O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.
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Artigo de método
High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células ganglionares da retina (RGCs) recebem entrada glutamatérgica excitatória das células bipolares. A excitação sináptica de RGCs é mediada pós-sinapticamente por receptores NMDA (NMDARs) e receptores AMPA (AMPARs). Dados fisiológicos indicaram que os receptores de glutamato nos RGCs são expressos não apenas nos compartimentos da membrana pós-sináptica, mas também nos compartimentos da membrana perissináptica ou extra-sináptica. No entanto, localizações anatômicas precisas para receptores de glutamato nas sinapses RGC não foram determinadas. Embora uma análise quantitativa de alta resolução dos receptores de glutamato nas sinapses centrais seja amplamente empregada, essa abordagem teve apenas sucesso limitado na retina. Desenvolvemos um método de imunoouro pós-incorporação para análise de receptores de membrana, possibilitando estimar o número, densidade e variabilidade desses receptores nas sinapses da fita retiniana. Aqui descrevemos as ferramentas, reagentes e as etapas práticas necessárias para: 1) preparação bem-sucedida da fixação da retina, 2) substituição por congelamento, 3) imunocitoquímica do microscópio eletrônico (EM) de imunomagnetização pós-incorporação e, 4) visualização quantitativa dos receptores de glutamato nas sinapses da fita.
Introdução
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório na retina 1. Células ganglionares da retina (RGCs), recebendo entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, são os neurônios de saída da retina que enviam a informação visual ao cérebro. Estudos fisiológicos mostraram que a excitação sináptica das CGR é mediada por receptores de NMDA pós-sinapticamente (NMDAR) e os receptores de AMPA (AMPARs 3,4,5). Embora correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) em RGCs são mediadas por AMPARs e NMDAR 3,5,6,7,8, EPSCS miniatura espontâneas (mEPSCs) em RGCs exibem apenas um componente AMPARs mediada 4,5,9.<....
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Protocolo
Cuidados e manipulação dos animais estavam em conformidade com o NIH Animal Care e as diretrizes de uso das Comissões. dia pós-natal (P) 15-21 ratos Sprague-Dawley, injectados com 1-1,2% de CTB bilateralmente através do colículo superior, foram mantidos num 12: 12-h luz: ciclo escuro.
1. Fixação tecido da retina
- Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinça com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.
- Anestesiar o rato numa câmara fechada, com 2,0 ml de halotano (um anestésico de inalação). Determinar anesthetization ....
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Resultados
Os resultados aqui apresentados demonstram contundentemente diferentes padrões de localização subsináptica de GluA 2/3 e NMDAR em dendrites RGC em retina de ratos, conforme descrito anteriormente 24,25. 77% das partículas de imunomarcação GluA 2/3 em perfis dendríticos RGC foram localizados dentro do PSD (Figura 1A), semelhante à maioria das sinapses centrais. No entanto, NMDAR foram localizados quer sinapticamente ou extrasynaptically. 83% das partículas de i.......
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Discussão
Nós descrevemos quatro técnicas para quantitativa pós-incorporação immunogold EM sucesso: 1) curta e fraca fixação, 2) freeze-substituição, 3) pós-incorporação coloração imuno, e 4) quantificação.
EM imuno permite a detecção de proteínas específicas em secções de tecido ultrafinas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pode ser directamente visualizada utilizando EM. Enquanto poderosa na detecção da localização subsináptica de um receptor de membrana, EM immunogold pode ser tecnicame.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos programas internos do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) e do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação (NIDCD), um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Agradecemos a instalação de NINDS EM e do núcleo NIDCD Advanced Imaging (código # ZIC DC 000081-03) para obter assistência.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeído | EMS | 15710 | |
| Glutaraldeído | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glicerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Diluição 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Diluição 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Diluição 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1– 046 | Diluição 1/100 |
| Burro anti-coelho IgG-10 nm partículas de ouro | EMS | 25704 | Diluição 1/20 |
| Burro anti-rato IgG-10 nm partículas de ouro | EMS | 25814 | Diluição 1/20 |
| Burro anti-rato IgG-5 nm partículas de ouro | EMS | 25812 | Diluição 1/20 |
| Burro anti-cabra IgG-18 nm partículas de ouro | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Diluição 1/20 |
| Grelhas de ranhura de níquel revestidas com Formvar-Carbono. | EMS | FCF2010-Ni | |
| acetato de uranilo | EMS | 22400-1 | |
| Metanol | EMS | 67-56-1 | |
| Citrato de chumbo | Leica Leica | ||
| EM AFS | Leica Leica | ||
| EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrótomo | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | Nitrogênio líquido JEOL | ||
| Roberts Oxigênio | |||
| Propano | Roberts Oxigênio | ||
| CTB | Lista Laboratórios Biológicos | 104 | 1 - 1,2% |
| Anti-CTB | Laboratórios Biológicos | 703 | Diluição 1/4.000 |
Referências
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W.....
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Reimpressões e permissões
