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Artigo de método

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

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DOI:

10.3791/53559

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21 de fevereiro de 2016

1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Neste artigo

Resumo

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Resumo

Nos últimos anos, os cílios primários surgiram como reguladores-chave no desenvolvimento e na doença, influenciando inúmeras vias de sinalização. Uma das primeiras vias de sinalização associadas à função ciliar foi a via de sinalização Wnt não canônica, também conhecida como sinalização de polaridade celular planar (PCP). Um dos melhores lugares para estudar os efeitos da sinalização da polaridade das células planares (PCP) durante o desenvolvimento dos vertebrados é a cóclea dos mamíferos. A interrupção da sinalização de PCP na cóclea do camundongo interrompe o crescimento coclear, o padrão celular e a orientação das células ciliadas, todos afetados pela disfunção dos cílios. O objetivo deste protocolo é descrever a análise da sinalização de PCP na cóclea de mamíferos em desenvolvimento por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura. Defeitos na convergência e extensão se manifestam como um encurtamento do ducto coclear e/ou alterações no padrão celular, que podem ser quantificados após a dissecção de mutantes de camundongos em desenvolvimento. Alterações na orientação do feixe estereociliar e no comprimento ou posicionamento dos cinocílios podem ser observadas e quantificadas usando imunofluorescência ou microscopia eletrônica de varredura (MEV). Uma visão mais profunda do papel das proteínas ciliares nas vias de sinalização celular e outros fenômenos biológicos é crucial para nossa compreensão da biologia celular e do desenvolvimento, bem como para o desenvolvimento de estratégias de tratamento direcionadas.

Introdução

cílios são apêndices longos à base de microtúbulos que se estendem a partir da superfície da maioria das células de mamífero. cílios são muitas vezes confundidos com cílios móveis, dos quais há sempre múltiplas por célula, e cuja finalidade é mover o líquido através de superfícies de membranas. cílios, ao contrário, adotar papéis sensoriais e são, consequentemente, também referida como cílios sensorial. Uma vez que há muito esquecido, esta organela foi recentemente 'redescoberto' como resultado de sua associação com uma infinidade de doenças genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como um organelo de sinalização, o cílio primário tem sido demonstrado que regulam numerosas vias de sinalização, muitas das quais são importantes, não só na homeostasia dos tecidos e doença, como também durante o desenvolvimento 2.

Uma das primeiras vias de sinalização mostrado estar associada com disfunção cílios foi a via de sinalização Wnt não canónicas, também conhecida como a polaridade celular planar (PCP) via > 3. Esta cascata de sinalização inicialmente identificado em Drosophila, é crítico para a embriogénese; em particular para os processos de convergência e de extensão e para a orientação correcta de células no plano de epitélios 4. A sinalização sequencial de um núcleo de um conjunto de proteínas reguladoras traduz sinais direccionais que em última análise levam a rearranjos do citoesqueleto e resultam na polarização coordenada de células epiteliais num plano 5. O processo de convergência e de extensão é absolutamente necessária para o ducto coclear para alongar e para a correcta modelação celular 6. Como este é regulado através da activação da via de PCP, um dos mais marcantes de fenótipos mutantes PCP cóclea é um ducto coclear encurtado com desorganizado epitélio sensorial 7. Da mesma forma, ratos mutantes, que não têm cílios, também apresentam como uma convergência e extensão fenótipo 8,9, embora precisamente como isso é regulado continua a ser elucidado.

ve_content "> Como os processos de convergência e de extensão são críticas para o crescimento do ducto coclear, e padronização celular do epitélio sensorial dentro do ducto coclear, na cóclea em desenvolvimento é um órgão ideal para analisar a sinalização PCP durante o desenvolvimento dos vertebrados. O órgão de Corti, o termo dado para o epitélio sensorial especializado que as linhas do ducto coclear, é constituído por células de suporte não-sensoriais e células ciliadas mecanosensorial que devem ser uniformemente orientada para a cóclea para funcionar 10. as células ciliadas mecanosensorial são assim chamados por causa da feixes stereociliary que se estendem a partir da placa cuticular (superfície apical) de cada uma das células pilosas sensitivas 11. Estes agem como transdutores primárias de mechanosensation e apesar da sua nomenclatura como estereocílios, são na verdade, composto de microvilosidades à base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada cabelo em forma de viga pacote, três fileiras de estereocílios são organizados em uma pa altamente ordenada e regular,ttern em um caso semelhante a forma de escada. Cílios à base de microtúbulos real, kinocilia chamados, são necessários para o desenvolvimento e orientação dos feixes stereociliary 12. Em cima de cada célula de cabelo, um único cinocílio está fisicamente ligado ao pacote stereocilia, com localização central adjacente à linha mais alta de estereocílios. A função precisa da cinocílio não é clara, e uma hipótese é que a cinocílio 'puxa' estereocílios em forma à medida que amadurecem a partir microvilosidades 12. Nos vertebrados, kinocilia na cóclea estão presentes apenas transitoriamente e retrair a partir das células ciliadas em ratos antes do início da audição 11,13,14.

Perda completa dos cílios na cóclea em desenvolvimento resulta em ductos cocleares severamente encurtado, mis-formados e mal-orientada feixes stereociliary, bem como corpos basais mis-posicionado 8,9. Um cílio funcional não é apenas composto pelo axonema ciliar. Muitas proteínas associadas com cíliosfunção ocorrem em complexos localizados para subdomínios cílios-relacionadas, como o corpo basal, zona de transição, ou axonema ciliar 15. O corpo basal, derivado do centriole mãe do centrossoma, é também um centro-organização de microtúbulos de microtúbulos que se estendem para longe do cílio para o corpo celular e pode regular o tráfico intracelular, bem como o tráfico ciliar. A zona de transição ciliar é outra região onde a função ciliar é regulada em termos de organização de importação e exportação de compostos ciliares 16.

Vários estudos têm identificado uma ligação entre os cílios e Wnt não canónicas (sinalização PCP), embora o mecanismo exacto é incerto 17. Redundância dos genes ciliares e do PCP e da sensibilidade da polaridade celular para anormalidades celulares generalizadas, tornam difícil ligar diretamente uma mutação a déficits específicos do PCP. Uma das saídas de leitura de sinalização PCP é o posicionamento do corpo basal e Primary cílio, portanto, segregando o principal dos defeitos secundários é um desafio. Alguns estudos em peixes-zebra e mouse mutantes sugeriram nenhuma conexão entre os cílios e sinalização Wnt 18-20. Discrepâncias nos dados podem refletir espécies, tecidos ou diferenças temporais dependentes das contribuições ciliares no sentido de sinalização Wnt. Além disso, a capacidade de resposta Wnt normal, pode ser mantido se os corpos basais permanecem funcionais. Uma visão mais profunda sobre o papel das proteínas ciliares em vias de sinalização celular e outros fenômenos biológicos é crucial para a nossa compreensão da biologia celular e de desenvolvimento, bem como para o desenvolvimento de estratégias de tratamento direcionados.

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Protocolo

Use e sacrificar todos os animais de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais e governamentais, mais comumente através de inalação de CO 2 e deslocamento cervical.

1. Preparação dos Reagentes

NOTA: Antes de começar, prepare todos os reagentes utilizando reagentes de qualidade analítica. Faça soluções utilizando grau molecular água destilada e deionizada salvo indicação em contrário.

  1. Salina tamponada com fosfato (PBS 1x): Adicione 1 L de 1x PBS dissolvendo 8g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 1 L de H 2 O. Ajustar o pH para 7,4 com HCl. O PBS não necessitar de ser estéreis e podem ser armazenados à temperatura ambiente. Note-se que esta reserva é feita sem CaCl2 ou MgCl2.
  2. Paraformaldeído (PFA a 4%): Prepara-se uma solução a 4% de PFA em PBS 1x numa hotte ventilada. Adicionar 40 g de pó de paraformaldeído a 1 L de 1x PBS. Para dissolver, agitar e aquecer até aproximadamente 60 ° C,e adiciona-se lentamente gota a gota de NaOH para aumentar o pH. Uma vez que o pó se dissolva, reajustar o pH para 7,4 com HCl. Filtrar através de um filtro de 0,45 um e congelar alíquotas. Descongelar uma nova porção para cada experimento.
  3. tampão Triton: Prepara-se uma M de Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5), NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 a solução através da dissolução de 8,77 g de NaCl em 1 L de Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5). Adicionar 1 mL de Triton X-100. Agita-se para dissolver. Loja tampão Triton à TA.
  4. Triton bloco: preparar o soro de cabra a 10% em tampão Triton pela adição de 1 ml de soro de cabra a 9 ml de tampão Triton. Armazenar a 4 ° C. Se usando anticorpos primários produzidos em ratinhos, adicionar de cabra anti-IgG de ratinho fragmentos Fab a uma diluição de 1 em 200 para o bloco de Triton para o passo de bloqueio.
    NOTA: Se pretende utilizar amostras para microscopia eletrônica de varredura (SEM), preparo de reagentes adicionais, conforme listado abaixo.
  5. Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) com cálcio e magnésio: Adicione uma solução de HBSS 1x por diluição a partir de uma solução estoqueno estéril destilada H 2 O. Como tampão HBSS é complicado de fazer e há riscos envolvidos, é aconselhável pedir uma solução 10x estoque premade. A concentração final de HBBS tampão rotineiramente utilizados é a seguinte: 1,26 mM de CaCl 2, MgCl 2 0,49 -6H2O, 0,41 mM MgSO 4 -7H2O, KCl 5,33 mM, KH 0,44 mM 2 PO 4, 4,17 mM de NaHCO3, NaCl 137,93 mM , 0,34 mM de Na 2 HPO 4, dextrose 5,56 mM.
  6. tampão Hepes: Prepara-se uma solução 0,1 M de Hepes em 1X HBSS, por dissolução de 23,8 g de HEPES em 1 L de tampão 1x HBSS.
  7. Scanning fixador microscopia de electrões (SEM Fix): Preparar fixador para SEM por diluição de electrões glutaraldeído grau microscopia (2,5%) e paraformaldeído (4%) em tampão de Hepes. Adicionar CaCl2 até uma concentração final de 10 mM.
  8. 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) em tampão de Hepes; 1% de tetróxido de ósmio em água: Dilui-se uma solução estoque de tetróxido de ósmio em tampão Hepes, e separately em estéril H2O destilada, a uma concentração final de 1%. Tetróxido de ósmio é altamente tóxico e é mais comumente vendido como uma solução a 4%.
  9. 1% (w / v) de ácido tânico: Dissolve-se 0,5 g de ácido tânico em 50 ml estéril H2O destilada Filtro de esterilizar por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,45.
  10. Gradual etanol série solução: Diluir 200 proof de etanol com estéril H2O destilada para fazer soluções de 30, 50, 70, 90 e 95% de etanol. Para os enxaguamentos finais de etanol, com 100% de etanol 200 de prova é necessária. Use uma garrafa recém-inaugurado de 200 etanol de prova para as lavagens finais.

2. Escolha de Tissue

  1. Idealmente, examinar embriões ou filhotes jovens entre as idades de dia embrionário 16,5 (E16.5) e dia pós-natal 3 (P3).
    NOTA: A ossificação do labirinto ósseo e ossos temporais torna a dissecção progressivamente mais desafiador como ratos amadurecer. Também kinocilia, o único verdadeiro cílio à base de microtúbulos encontrada nas células ciliadas da cóclea,retrai durante o desenvolvimento e não está mais presente em ratos adultos.
  2. Após a fixação, descalcificação adulto cochleae. Coloque dissecados (ver secção 3) labirintos ósseas, em 2 ml de EDTA (4,13% em PBS), pH 7,3, num tubo de microcentrífuga durante 3 - 4 dias, com rotação. Reabastecer EDTA diária. Após os tecidos tem suavizado, lavar em 1,5 ml ou mais PBS 3 vezes durante 5 minutos em um nutator com o aumento da agitação.

3. cóclea Dissection

  1. Pós eutanásia através de deslocação cervical ou inalação de CO 2 (100% CO 2), remover a cabeça. Usar uma lâmina de bisturi ou tesoura pequena, dependendo do tamanho do animal, para dissecar a cabeça ao longo da linha média sagital começando no nariz e que se estende no sentido caudal. Remover o cérebro de cada metade do crânio com um par de pinças. Identificar os ossos temporais, que contêm os em desenvolvimento labirintos ósseas do ouvido interno (ver seta na Figura 1A).
  2. Use um par de paraceps para isolar cuidadosamente os labirintos ósseo do crânio (ossos temporais). Faça isso sob um microscópio de dissecação. Prise afastado o tecido ósseo do crânio, executando a pinça delicadamente debaixo dos labirintos ósseas. Em animais, até ao P4 os labirintos ósseas são ainda cartilaginoso e pode ser facilmente removido sem quebrar.
  3. Seguindo dissecção, use a ponta da pinça de dissecação para limpar a janelas oval e redonda e faça um pequeno furo no ápice da espiral coclear. Corrigir os labirintos ósseo antes de nova dissecção do ducto coclear. Para permitir a fácil remoção da membrana tectória (ver 3.7), corrigir os labirintos ósseo em 1,5 ml PFA 4% para 5 min em gelo.
    NOTA: Se a remoção da membrana tectória não é necessário, mais fixação é aconselhada (ver 4,1-4,3). Breve fixação dos ossos temporais anteriores a dissecção do ducto coclear auxilia o processo de dissecção e a remoção da membrana tectória. dissecção pós e exposição do órgão de Corti, Furtsua fixação é necessária.
  4. Além disso dissecar os labirintos ósseas para expor o epitélio sensorial da cóclea como se segue. Coloque os labirintos ósseo em um prato de dissecação revestido de espuma elastomérica de silicone preta contendo PBS para facilitar a dissecção. Usar pinos minutien para imobilizar o tecido, se necessário. Para usar pinos minutien, colocá-los através da porção vestibular dos labirintos ósseas com o aspecto ventral da espiral coclear virada para cima.
    NOTA: Preto silicone elastómero prato: Mix componente base elastómero de silicone com carvão em pó para obter uma cor preta opaca. Adicionar o agente de cura e despeje em uma ou mais placas de petri (vidro ou plástico). Seca-se sob vácuo para remover as bolhas de ar aprisionadas. pratos secar completamente antes de usar.
  5. Utilize uma pinça fina (# 5) para remover a cartilagem exterior expor o dueto coclear. Comece na janela oval; insira a ponta inferior do fórceps para a janela oval e com cuidado levante abrir a cartilagem, movendo-se lentamente para cima para oápice.
  6. Após a exposição do ducto coclear, remover a superfície ventral, a membrana de Reissner. Use um belo par de fórceps para beliscar a membrana de Reissner na base do ducto coclear e retire-a em um movimento ascendente. Visualizar o aspecto dorsal do ducto coclear, incluindo o epitélio sensorial.
  7. Remover a membrana tectória como descrito abaixo (opcional). Para SEM ou imuno-histoquímica da cinocílio ou feixes stereociliary remover a membrana tectória.
  8. Use um belo par de fórceps (# 55 ou mais fino) para comprimir a membrana tectória na base da cóclea e descascar para cima em direção ao ápice.
    NOTA: A membrana tectória é opticamente clara o que torna difícil de identificar. Mais frequentemente do que não a membrana sai em uma parte e embora não seja facilmente visualizado, pode-se sentir a resistência, uma vez que é puxado para fora do órgão de Corti exposta.
  9. Depois de expor o órgão de Corti, corrigir ainda mais o tecido como described abaixo. Reter a região vestibular para ajudar ainda mais a preparação dos tecidos.

4. Fixação

  1. Para imuno-histoquímica normal fixar os labirintos ósseas dissecados em 1,5 mL de PFA a 4% a 4 ° C num nutator durante 2 h.
    NOTA: Devido à sensibilidade de diferentes anticorpos e antigénios, as variações no comprimento e composição de fixação pode não ser necessária e deve ser optimizada para cada anticorpo.
  2. Após a fixação, lavar as amostras por lavagem em 1,5 ml ou mais de PBS 3 vezes durante 5 minutos em um nutator com agitação aumentada. As amostras podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C, durante várias semanas antes de processar.
  3. Se preparando amostras para MEV, Fix dissecados ossos temporais em SEM correção (ver 1.7) durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar por lavagem em 1,5 ml de tampão HEPES ou mais 3 vezes durante 5 minutos em um nutator com agitação aumentada. Armazenar em tampão Hepes a 4 ° C até posterior processamento. Armazenamento por mais de um par de semanas não é recomendado.

5. A imuno-histoquímica

  1. Realizar imuno-histoquímica em amostras dissecados em um poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Em alternativa, usar uma PCR ou tubo de microcentrífuga. É aconselhável para reter a porção vestibular do labirinto ósseo para facilitar o processamento.
  2. Permeabilizar o tecido, por incubação em 1,5 mL de tampão Triton, durante 1 h à TA em uma nutator com agitação suave.
  3. Bloquear o tecido, por incubação em 0,5 ml de Triton bloco para um mínimo de 1 hora à TA. Se estiver usando anticorpos primários levantados no rato, adicionar fragmentos de anti-IgG Fab para o bloco a uma diluição de 1 em 200 (ver secção 1.4). Isto diminui grandemente a ligação não específica de IgG anti-ratinho de rato tecido.
  4. Incubar o tecido com anticorpos primários diluídos em Triton bloco de O / N a 4 ° C com agitação suave. diluição do anticorpo depende de anticorpos a ser utilizado (ver secção 6.1). Alternativamente incubar antibodie primárias durante 2 h à TA. Idealmente utilizar um volume mínimo de diluição de anticorpo primário ml 0,5. Se o anticorpo é limitado, utilizar o menor volume de diluição do anticorpo que envolve completamente o tecido.
  5. Lavar o tecido por enxaguamento com 1,5 mL de tampão Triton, ou mais, um mínimo de 3 vezes durante 15 min, em um nutator com agitação aumentada.
  6. Incubar o tecido com anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes diluídas aos fabricantes concentração recomendada (tipicamente 1: 200-1: 1000) no bloco de Triton durante 1 h à TA em uma nutator. Utilizar um volume mínimo de diluição de anticorpo secundário a 0,5 ml.
    1. Centrifuga-se o anticorpo secundário diluído a 13.000 xg durante 3 min antes de usar para minimizar a ligação não específica do anticorpo secundário de agregados. Proteger o tecido da luz a partir deste passo em diante, a fim de evitar a fotodegradação dos corantes fluorescentes.
  7. Tal como na etapa 5.5, lavar o tecido por enxaguamento com 1,5 mL de tampão Triton ou mais, um mínimo de 3 vezes durante 15 min, numanutator com agitação aumentada. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até estar pronto para montagem.

6. Selecção de Anticorpos

NOTA: A fonte de anticorpos recomendadas e seus diluições estão listados na tabela de materiais e equipamentos específicos. Realizar as incubações de anticorpos como descrito no capítulo 5.

  1. Para visualizar a cinocílio à base de microtúbulos, usar um marcador ciliar axoneme tais como anti-Arl13b (1: 1000) ou anti-acetilado-α-tubulina (1: 800). Visualizar a basal do corpo, utilizando um anticorpo contra γ-tubulina (1: 200) ou qualquer outro marcador centrosomal.
  2. Para visualizar os feixes de actina stereociliary rico em filamentos, adicionar faloidina (1: 300 - 1000) conjugado a um dos vários fluoróforos diferentes para a incubação do anticorpo secundário. Faloidina etiquetas também outras estruturas de actina filamentosa, incluindo os filamentos de actina corticais em torno da periferia de cada uma das células epiteliais do cabelo. Isso é útil na determinaçãoo contorno de cada célula de cabelo. Usar um marcador de membrana alternativa, tais como anti-ZO-1 (1: 500), se necessário.
  3. Rotular células ciliadas da cóclea, utilizando anticorpos contra a miosina VI (1: 1.000) ou miosina VIIa (1: 1.000). Estes podem ser usados ​​se avaliar comprimento cóclea.

NOTA: Use anticorpos conjugado com corante fluorescente apropriados secundárias otimizadas para as exigências do microscópio.

7. Montagem e imagem

  1. Colocar a amostra em um prato de silicone elastómero preto contendo PBS. Usando uma pinça fina, retire a região vestibular da espiral coclear.
  2. Muito cuidadosamente remover a cartilagem subjacente e mesênquima da espiral coclear. A espiral coclear restante contém o sulco interior, órgão de Corti e sulco exterior.
  3. Transferir a espiral da cóclea em uma gota de PBS colocada numa lâmina de microscópio. Se desejado, separar a espiral da cóclea em partes equivalentes para um turno. Este passo não é necessário, no entanto, e pode levar a Loss do tecido. A superfície apical (lado stereocilia) das células ciliadas da cóclea deve estar voltado para cima em direção a lamela.
  4. Wick afastado o PBS com um tecido absorvente ou um pedaço de papel de filtro e gentilmente reposicionar a espiral da cóclea se o epitélio mudou e se sobrepõe sobre si mesmo.
  5. Adicionar uma gota de meio de montagem diretamente na amostra cóclea e coloque delicadamente uma lamela em cima, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Sem espaçadores são necessários; colocar a lamela directamente sobre a amostra. A, não-fluorescente solúvel em água, meio de montagem semi-permanentes, que não requer passos adicionais para manter a lamela em lugar é recomendado. meios de montagem e espessura de lamela deverão ser compatíveis para microscópio especificações.
  6. Usar um microscópio epifluorescente ou confocal de laser de varrimento equipado com ampliação elevada (63 - 100x), abertura numérica elevada (1,2 - 1.4) objectivos para capturar imagens da superfície apical das células ciliadas cocleares. Use loobjectivos WER (5 - 20X) para tomar várias imagens da espiral coclear para quantificar o comprimento do ducto coclear. lasers de excitação do fósforo e filtros de emissão para fluoróforos utilizados para anticorpos secundários.

8. Microscopia Eletrônica de Varredura

  1. Continue a partir da secção 4.3. Depois de lavar as amostras SEM fixos em tampão Hepes, execute os seguintes passos sob ventilação. O protocolo seguinte funciona bem para o tecido da cóclea e evita a utilização de revestimento por pulverização com um metal condutor.
  2. Pós-correcção em 1% de OsO 4 em tampão de Hepes, durante 1 h, seguida por 3 lavagens com 1 ml de água destilada durante 5 minutos cada. O menor volume de OsO 4, que envolve completamente o tecido deve ser usada para minimizar o desperdício tóxico. Não é necessário agitação.
  3. Incubar as amostras a temperatura ambiente em cada uma das seguintes soluções durante 1 hora com 3 lavagens com 1 ml de água destilada durante 5 min cada em entre os passos: 1% de ácido tânico recentemente feita em água e filtered antes da utilização; 1% de OsO 4 em água, ácido tânico 1% em água, 1% de OsO 4 em água.
  4. Desidratar as amostras através de uma série de etanol graduada por incubação durante 10 min em cada uma das seguintes diluições: 30, 50, 70, 90, e 95%. Não é necessário agitação.
  5. amostras de transferência através de três mudanças, 5 min cada, de 100% de etanol (de uma garrafa recém-inaugurado de 200 etanol de prova).
  6. Executar os exemplos que um secador de ponto crítico seguintes instruções do fabricante.
  7. Montar as amostras utilizando cola de carbono condutora na parte superior de um suporte de SEM antes da imagem de um microscópio electrónico. Sob um microscópio estereoscópico, usar um par de fórceps finos e de um pincel para posicionar cuidadosamente a amostra com o epitélio coclear voltado para cima. Utilizar a porção vestibular da amostra a "âncora" o tecido para o topo. Armazene as amostras em um dessecador até imagiologia. Realizar imagem SEM como descrito em Jones (2012) 21.

9.quantificação

  1. Após a preparação imuno-histoquímica, adquirir imagens usando um epifluorescência ou laser de varredura microscópio confocal. Após a preparação para a SEM, usar um microscópio eletrônico de varredura para a imagem dos espécimes. Imagem da superfície apical do órgão de Corti com as células ciliadas cocleares expostas e células de apoio intercalados.
  2. Definir posições específicas ao longo do ducto coclear, tais como 25, 50, e 75% a partir da base e usá-los para comparar regiões cóclea entre amostras mutante e de controlo. Analisar e comparar mutantes cílios com seus controles da mesma ninhada, como as diferenças de fundo genético pode modificar o fenótipo coclear.
    NOTA: O órgão de Corti desenvolve-se em um gradiente que se estende a partir de meados da década de base na direcção tanto o vértice e a base. No rato, o desenvolvimento não está completo até P14, por isso é importante comparar regiões em estágios e posições de desenvolvimento semelhantes.
  3. Tirar fotos usando o software que acompanha o microscópio que alloW para a quantificação do fenótipo particular, como requerido (ver abaixo). Use software de análise de imagem, como imagem de J ou software que acompanha o microscópio para medir comprimentos, contagem de células e determinar a localização da proteína como descrito abaixo. Gráfico esses dados como um gráfico de barras, gráfico de dispersão, a caixa blot ou histograma, comparando o controle vs. mutante.
  4. O comprimento total do ducto coclear (Figura 3A):
    1. Usando um marcador de células de cabelo ou phalloidin, (que marca os pacotes stereociliary), determinar e medir onde o epitélio sensorial começa e termina. O comprimento do ducto coclear é encurtado frequentemente em mutantes cílios.
  5. Anormalidades pacote Stereociliary (Figura 3B, D, E, G):
    1. Medir convexidade feixe (altura) como a menor distância entre o vértice do feixe e a linha que se estende através de ambas as extremidades do feixe de «braços» como se mostra na Figura 3G, à esquerda. Alternativamente, quantificar a áreaenglobadas pelos braços de feixe stereociliary das células ciliadas externas como se mostra na Figura 3G, direita. Se as células ciliadas com feixes stereociliary circulares podem ser identificados estes contam como uma percentagem do total de células capilares.
      NOTA: Em muitos mutantes ciliares anormalidades pacote pode ser observado independentemente da orientação pacote. É difícil quantificar com precisão anormalidades pacote stereociliary.
  6. Orientação dos feixes stereociliary (Figura 3B, C, G):
    1. Avaliar a orientação de cada feixe indivíduo em relação a uma linha que se estende perpendicularmente à linha de células pilar que separa as células ciliadas externas e internas. As células com uma orientação normal estão alinhadas ao longo deste eixo perpendicular e por isso têm uma rotação de 0o. Determinar ângulos de rotação usando uma notação de 360 ​​° ou desvios absolutos de 0 °.
  7. Posicionamento Kinocilia ou posicionamento pacote stereociliary (Figura3B, F, H):
    1. Contagem de a percentagem de células nas quais kinocilia estão ausentes. Medir a distância do cinocílio ao "vértice" ou centro do feixe. O "vértice" do feixe pode não ser fácil de se definir feixes são anormais, e de modo que o centro do feixe pode ser usado em substituição.
  8. Quantificar a posição de kinocilia e feixes stereociliary na superfície apical das células ciliadas, por sobreposição de uma grade de posicionamento para cada célula de cabelo e que marca a posição de quer a base do cinocílio ou o vértice / centro do feixe stereociliary. Exibir os dados como uma porcentagem de cada categoria que se encontra dentro de uma região específica do grid, e sobrepondo os locais de cada marcação em uma grade de posição.
    NOTA: Em tecidos de controle, kinocilia estão sempre ligados ao vértice do pacote stereociliary. Em mutantes cílios, kinocilia são muitas vezes ausente, ainda mislocalized ainda ligado, ou mesmo completamente separada das spacote tereociliary.
  9. Kinocilia comprimento (Figura 3I):
    1. Medir o comprimento do cinocílio por marcação com um marcador axoneme ciliar. Apenas medir kinocilia que fiquem retos dentro de um plano confocal 1,5 mm. Confirmar que os cílios são deitado observando uma vista em corte transversal do tecido digitalizada. Comparar amostras emparelhadas com idade a partir da mesma região da cóclea desde o cinocílio retrai durante o desenvolvimento.
  10. Mislocalization de proteínas de polaridade:
    1. Seguindo imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra as proteínas, tais como polaridade e Vangl2 Gαi3, determinar a localização por meio de imagiologia.

NOTA: Em alguns mutantes cílios, localização de proteínas de polaridade é interrompido. Estes incluem Vangl2 e Gαi3, que foram mostrados para ser interrompido em Ift20, Bbs8 e Bbs6 cóclea mutante.

NOTA: Mais exemplos de como quantificar e Polarit células ciliadas exibiçãoY pode ser encontrada nos seguintes documentos. Curtin, et ai. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et ai. (2003) Nature 7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et ai. (2008) Methods in Molecular Biology 24, May-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS ONE 26.

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Resultados

Cóclea Dissecção e Preparação de tecidos

Após remoção do cérebro, pós-linha média dissecção sagital de uma cabeça de rato P0, o labirinto ósseo, visto de trás, pode ser visualizado (Figura 1A, seta branca) e removido. A Figura 1B mostra os ósseas labirintos isolado com o cabelo coclear virados para cima, ventral, (à esquerda) e por trás, dorsal (direita). A seta aponta branco ...

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Discussão

Ao preparar o tecido coclear para análise, existem alguns pontos-chave a ter em conta. Em primeiro lugar, as diferenças de fundo genético pode modificar o fenótipo coclear, tornando-se necessário analisar e comparar apenas os controlos da mesma ninhada. Em segundo lugar, a remoção completa da membrana tectória é necessário para obter as melhores imagens com imuno-histoquímica e é essencial para SEM. A membrana tectória é uma estrutura opaca e pode obscurecer as células do epitélio sensorial directamente por baixo, torna...

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Divulgações

O autor declara não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O autor gostaria de agradecer a Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer e Zoe Mann e para a sua avaliação crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Sofja Kovalevskaya (Humbodlt Foundation) e da Universidade Johannes-Gutenberg, Mainz, Alemanha.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ferramentas/Equipamento
Elastômero de silicone - Sylgard 184Sigma-Aldrich761028-5EAVer Nota 2
Tesoura de microdissecação - lâmina reta Várias
pinças finas (nº 5 e 55) e pinças rombasVárias
microscópios de dissecação.Várias
lâminas de microscópio de vidro não revestidasVárias
lamínulas de microscópio (22 mm & 40 mm &vezes; 0,15 mm)Várias
pipetas de transferênciaVários
pinos Minutiens  Fine Science Tools26002-10
SEM suporte de amostratousimis8762
Pinos de microscopia eletrônica de varreduraTED PELLA16111
PELCO Abas: Adesivo de carbonoTED PELLA16084-3
Microscópio FluorescenteVários
Secador de Ponto CríticoVários
Microscópio Eletrônico de VarreduraVárias
lâminas de microscópio de vidroVárias
lamínulas de vidroVários
tecidos Kimwipe Vários
reagentes
de pincel
1 e vezes; Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco/Life Technologies10010023
Paraformaldeído  (PFA) (Grau EM Necessário para EM)VáriosPrepare uma solução de 4% em 1 e vezes; PBS feito fresco a cada vez. Grau EM necessário para EM.
2,5% Glutaraldeído Grau1Sigma-AldrichG5882
Tris-HCl (pH 7,5)Vários
NaClVários
CaCl 2Vários
Triton X-100Vários
Soro de Cabra NormalVários
AffiniPure Fab Fragmento Burro Anti-Rato IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-007-003
Fluoromount-G Mídia de montagemSouthernBiotech0100-01
10&vezes; Hanks ' Solução salina balanceada (HBSS)Gibco / Life Technologies14065
HepesGibco / Life Technologies15630-080
Tetróxido de ósmio (OsO4)Sigma-Aldrich / Fluka Analytical75632
Ácido tânicoSigma-Aldrich403040
Etanol 200 provaVários
anticorpos
anti Arl13bProtein Tech17711-1-APConcentração sugerida 1:1.000
anti-tubulina acetilada (611-B1)Sigma-AldrichT6793Concentração sugerida 1:800
anti gama tubulina (GTU-88)Sigma-AldrichT6557Concentração sugerida 1:200
anti Zo_1 Invitrogen40-2300Concentração sugerida 1:500
Miosina VIProteus Biosciences25-6791Concentração sugerida 1:1000
Miosina VIIaProteus Biosciences25-6790Concentração sugerida 1:1.000
anti Vangl2Merk MilliporeABN373Concentração sugerida 1:250
anti Gα i3Sigma-AldrichG4040Concentração sugerida 1:250
Alexa Fluor® 488 FaloidinaInvitrogen/Life TechnologiesA12379Concentração sugerida 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 FaloidinaInvitrogen/Life TechnologiesA12380Concentração sugerida 1:300 - 1.000
fino

Referências

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  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
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