Artigo de método

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

DOI:

10.3791/53572

⸱

19 de janeiro de 2016

 ,  , 
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Neste artigo

Resumo

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Para obter informações básicas sobre a sorção e reciclagem de ouro de sistemas aquosos foi investigada a interação de nanopartículas de Au(III) e Au(0) em proteínas da camada S. A sorção de polímeros proteicos foi investigada por ICP-MS e a de monocamadas proteicas por QCM-D. O AFM subsequente permite a imagem latente das nanoestruturas.

Resumo

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Nesta publicação, é descrito o comportamento de sorção de ouro das proteínas da camada superficial (camada S) (Slp1) de Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Essas biomoléculas se organizam em matrizes bidimensionais paracristalinas em superfícies, ligam metais e, portanto, são interessantes para diversas aplicações biotécnicas, como materiais biossortivos para a remoção ou recuperação de diferentes elementos do meio ambiente e processos industriais. A deposição de nanopartículas de Au(0) em camadas S, seja por síntese dirigida pela camada S 1 ou por adsorção de nanopartículas, abre novas possibilidades para diversas aplicações sensoriais. Embora vários estudos tenham descrito as propriedades de biossorção das camadas S 2-5, uma compreensão mais profunda da interação proteína-proteína e proteína-metal ainda permanece um desafio. No estudo a seguir, a espectrometria de massa indutivamente acoplada (ICP-MS) foi usada para a detecção de sorção de metais por camadas S suspensas. Isso foi correlacionado com medições de microbalança de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D), que permite a detecção on-line da formação de monocamada proteica e deposição de metal e, portanto, uma compreensão mais detalhada da ligação de metais.

Os resultados do ICP-MS indicaram que a ligação de Au(III) aos polímeros da camada S em suspensão é dependente do pH. A ligação máxima de Au(III) foi obtida em pH 4,0. As investigações QCM-D permitiram a detecção de sorção de Au(III), bem como a deposição de Au(0)-NPs em tempo real durante os experimentos in situ. Além disso, este método permitiu estudar a influência da ligação do metal na estabilidade da rede proteica de Slp1. As propriedades estruturais e a estabilidade da camada proteica podem ser visualizadas diretamente após o experimento QCM-D usando microscopia de força atômica (AFM). Em conclusão, a combinação desses diferentes métodos fornece uma compreensão mais profunda da ligação de metais por proteínas bacterianas da camada S em suspensão ou como monocamadas em células bacterianas ou superfícies recristalizadas.

Introdução

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Devido ao crescente uso de ouro para diversas aplicações como eletrônica, catalisadores, biossensores, ou instrumentos médicos, a procura deste metal precioso tem crescido ao longo dos últimos anos de tempo 6-9. Ouro, bem como muitos outros metais preciosos e pesados ​​são liberados no ambiente através de efluentes industriais em concentrações diluídas, por meio de atividades de mineração, e eliminação de resíduos 7,8,10, embora a maioria contaminação ambiental por metais pesados ​​ou preciosos é um processo em curso causada principalmente por atividades tecnológicas. Isto leva a uma interferência significativa dos ecossistemas naturais e pode potencialmente ameaçar a saúde humana 9. Conhecendo esses resultados negativos promove a busca por novas técnicas para remover metais de ecossistemas e melhorias contaminados na reciclagem de metais de efluentes industriais. Métodos físico-químicos bem estabelecidos como precipitação ou permuta de iões não são tão eficazes, especialmente em altaly diluída soluções 7,8,11. Biossorção, quer com a vida ou biomassa morta, é uma alternativa atraente para o tratamento de águas residuais 10,12. O uso de tais materiais biológicos pode reduzir o consumo de produtos químicos tóxicos. Muitos microrganismos têm sido descritos para acumular ou imobilizar metais. Por exemplo, células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 mostraram capacidades de ligação elevadas para os metais preciosos, por exemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), e outros metais tóxicos como o Pb (II) ou L (VI) 4,13, células de Bacillus megaterium para o Cr (VI), 14, células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) e Pd (II) 15, e Chlorella vulgar para Au (III) e U (VI) 16 , 17. A ligação de metais anteriores como Au (III), Pd (II) e Pt (II), também tem sido relatado para Desulfovibrio desulfuricans 18 e para L. sphaericus JG-B53 19,20. No entanto, não all micróbios vincular quantidades elevadas de metais e sua aplicação como material de sorção é limitada 12,21. Além disso, a capacidade de ligação do metal depende de diferentes parâmetros, por exemplo, a composição celular, o bio-componente usado, ou condições ambientais e experimentais (pH, força iónica, temperatura, etc.). O estudo dos fragmentos da parede celular isolado 22,23, como lípidos da membrana, peptidoglycan, proteínas ou outros componentes, ajuda a compreender os processos de células inteiras construídas complexas 8,21 vinculativo metal.

Os componentes celulares com foco em neste estudo são proteínas S-layer. Proteínas S-camada são partes do envelope celular externo de muitas bactérias e archaea, e que constituem cerca de 15 - 20% da massa de proteína total destes organismos. À medida que a primeira interface para o meio ambiente, estes compostos celulares influenciam fortemente as propriedades de sorção bacterianas 3. Proteínas S-layer com pesos moleculares variando de quarentaa centenas de kDa são produzidos dentro da célula, mas são montados no exterior, onde eles são capazes de formar camadas nas membranas lipídicas ou poliméricas componentes da parede celular. Uma vez isolado, quase todos os S-layer proteínas têm a propriedade intrínseca à espontaneamente auto-montar em suspensão, nas interfaces, ou em superfícies planas ou formando tubo-como estruturas 3. A espessura da monocamada de proteína depende das bactérias e está dentro de uma gama de 5 - 24 25 nm. Em geral, as estruturas de proteínas S-camada formada pode ter uma oblíqua (P1 ou P2), quadrada (P4) ou hexagonal (P3 ou P6) simetria com constantes de rede de 2,5 a 35 nm, 3,24. A formação da estrutura parece ser, em muitos casos dependentes de catiões divalentes e principalmente sobre Ca 2+ 25,26, Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). No entanto, a cascata de reacção cheio de dobragem monómero, monómero interação-monómero, a formação de uma estrutura, e o papel dos diferentes metais, especialmente de catiões divalentes, tais como Ca 2+ e Mg 2+, não são ainda totalmente compreendidas.

A estirpe de bactérias gram-positivas L. sphaericus JG-B53 (renomeado de Bacillus sphaericus após nova classificação filogenética) 27 foi isolada dos resíduos pilha mineração de urânio "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saxônia, Alemanha) 4,28,29. Sua funcional da proteína S-camada (Slp1) possui uma rede quadrada, um peso molecular de 116 kDa, 30, e uma espessura de 10 nm ≈ em células de bactérias que vive 31. Em estudos anteriores, a formação in vitro de uma camada de proteína fechado e estável com uma espessura de aproximadamente 10 nm foi alcançada em menos de 10 min 19. A tensão relacionada L. sphaericus JG-A12, também um isolado da pilha "Haberland", possui capacidades de ligação de alta de metal e seu isolado S-camada de proteína tem mostrado uma boa taxas de sorção de alta estabilidade química e mecânica e para os metais preciosos como Au (III), Pt (II), e Pd (II) 4,32,33. Esta ligação de metais preciosos é mais ou menos específicos para alguns metais e depende da disponibilidade de grupos funcionais sobre a superfície da proteína exterior e interior do polímero e nos seus poros, força iónica, e o valor de pH. Grupos funcionais relevantes para a interação do metal por as proteínas são COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, e SO. Em princípio, as capacidades de ligação a metais abrir um amplo espectro de aplicações, Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). por exemplo, como componentes biosorptive para remoção ou recuperaçãode metais tóxicos ou valiosos dissolvidos, modelos para a síntese ou a deposição de nanopartículas definido regularmente estruturados metálicos (PN) para a catálise e outros materiais bio-engenharia, como camadas de bio-sensorial 3,5,18,33. Matrizes NP regularmente organizados como Au (0) -NPs poderia ser usado para grandes aplicações que vão desde a eletrônica molecular e biossensores, dispositivos de armazenamento densidade extremamente altas, e catalisadores para o CO-oxidação 34-37. O desenvolvimento de tais aplicações e design inteligente desses materiais exige uma compreensão mais profunda dos mecanismos de ligação de metal subjacentes.

Um pré-requisito para o desenvolvimento de tais materiais de base biológica é a implantação confiável de uma camada de interface entre a biomolécula ea superfície técnica 38,39. Por exemplo, polielectrólitos montado com a camada-por-camada (LbL) 40,41 técnica têm sido utilizados como uma camada de interface para a recristalização das proteínas S-camada 39 . Uma tal interface proporciona uma maneira relativamente fácil de realizar o revestimento de proteína de uma forma reprodutível e quantitativa. Através da realização de diferentes experimentos com e sem modificação com promotores adesivas, é possível fazer afirmações sobre a cinética de revestimento, estabilidade camada, e interação de metais com biomoléculas 19,42, Raff, J. et al. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). No entanto, o mecanismo complexo da adsorção de proteína e interacção de proteína à superfície não é completamente compreendido. Especialmente informações sobre a conformação, a orientação padrão, e densidades de revestimento ainda está desaparecido.

Quartz microbalança de cristal com monitoramento dissipação (QCM-D) técnica tem atraído atenção nos últimos anos como uma ferramenta para o estudo de adsorção de proteínas, cinética de revestimento, e interação proprocessos em escala nanométrica 19,43-45. Esta técnica permite a detecção detalhada de adsorção em massa em tempo real, e pode ser usado como um indicador para o processo de auto-montagem de proteínas e acoplamento de moléculas funcionais em redes proteicas 19,20,42,46-48. Além disso, as medições QCM-D em aberto a possibilidade de estudar os processos de interação do metal com a camada proteica em condições biológicas naturais. Em um estudo recente, a interacção da proteína S-camada com metais seleccionados tais como Eu (III), Au (III), Pd (II) e Pt (II) foi estudada com QCM-D 19,20. A camada de proteína adsorvida pode servir como um modelo simplificado de uma parede celular de bactérias gram-positivas. O estudo deste componente único pode contribuir para uma compreensão mais profunda da interação metal. No entanto, unicamente experimentos QCM-D não permitem declarações relativas a estruturas de superfície e influências de metais para a proteína. Outras técnicas são necessárias para obter essas informações. Um poslidade de imagem para bio-nano-estruturas e obtenção de informações sobre as propriedades estruturais é a microscopia de força atômica (AFM).

O objectivo do estudo foi investigar apresentada a sorção de ouro (Au (III) e Au (0) -NPs) para proteínas S-camada, em particular Slp1 de L. sphaericus JG-B53. As experiências foram efectuadas com proteínas suspensos na escala em lotes numa gama de pH 2,0 - 5,0 utilizando ICP-MS e imobilizadas com S-camadas usando QCM-D. Além disso, a influência de uma solução de sal de metal sobre a estabilidade da estrutura foi investigada com estudos subsequentes AFM. A combinação destas técnicas contribui para uma melhor compreensão dos processos de interação in vitro de metal como uma ferramenta para aprender mais sobre os eventos em células bacterianas inteiras sobre afinidades de metal específicos de ligação. Este conhecimento é crucial não só para o desenvolvimento de materiais de filtro válidos para a recuperação de metais para a protecção do ambiente ea conservação dos refontes 49, mas também para o desenvolvimento de matrizes de nanopartículas metálicas altamente ordenadas para várias aplicações técnicas.

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Protocolo

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1. microorganismo e Cultivo Condições

Nota:. Todas as experiências foram realizadas sob condições estéreis L. sphaericus JG-B53 foi obtido a partir de uma cultura criopreservados 29,30.

  1. Transferência de crio-preservado de cultura (1,5 ml), sob a bancada limpa para 300 ml de caldo nutriente estéril (NB) meios (3 g / l de extracto de carne, 5 g / l de peptona, 10 g / L de NaCl). Depois agita-se a solução durante pelo menos 6 horas a 30 ° C para se obter a pré-cultura para o cultivo.
  2. Cultivar a bactéria em condições aeróbias em meio NB a pH = 7,0, 30 ° C num biorreactor de 70 L dimensionado de vapor no local. Portanto, encher o reactor de 57 L com ≈ água desionizada. Adicionar e dissolver mídia NB sólido diretamente em biorreator (concentrações veja acima).
    1. Além disso adicionar agente anti-espuma (30 mL / L NB-media) para a mídia para suprimir a formação de espuma durante a cultura, então autoclave (122 ° C, temperatura de manutenção de tempo de 30 min) os meios de comunicaçãono interior do reactor de instalação.
  3. Esfriar a mídia e executar completa saturação de oxigênio. Ajustar o pH para 7,0 (utilizando 1 H 2 SO 4 e 2 M de NaOH) e começar a inoculação automática do 300 ml de pré-cultura. Iniciar a gravação de dados de parâmetros de cultivo no ponto de inoculação. Log parâmetros on-line por exemplo, o nível de oxigênio dissolvido (OD 2), adição de ácido e base, e os valores do pH no cultivo.
    1. Monitorar o crescimento bacteriano em linha por as medições da turvação não-invasivos.
  4. Operações de amostragem adicional após cada hora de cultivo e ainda determinar parâmetros como o peso bio seco (BDW) e densidade óptica offline (OD). Portanto, recolher 20 ml de caldo de cultivo em cada ponto de amostragem em condições estéreis.
    1. Determinar OD off-line por meio de medições fotométricas da adsorção a 600 nm. Use estéril filtrada NB-meio como um valor em branco. À réer atingindo adsorção> 0,4 ​​diluir a suspensão de células após a linearidade da lei de Lambert-Beer.
    2. Para a determinação da BDW centrífuga de 1 a 5 ml de suspensão bacteriana (dependendo da densidade celular) a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Seca-se a pelete de células obtida a 105 ° C num forno de aquecimento até a estabilidade de massa e medir a massa da pelota.
  5. Tome imagens microscópicas com fase óptica microscópio de pesquisa contraste em 400 e 1.000 ampliação vezes (contraste de fase condensador 2 e 3, respectivamente) para a verificação do crescimento bacteriano e como controle de contaminação cruzada.
  6. Depois de atingir a fase de crescimento exponencial detectado por linha de DO2 e turbidez em linha, a colheita da biomassa por centrifugação de fluxo a 15000 xg, 4 ° C e lava-se a biomassa duas vezes com tampão padrão (50 mM Tris, 10 mM de MgCl 2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Nota: O sedimento biomassa obtida pode ser armazenada a -18 & #176; C até posterior utilização para o isolamento.

2. S-camada de isolamento e purificação de proteínas

Nota: Purifica-se polímeros Slp1 acordo com um método adaptado, tal como descrito anteriormente 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogeneizar a biomassa em bruto e lavou-se obtido a partir de cultura descongelado em tampão padrão (1: 1 (w / v)) para remover flagelos, utilizando um dispersor (nível 3, 10 min), sob arrefecimento em banho de gelo a 4 ° C.
  2. Centrifugar a suspensão (8000 xg, 4 ° C durante 20 min) e lava-se o sedimento, obtido duas vezes com tampão padrão (1: 1 (w / v)). Após a lavagem e centrifugação (8000 xg, 4 ° C durante 20 min), ressuspender o sedimento em tampão padrão (1: 1 (w / v)), adicionar DNase II e RNase (0,4 unidades / g de biomassa) para a suspensão e se desintegram as células a 1.000 bar com um homogeneizador de alta pressão. Depois centrifugar a suspensão a 27.500 xg, a 4 ° C durante 1 h.
    Nota: suspensão de células de Controle com os mi pesquisacroscope. A rotura é concluída quando menos de 2 - 3 células intactas são visíveis no campo de visão do microscópio, em ampliação de 400 vezes.
  3. Lava-se a pelete duas vezes com tampão padrão (1: 1 (w / v)) e realizar a centrifugação novamente. Em seguida ressuspender o sedimento em tampão padrão (2: 1 (w / v)) misturado com 1% de Triton X-100 e incubar durante 20 min sob sucessivas agitação (100 rpm) para solubilizar depósitos lipídicos.
  4. Centrifugar a solução (27.500 xg, a 4 ° C durante 1 hora) e lavar os pellets obtidos três vezes com tampão padrão (1: 1 (w / v)).
  5. Incubar o pellet obtido após centrifugação adicional (27.500 xg, a 4 ° C durante 1 h), durante 6 h em tampão padrão (1: 1 (w / v)) misturado com 0,2 g / l de lisozima, para hidrolisar as ligações em peptidoglicano 50. Adicionalmente adicionar DNase e RNase II (cada 0,4 unidades / g de biomassa) para a suspensão.
  6. Depois de centrifugação (45.500 xg, 4 ° C, 1 hora), ressuspender a fase de proteína branco superior com um baixo volume de tele centrifugação sobrenadante (<30 ml) contendo subunidades de proteínas.
  7. Solubiliza-se a suspensão branca através da mistura 1: 1 com 6 M de cloridrato de guanidina (6 M GuHCl, 50 mM Tris, pH = 7,2). A solução torna-se brilhante.
  8. Efectuar a filtração estéril (0,2 um) da solução tratada GuHCl seguido de uma centrifugação de alta velocidade adicional (45.500 xg, a 4 ° C durante 1 hr).
  9. Transferir o sobrenadante para tubos de membrana de diálise (MWCO 50.000 Dalton) e dialisadas contra tampão de recristalização (TRIS 1,5 mM, CaCl2 10 mM, pH = 8,0) durante 48 horas.
  10. Transferir a solução de polímero branco proteína recristalizado em tubos e centrifugar a 45.500 xg, a 4 ° C durante 1 h. Ressuspender o sedimento num pequeno volume de água ultrapura (<30 ml).
  11. Em seguida, transferir a suspensão para dentro de tubos de diálise de membrana e efectuar uma diálise contra água ultra-pura, durante 24 h para remover o conteúdo de tampão.
    Nota: Várias mudanças de tampão ou água ultrapura durante diálise são indispensáveis.
  12. Liofilizar o Slp1 purificado num secador por congelação.

3. caracterização e quantificação de Slp1 para Experimentos

Nota: concentração Slp1 para sorção e revestimento experiências foram quantificados por espectrofotometria de UV-VIS.

  1. Pipetar 2 ul de amostra dissolvida Slp1 directamente sobre o pedestal de medida menor do fotómetro. Determinar a concentração de proteína a adsorção máxima num comprimento de onda de 280 nm, característicos de proteínas. Utilizar o coeficiente de extinção de 0,61 para determinar a concentração Slp1. Use Slp1 solução gratuita para medições de referência.
  2. Dilui-se a proteína com o tampão (para as experiências de sorção no modo de lote utilizam 0,9% de NaCl, pH = 6,0 e para experiências QCM-D usar tampão de recristalização, pH = 8,0) até à concentração desejada para as experiências (1 g / L e 0,2 g / L respectivamente).
  3. Analisar a qualidade Slp1 e peso molecular pelo Bioanal padrãoytical método de electroforese de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE), descrita por Laemmli, Reino Unido 52.
    1. Execute SDS-PAGE antes de usar Slp1 dentro de experimentos e por exemplo, depois de Au (0) -np incubação utilizando 10% de gel de poliacrilamida de separação.
    2. Por SDS-amostras de mistura = 10 ul da cultura ou a proteína da amostra com tampão de amostra (1,97 g de Tris, 5 mg de azul de bromofenol, 5,8 ml de glicerina, 1 g de SDS, 2,5 ml β-mercaptoetanol, encher com água ultrapura até 50 ml) em uma proporção de 1: 1 (v / v) e pipeta-se a mistura após 4 minutos de incubação a 95 ° C para os bolsos de gel.
    3. Executar SDS-PAGE a 30 min a uma tensão de 60 V até que as amostras passam a tensão de gel e recolha de mudança de 120 V, uma vez que passa do gel de separação.
    4. Remover os geles a partir do sistema de gel, lavar com água ultrapura e lugar durante 1 hora em solução de fixação (ácido acídico 10%, 50% de etanol absoluto). Em seguida, lavar os géis com água ultrapura.
    5. Géis Manchausando uma coloidal inespecífica adaptado Coomassie brilhante método azul 53,54. Após descoloração 72,73, tirar imagens de SDS-PAGE pelo sistema de documentação de gel de acordo com o protocolo do fabricante.

4. Experimentos de sorção em Batch-modo e Metal Quantificação

  1. Por lote experimentos de sorção preparar Au (III), solução de estoque de HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O, dilui-se o sal de metal e misturá-lo com a solução Slp1 / NaCl a uma concentração de metal inicial de 1 mM e concentração final Slp1 de 1 g / L . Realizar experimentos em trigêmeos com um controle negativo adicional sem Slp1. Utilizar um volume total de 5 ml para experiências de sorção.
  2. Agitar a suspensão à TA continuamente a diferentes valores de pH pré-ajustada entre 2,0 a 5,0, durante 24 h (ajustar o pH com solução de HCl a partir de NaOH e concentradas).
  3. Após adsorção, as amostras de centrifugar a 15.000 xg, 4 ° C durante 20 min) para SEPARSlp1 comeu a partir do sobrenadante.
  4. Transferir o sobrenadante para tubos de ultrafiltração (MWCO 50.000 Da) e centrifuga-se a 15.000 xg esta, 4 ° C durante 20 min para remover monómeros de proteína dissolvida.
  5. Determinar a concentração de metal no filtrado resultante por ICP-MS 19,20 e usar os resultados para back-cálculo de metais sorvido pela massa seca Slp1. Medindo princípios, as oportunidades do método e componentes da usados ​​ICP-MS foram descritos na literatura 55.
    1. Preparar as amostras para medições de referência e ICP-MS, utilizando 1% de HNO3 como matriz e ródio como padrão interno (1 mg / mL).

5. Síntese de Au-NP e Determinação do Tamanho de Partículas

Nota: Citrato de Au estabilizadas (0) -np foram sintetizados de acordo com um método adaptado descrito anteriormente por Mühlpfordt, H. et ai. (1982) para se obterem partículas esféricas com um diâmetro de 10 - 15 nm, 56,57

  1. Prepare uma estabilizada HAuCl 25 mM 4 ∙ 3 H 2 O estoque para a formação NP.
  2. Diluir 250 ul desta solução estoque em 19,75 ml de água ultrapura e incubar estes a 61 ° C durante 15 min sob agitação sucessiva.
  3. Prepare 5 ml de uma solução-mãe de segunda (12 mM de ácido tânico, 7 mM de citrato de sódio di-hidratado, 0,05 mM de K 2 CO 3) e incubar a solução 2 nd separadamente a 61 ° C durante 15 min.
  4. Adicionar sob constante agitação da solução estoque 2ª a solução one. Agita-se a mistura reaccional durante pelo menos 10 min a 61 ° C. Depois arrefecer a solução e usá-lo para NP revestimento sobre Slp1 estrutura dentro experimentos QCM-D.
    Nota: O Au resultante (0) -np foram caracterizados por espectroscopia de UV-VIS no máximo de absorvância a 520 nm, normalmente usado para a detecção de formado Au (0) -NPs 58. A solução pode ser armazenada a 4 ° C.
  5. Analisar o tamanho do formadoAu (0) -np por espectroscopia de correlação do fotão (PCS), que é também conhecida como dispersão de luz dinâmica.
    1. Para a determinação do tamanho NP, transferir 1,5 mL da sintetizados Au (0) -np solução em cuvetes sob condições isentas de pó em uma caixa de fluxo laminar e analisá-lo com um tamanho e potencial zeta das partículas Sizer. Uma descrição detalhada do PCS e preparação da amostra é dado em Schurtenberger, P. et ai. (1993) 59 e Jain, R. et ai. (2015) 60.

6. Experiências QCM-D - Slp1 revestimento nas superfícies e Au-NP adsorção Slp1 Malha

Nota: As medições foram realizadas com um QCM-D equipado com até quatro módulos fluxo. Todas as experiências QCM-D foram realizadas com uma taxa de fluxo constante de 125 ul / min a 25 ° C. Revestimento Slp1 e metal / NP incubação foram feitos em SiO2 piezoelétricos sensores de quartzo AT-corte (Ø 14 mm) com uma freqüência fundamental de ≈ 5 MHz. Enxaguar etapas e adicionarition de solução estão marcados nas figuras do resultado parte representativa. As experiências QCM-D poderia ser descrito como uma forma passo a passo começando com a limpeza e a modificação da superfície dos sensores utilizados, seguido por recristalização Slp1 e, mais tarde, a interacção NP de metal e metal.

  1. Procedimentos de limpeza:
    1. Equipar as células do líquido com manequins de sensores. Bomba de pelo menos 20 ml (cada um por módulo) de um agente de limpeza líquido alcalino (2% em purificadores de água ultrapura (/ v) v) através do sistema de QCM-D e tubo. Em seguida bombear o volume de cinco vezes (por cada módulo) de água ultrapura através do sistema (caudal de até 300 ul / min). Realizar a limpeza de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Limpar as SiO 2 sensores de fora dos módulos de fluxo por incubação (pelo menos 20 minutos) na solução de SDS a 2% e enxaguar os sensores depois várias vezes com água ultrapura 61,62.
    3. Secam-se os cristais com amostra filtradaressed ar e colocá-los em uma câmara de limpeza de ozônio durante 20 min 63,64.
    4. Repita o procedimento de limpeza duas vezes para remover todos os conteúdos orgânicos.
    5. Para remover metais ligada da superfície do sensor enxaguar os sensores com 1 M de HNO3. Em seguida, execute todas as etapas de lavagem com água ultrapura.
  2. Sensor de superfície Modificação por polieletrólitos:
    Nota: A modificação da superfície pode ser feito tanto no interior (fluir através de procedimento) ou fora do módulo de fluxo (técnica de automontagem). Dentro destas experiências da seguinte forma para modificar as superfícies foi usada.
    1. Modificar os sensores com 3 g / L de camadas alternadas de PE de imina de polietileno (PEI, MW 25.000) e de sulfonato de poliestireno (PSS, MW 70.000) através de revestimento por imersão utilizando a técnica LbL 40,41 previamente descrito para o sistema utilizado especial no artigo de Suhr, M. et ai. (2014) 19.
    2. Coloque os sensores dentro da solução-PE apropriado em w profundaell placas e incuba-se estes durante 10 min a RT.
    3. Tome os sensores fora da PE-solução e lave os sensores entre cada passo de revestimento por imersão intensamente com água ultrapura.
      Nota: A nova modificação de superfície é constituído por pelo menos três camadas de PE com terminação PEI carregado positivamente.
    4. Após esta modificação externa colocar os sensores no interior do módulo de fluxo e equilibrar os sensores por enxaguamento com água ultrapura antes de começar as experiências.
  3. Slp1 monocamada recristalização:
    1. Dissolver Slp1 em 4 M de ureia para a conversão de polímeros em monómeros.
    2. Centrifugar as proteínas monomerized a 15.000 xg, 4 ° C durante 1 h para remover aglomerados de proteínas maiores.
    3. Misturar-se o sobrenadante e centrifugou-se Slp1 solubilizado com tampão de recristalização a uma concentração final de proteína de 0,2 g / L.
      Nota: O cálcio dependendo da recristalização Slp1 (auto-montagem) é iniciado por adição do rectampão rystallization. Portanto, bombear a solução mista com um caudal de 125 ul / min para os sensores (colocado no interior dos módulos de fluxo) imediatamente. A recristalização é feita após os valores estáveis ​​de frequência e de dissipação de turnos foram detectados dentro experimentos QCM-D.
    4. Após recristalização a partir de proteínas bem sucedido em cima dos sensores-PE modificados no interior dos módulos de fluxo de lavagem os sensores revestidos com tampão de recristalização ou waterintensively ultrapura com uma taxa de fluxo de 125 mL / min até que os valores estáveis ​​de frequência e de dissipação foram detectadas mudanças.
      Nota: O SiO2 modificação da superfície com PE para experimentos de sorção posteriores Onto Slp1 estudos monocamada e AFM é visualizado na Figura 1.

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Figura 1. Esquema Projeto de PE modificação da superfície e Slp1 MonolayerRevestimento; Este valor foi modificado a partir Suhr, M. et al. (2015) 19 com a permissão da Springer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Metais e NP Interação:
    Nota: A sorção com a solução de sal de metal Au (HAuCl 4 ∙ 3 H2O) foi realizada em concentrações de 1 mM ou 5 mM a pH = 6,0 a 0,9% em soluções de NaCl. Au-NP adsorção foi feito com não diluído Au-NPs em 1,6 mM tampão tri-sódio-citrato em pH ≈ 5.0.
    1. Após o revestimento Slp1 sucesso nos módulos de fluxo, lavar a camada Slp1 obtido intensamente com solução de NaCl 0,9% até foram detectados valores estáveis ​​de frequência e de dissipação de turnos.
    2. Bombear a solução preparada de metal (1 mM) e uma solução de NP para os módulos de fluxo com uma taxa de fluxo de 125 mL / min e controlar a massa de adsorção para o Slcamada p1. Adsorção de massa pode ser detectada diretamente, acompanhando as mudanças de freqüência referentes à equação de Sauerbrey (equação 1).
    3. Depois de completar a interação metal e de metal NP, lavar a camada de metal / NP tampão livre para remover metais ou fracos nanopartículas ligadas ou fracos em anexo.
      Nota: Uma ilustração da configuração experimental é mostrado na Figura 2.

figure-protocol-2
Figura 2. desenho esquemático da instalação QCM-D usando Fluxo Módulo QFM 401 * 66. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Gravação de Dados e Avaliação:
    1. Grave as mudanças na freqüência em Hz (Af n) e dissipação (ΔD n) Dentro dos experimentos QCM-D usando QCM-D de software específico.
    2. Use para avaliação da sensibilidade de massa adsorvida (Dm) do Sauerbrey equação / modelo (Equação 1) 65 66 que é válido para filmes finos e rígidos acoplados sem atrito à superfície do sensor aplicada ao n º harmônico. O termo C (constante Sauerbrey) para o usado 5 MHz AT sensor de quartzo corte é de 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. Para rígida, uniformemente distribuída, e as camadas adsorvidas suficientemente finas usar a Equação 1 como uma boa aproximação.
      figure-protocol-3
    3. Realizar modelagem adicional de acordo com o modelo de Kelvin-Voigt válido para moléculas viscoelásticas 68-71 com a fabricante de software específico e comparar os resultados com o do modelo Sauerbrey.
    4. Para o cálculo da espessura da camada e a utilização de massa de adsorçãomodelagem como parâmetro importante uma densidade de camada da camada adsorvida de 1,35 g cm -3 ∙ correspondente aos valores descritos anteriormente para as proteínas S de camada 72-75. Utilize o mesmo valor para o cálculo da interação do metal com a camada proteica.

7. As medições AFM

  1. Realizar estudos com plenamente capaz AFM em um microscópio óptico invertido.
    1. Gravação de imagens de AFM em líquido usando o buffer de recristalização ou água ultrapura diretamente nos sensores QCM-D revestidos.
    2. Lave os sensores com água ultrapura após experimentos QCM-D e colocá-los dentro da célula fluido AFM. Portanto, utilizar uma célula de fluido em circuito fechado com um volume total de cerca de 1,5 ml. Manter a temperatura do fluido constante da célula a 30 ° C.
    3. Usar um cantilever com uma frequência de ressonância de 25 kHz ≈ em água e uma rigidez de <0,1 N / m. Ajuste a velocidade de digitalização entre 2,5 e 10 m / seg.
    4. 76.
      Nota: as imagens da altura são mostrados com z-escala, enquanto valores z representam a topografia da superfície exacta. Imagens amplitude (Pseudo 3D) são mostrados sem z-escala, porque z-valores de amplitude dependem de parâmetros de digitalização e dar informações limitadas. Análise de imagens foi feita utilizando três softwares de avaliação diferente do 77.

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Resultados

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Cultivo de Microrganismos e Slp1 Caracterização

Os dados gravados do crescimento bacteriano indica o final da fase de crescimento exponencial em cerca de 5 horas. Investigações anteriores demonstraram que Slp1 pode ser isolado a partir deste ponto de colheita (4,36 g / L de biomassa húmida (≈ 1,45 g / L (BDW)) com um rendimento máximo de 19. No entanto, a optimização de cultivo usando componentes de...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste trabalho foi estudada a ligação às proteínas de Au-S camada foi investigada utilizando uma combinação de diferentes métodos analíticos. Em particular, a ligação de Au é muito atraente, não somente para a recuperação das águas de mineração de Au ou soluções de processo, mas também para a construção de materiais, por exemplo, superfícies sensoriais. Para os estudos da interacção Au (Au (III) e Au (0) -NPs) com suspensão e recristalizou-se em monocamada de Slp1, a proteínas tem de ser isolado. Porta...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente trabalho foi parcialmente financiado pelo IGF-projeto "S-Peneira" (490 ZBG / 1) financiado pela BMWi eo BMBF-projeto "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Um agradecimento especial a Tobias J. Günther pelo valioso auxílio durante os estudos de AFM e para Erik V. Johnstone para ler o manuscrito como um falante nativo Inglês. Além disso, o autor deste papel gostaria de agradecer Aline Ritter e Sabrina Gurlit (do Instituto de Ecologia de Recursos para assistência em medições por ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava e da biotecnologia grupo do Instituto Helmholtz- Freiberg para a Tecnologia de Recursos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
equiment e software
Bioreactor, Steam In Place Sistema Piloto de 70LApplikon Biotechnology, Países BaixosZ6XIncluindo dO2, sensores de pH da Applikon Biotechnology e software BioXpert V2
Monitor de Biomassa Não Invasivo BugEye 2100BugLab, Concord (CA), EUAZ9X---
Espectrómetro Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Grã-Bretanha80-2109-10Empresa agora GE Healthcare Life Sciences
MiniStar microcentrífugaVWR, Alemanha521-2844Para centrifugação de amostras de cultivo
Microscópio do sistema de pesquisa BX-61Olympus Germany LLC, Alemanha037006Microscópio em combinação com o software de imagem
Cell^P (versão 3.1)Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Alemanha---juntamente com o microscópio
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-SCarr Centritech, Florida, EUA9010PLTPara colheita de biomassa
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Alemanha431-2601Para remoção de flagelos e homogeneização de amostras
Sorvall Evolution RC Superspeed CentrifugeThermo Fisher Scientific, EUA728411Usado no isolamento de proteínas
Processador móvel de fluido de alto cisalhamento, M-110EH-30 PilotMicrofluidics, Massachusetts, EUAM110EH30KUsado para ruptura celular
Alpha 1-4 LSC LiofilizadorMartin Christ Liofilizadores LLC, Osterode, Alemanha102041---
Espectrofotometria UV-VIS (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, EUA91-ND-2000C-LPara determinação de proteínas câmara
de eletroforese vertical de concentração Mini-PROTEANBio-Rad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha165-3322Para SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha1708030Usado para geração de imagens de géis SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), EUAN8120536Para determinação da concentração
de metaisZetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire, Reino UnidoZEN3600Para determinação do tamanho das nanopartículas
Dispositivo Q-Sense E4Q-Sense AB, Gotemburgo, SuéciaQS-E4encomendado via LOT quantum design (software incluído na plataforma E4)
Q-Soft 401 (gravação de dados)Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia
Q-Tools 3 (avaliação e modelagem de dados)Q-Sense AB, Gotemburgo, Suécia
Módulos de fluxo QCM-D QFM  401 Q-Sense AB, Gotemburgo, SuéciaQS-QFM401encomendado via LOT quantum design
QSX  303 sensores de quartzo piezoelétricos SiO2Q-Sense AB, Gotemburgo, SuéciaQS-QSX303encomendados via LOT quantum design
Câmara de limpeza de ozônioBioforce Nanoscience, Ames (IA), EUAQS-ESA006encomendado via LOT quantum design
Microscópio de Força Atômica MFP-3D Bio AFMAsylum Research, Santa Bárbara (CA), EUAMedições MFP-3DBioAFM e software de imagem
Asylum Research AFM Software AR Versão 120804+1223Asylum Research, Santa Barbara (CA), EUAsoftware de imagem incluído no Cat. Não. MFP-3DBio
Igor Versão Pro 6.3.2.3 SoftwareWaveMetrics, Inc., USAsoftware de imagem incluído no Cat. Não. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Barbara (CA), EUABioheaterSample heater para medições AFM
Mini cantilever Biolever,  BL-AC40TS-C2Olympus Alemanha LLC, Alemanha  BL-AC40TS-C2preferiu o modilhão para as medidas
WSxM 5,0 do AFM desenvolve 6,5 (2013)Nanotec Electronica S.L., softwarefreewarepara a análise do AFM
NameCompanyNúmero de catálogo<strong>Comentários
Detergentes e o outro equiment
ácido ácido a 100 %, ao ano.CARL ROTH GmbH+CO. KG3738.5Perigo, líquido e vapor inflamável e corrosivo. Causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos.
Antiespumante 204Sigma-Aldrich Co. LLC.A6426Para supressão de espuma
azul de bromofenol, sal de sódioSigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Desoxirribonuclease II do baço suínoSigma-Aldrich Co. LLC.D4138Typ IV , 2.000 - 6.000  Unidades Kunitz/mg de proteína
Etanol, 95%VWR, Alemanha20827.467Perigo,
glicerina inflamável, p.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3783.1---
cloridrato de guanidina (GuHCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
Ácido clorídrico (HCl) (37%)CARL ROTH GmbH+CO. KG4625.2Perigo; Corrosivo, usado para ajuste
de pH Lisozima de clara de ovo de galinhaSigma-Aldrich Co. LLC.L6876 Pó liofilizado, proteína = 90%, = 40.000 unidades/mg de proteína (Sigma) 
Agitador magnético com aquecimento,  MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Alemanha504.10100.00Agitador padrão dentro do experimento
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
Ácido nítrico (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN50.1Perigo; Oxidante, corroendo
PageRuler Unstained Protein LadderThermoScientific-Pierce26614---
Poli(sódio 4-estirenossulfonato) (PSS)Sigma-Aldrich Co. LLC.243051Mw médio ~ 70.000
polietilenonimina (PEI), ramificadoSigma-Aldrich Co. LLC.408727Aviso; Nocivo, irritante, perigoso para o meio ambiente; média Mw ~ 25.000
carbonato de potássio anidro (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108Atenção;
Ribonuclease A prejudicial do pâncreas bovinoSigma-Aldrich Co. LLC. (em inglês).R5503Tipo I-AS, 50 - 100 unidades Kunitz/mg de proteína 
Azida de sódio (NaN3)Merck KGaA106688Perigo; muito tóxico e perigoso para o meio ambiente
Cloreto de sódio (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG3957.2---
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma-Aldrich Co. LLC.L-5750Perigo; tóxico
Hidróxido de sódio (NaOH)CARL ROTH GmbH+CO. KG6771.1Perigo; Corrosivo, usado para regulação do pH dentro do cultivo e ajuste do pH
Spectra/Por 6, membrana de diálise, MWCO 50.000 CARL ROTH GmbH+CO. KG1893.1---
Ácido sulfúrico (H2SO4)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN52.2Perigo; Corrosivo, usado para regulação do pH no cultivo
Ácido tânico (C76H52O46)Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO. KG3051.3Aviso; Nocivo, perigoso para o meio ambiente
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Tubos de ultrafiltraçãoSartorius AGVS0132---
β-mercaptoetanolSigma-Aldrich Co. LLC.M6250Perigo, tóxico
--- --- de Espanha

Referências

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