras | Ferramentas de Belas Ciências | 15000-08 | Para remover cabeças |
| Microscópio de Dissecção de Fluroscência | Zeiss | SteREO Discovery V8 | Com filtro passa-banda GFP cube (KSC295-814D) |
| Fonte de Luz Fluroscence | Zeiss | X-Cite 120 | O tubo de luz de fibra óptica facilita a configuração |
| Câmera para o software | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| acquirion da imagem | do espaço Zeiss | ||
| Balde | para anthesia fria | ||
| Bandeja | para decapitação de anthesia fria | ||
| Caixas | plásticas para recuperação de moscas decaptitadas em ambiente úmido |
Referências
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Reimpressões e permissões
