Quantitativa de autofluorescência de Avaliação de Doenças da retina

Resumo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) suporta a retina sensorial por meio da reciclagem de subprodutos do ciclo visual, que se acumulam como lipofuscina. Esses produtos são autofluorescentes e podem ser fotografados qualitativamente in vivo. Aqui, descrevemos um método para obter imagens quantitativas da lipofuscina RPE usando oftalmoscopia a laser de varredura confocal.

Resumo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é justaposto à retina sensorial sobrejacente e suporta a função do sistema visual. Entre as tarefas desempenhadas pelo EPR estão a fagocitose e o processamento de segmentos fotorreceptores externos por meio de organelas derivadas de lisossomos. Esses produtos de degradação, armazenados e chamados de grânulos de lipofuscina, são compostos parcialmente por bisretinóides, que possuem amplos espectros de absorção e emissão de fluorescência que podem ser detectados clinicamente como autofluorescência do fundo com oftalmoscopia a laser de varredura confocal (cSLO). O acúmulo de lipofuscina está associado ao aumento da idade, mas também é encontrado em vários padrões em doenças degenerativas adquiridas e hereditárias da retina. Assim, estudar seu padrão de acúmulo e correlacionar esses padrões com alterações na retina sensorial sobrejacente são essenciais para entender a fisiopatologia e a progressão da doença da retina. Aqui, descrevemos uma técnica empregada por nosso laboratório e outros que usa cSLO para quantificar o nível de lipofuscina RPE em olhos saudáveis e doentes.

Introdução

O epitélio do pigmento da retina (EPR) suporta a função da retina sensorial através de numerosos processos ^1. degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é a causa mais importante de cegueira intratável em países industrializados e é caracterizada por alterações na EPR, incluindo perda de pigmento, perda de função e atrofia. Em AMD e no envelhecimento normal, o RPE acumula organelas fluorescentes, derivadas do lisossoma contendo fragmentos fotorreceptoras fagocitado, referidos como grânulos de lipofuscina. A acumulação de lipofuscina EPR foi pensado para indicar disfunção oxidativo ^1, mas estudos recentes têm demonstrado que a morfologia do EPR ​​permanece normal em olhos idade com altos níveis de lipofuscina ^2. Marcadores No entanto, padrões anormais de distribuição de lipofuscina, nomeadamente a perda de lipofuscina, estão documentados para a progressão AMD e AMD, tanto histologicamente e clinicamente ^3,4

proces defeituososcante de lipofuscina EPR foi também demonstrado que ocorrem em certos degenerações retinais hereditárias. Pacientes que sofrem de doença de Stargardt (STGD) acumulam lipofuscina no RPE em uma idade jovem, eventualmente, desenvolver perda de visão semelhante ao visto em AMD ^5. Estes achados sugerem que o acúmulo de lipofuscina pode ser ele próprio tóxico e conduzir RPE disfunção ^6,7. No entanto, um estudo de imagem detalhada de indivíduos com STGD ao longo do tempo não confirmam que o acúmulo de lipofuscina focal levou a subsequente perda de RPE ^8. Por isso, embora anormalidades lipofuscina são marcadores para degenerações da retina, um papel para a toxicidade direta de lipofuscina ainda não foi provado.

O EPR é a camada mais posterior da célula da retina, mas gera a maior parte do sinal fluorescente a partir do fundo ocular. Geração e detecção de autofluorescência (AF) derivado do EPR pode ser realizada utilizando oftalmoscopia de laser confocal de varredura (cSLO), que permite a VIsualização da distribuição espacial da FA fundus. Certos degenerações retinianas demonstram padrões distintos de fundo de olho AF, e auxiliares de imagem AF do diagnóstico e acompanhamento dessas condições. Apesar de imagem AF padrão é clinicamente importante, AF quantitativa (QAF) tornou-se um importante meio de avaliar a saúde RPE. Nós e outros desenvolveram uma abordagem padronizada que podem determinar com confiança níveis QAF em locais específicos da retina ^9. QAF tem aplicações potenciais no diagnóstico e monitoramento das condições da retina, e também pode ter utilidade no prognóstico e estratificação de risco. Além disso, as capacidades de diagnóstico de Qaf também foram descritas para certos distúrbios da retina ^10-12. Aqui, nós fornecemos detalhes passo a passo para a realização de nossa técnica acompanhada por uma demonstração visual da sua aplicação na avaliação de olhos saudáveis ​​e doentes.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os pacientes incluídos nestes estudos foram feitos lo de acordo com aprovado revisão institucional de supervisão bordo no New York University School of Medicine.

1. Seleção de Pacientes e preparação inicial para criação de imagens

Nota: Os seguintes materiais são necessários: 0,5% solução oftálmica tropicamida, 2,5% solução oftálmica fenilefrina, cSLO equipado com espectral de tomografia de coerência óptica (SD-OCT), e referência interna de fluorescência.

1. Antes de imagiologia, adequadamente configurado cSLO para aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante.
2. Montar uma referência interna fluorescente no cSLO. Nota: A referência fluorescente interno, comprado ao fabricante, está alojado em um anel de metal e é colocado diretamente atrás da lente da câmera. Se um cSLO de outro fabricante, é usado, pode haver uma configuração diferente do que aquele que está descrito emeste protocolo.
   1. A fim de inserir a referência no cSLO, torcer a lente para removê-lo, retire anel de metal da máquina, e substituí-lo com o novo anel de metal que contém a referência.
      Nota: a referência fluorescente interna é essencial para a técnica QAF, uma vez que permite a correção para a variação na potência do laser e um detector de sensibilidade / ganho.
3. Tenha pacientes recrutados para imagens submeter a um exame de rotina olho dilatado e obter informações básicas sobre a história ocular passado e condições médicas subjacentes que podem se manifestar com achados oculares.
4. Dilatar os alunos com tropicamida 0,5% e 2,5% de fenilefrina. Passo crítico: Dilatar alunos a pelo menos 6 mm. Nota: Isto é essencial para a passagem ininterrupta de luz, e, portanto, para a visualização ideal e medição do fundo.
5. Antes da imagem, posicione o paciente adequadamente no cSLO, com o queixo apoiado na chinrest, testa colocado contra a forehead descanso, e ângulo ocular lateral, devidamente alinhados com os indicadores.

2. Base de imagem de fundo de olho

1. Em primeiro lugar, a imagem do fundo com luz reflectância de infravermelho (IR) próximo (comprimento de onda de 820 nm), a fim de centralizar a câmera sobre a mácula e obter o foco áspero.
   1. Com o paciente posicionado corretamente, mude a configuração de hardware no painel de controle para o modo de imagem IR, câmera posição manualmente até o fundo está em foco completo, e ter uma imagem
   2. Ajuste a configuração no painel de controle para "IR-OCT", que usa espectral-domain tomografia de coerência óptica (SD-OCT) em conjunto com imagem IR para avaliar a mácula para a doença subjacente.
   3. Use as guias presentes na janela de imagem para orientar corretamente a OCT para a imagem IR do fundo. Para obter ótimos SD-OCT qualidade, posicionar a câmera de modo que a imagem OCT é no terço superior da sua janela de imagem. Adquirir pelo menos uma sc linha horizontalum através da fóvea e que mede o campo de imagem inteira.

3. Criação de Imagem QAF

1. Use aquisição de imagem "alta velocidade". Nota: Esta configuração permite a aquisição de imagem mais rápido, o que diminui o risco de perda de sinal devido ao movimento do paciente e resultando bloqueio da luz pela íris ou pálpebras.
2. Use "A média de 9" frames. Nota: Esta configuração permite a rápida captura, sequencial de 9 quadros de imagem, que podem ser posteriormente "média" para reduzir o ruído e artefacto (veja abaixo).
3. Use campo "30 x 30 graus". Nota: Isto se refere aos graus de área da retina capturado durante a aquisição de imagem.
4. Antes de imagiologia, alertam paciente sobre a luz azul, pois isso pode ser alarmante em primeiro lugar.
5. Ligue o modo AF e alinhar eixo da câmara de tal modo que a tela é maximamente "preenchido" com AF fundo de olho (escurecimento mínima dos lados e cantos da imagem).
   1. Se os pacientes hdificuldade av tolerar a luz azul brilhante, começar de imagem com a câmera mais longe do olho e, em seguida, levar a câmera lentamente na direção do paciente até o fundo do útero está totalmente à vista.
      Passo crítico: Se a luz que entrem ou deixem a partir do olho é obstruída, diminuição do sinal irá resultar. diminuição localizada é visível como escurecimento assimétrica de um lado imagem ou canto. perda generalizada de sinal é visto quando os movimentos dos olhos sozinho obstruir a passagem de luz.
6. Alinhe a câmera de modo que o sinal AF está em seu nível mais alto em todo o campo. Apontar para sinal máximo em vez de imagem mais nítida, no entanto, cerca de correlacionar. Ajuste o foco da câmera movendo o cSLO para reposicionar a câmera manualmente ou com o joystick oftalmoscópio.
7. Ajustar a sensibilidade / ganho de tal forma que fundus AF é facilmente visível, mas evitar o excesso de saturação. Durante a aquisição de imagem, pixels coloridos visíveis tanto na referência interna (localizado na parte superior doimagem) ou do fundo indicam excesso de saturação e, portanto, perda de sinal.

4. Aquisição de Imagem

Nota: passo crítico: O objetivo da aquisição de imagem deve ser a obtenção de 2 qualidade 9-quadro pilhas altas imagem por sessão para controlar a variabilidade entre as imagens dentro de uma sessão. Depois de reposicionar o paciente e câmera, obter uma segunda sessão de duas imagens para avaliar e controle para variabilidade. Todas as imagens estarão em última análise, ser calibrado para a referência interna (descrito abaixo).

1. Adquirir imagens só depois de pelo menos 20 segundos de "branqueamento" (exposição cheia de retina à luz AF) para minimizar a absorção de luz por rodopsina na retina sensorial ^9.
   1. Utilizar este período para otimizar o alinhamento da câmera, foco e sensibilidade.
2. Têm os assuntos piscar antes de cada aquisição de imagem como um filme lacrimal fresco melhora a qualidade do sinal.
3. Evitar pálpebras no plano de aquisição.
   Nota: Pode ser útil para manualmente as pálpebras abertas para pacientes mais difíceis. Os autores recomendam que um assistente executa esta tarefa.
4. Otimizar o alinhamento antes de cada aquisição de imagem para garantir que a luz não é obstruída pela íris, resultando em sinal de diminuição.
   Nota: Como pelo menos uma pequena deslocação é muito comum, os autores recomendam realinhamento bem como necessário antes de cada aquisição de imagem. Orientar e incentivar o paciente enquanto imaging ajuda movimento diminuição. Os autores também recomendo o uso do pé-pedal da máquina como o botão "aquisição" de modo a minimizar a distração do operador.
5. Executar o processamento pós-imagem, calculando a "média" da pilha de 9-quadro para aumentar a relação sinal-ruído. Calcula-se a média de uma pilha usando o software cSLO, seleccionando a opção para calcular a média.
   Nota: Pode haver pilhas onde alguns quadros não são de ótima qualidade (ou seja, ter localizada ou generalizada diminuiu sinal em relação aos quadros óptimas), portanto verifique cuidadosamente cada pilha e desmarque quadros sub-óptimos antes de cálculo da média.
   Nota: imagens médias com índices aceitáveis ​​de sinal-para-ruído pode ser processado a partir de, pelo menos, 3 quadros. É normal para os lados e cantos de cada imagem para ter sinal de menor do que os centrais 20 graus, devido a limitações dentro do próprio cSLO.
   1. Se o software pergunta se o operador gostaria de normalizar os níveis de cinza (ou seja, alongar o histograma) entre 0 e 255, selecione "Não". Isso mantém níveis de cinza inalterados para análise.

Análise 5. Imagem

1. Analisar imagens AF como descrito anteriormente usando o software de análise de imagem desenvolvido para a técnica QAF (IGOR; ^9). Uma breve descrição de uma análise de imagem típica usando este software está incluído abaixo.
   1. Carregar o programa QAF em IGOR e importar imagens (em formato .bmp) exportados dasoftware cSLO com proporção de pixel 768 x 768 (parâmetro de saída padrão).
   2. Selecione a imagem no menu drop-down e iniciar a análise.
   3. Reposicionar indicadores de calibração na imagem de modo a que os "mira" sobrepor a fóvea e do "suporte" confina com o disco óptico (estes indicadores são usados ​​para dimensionar e posicionar os ROIs). Quando devidamente posicionado, software uso prompts em seguida, preencher a imagem com ROIs circunferenciais em torno da fóvea (ver Figuras 1, 2).
   4. Selecionar a opção no IGOR para calibrar os níveis de cinza globais de cada imagem para esses níveis presentes na referência fluorescente interno. Nota: Esta etapa permite a calibração dos factores relacionados com a máquina, incluindo o nível eletrônico de zero de cada imagem e o fator de calibração de referência interna de cada máquina, bem como fatores relacionados aos pacientes, incluindo idade, refração e curvatura corneana.
      Nota: O software de análise, em seguida, exibe o r fixoegiões sobre a imagem resultante e um valor Qaf é demonstrada no interior de cada região. valores QAF também são inseridos automaticamente em um formato de planilha em uma janela separada ".
   5. Gerar QAF "mapas de calor", selecionando a opção dentro dos prompts de comando. Todas as imagens e os dados podem ser exportados a partir do software IGOR em uma planilha do Excel, selecionando as opções apropriadas.

Resultados

Esta técnica foi utilizada para estudar QAF em ambos os saudáveis ^​​13 e doença estados ^10-12. Em olhos saudáveis ​​(Figura 1), AF emitida a partir da EPR é distribuído relativamente uniforme por todo o fundo (Figura 1A). intensidade reduzida é visto na região macular central devido ao bloqueio da luz pelo pigmento macular, e para os lados e cantos da imagem devido a óptica do olho e câmera. Vasos aparecem escuras e deve estar em fo...

Discussão

distribuição de lipofuscina EPR anormal, quer aumentada ou diminuída, é um marcador sensível da doença da retina e é geralmente associada com a perda da função retina sensorial. Aqui, nós descrevemos a aplicação de Qaf para a avaliação de lipofuscina EPR. Incorporação de uma referência fluorescente interna para corrigir a variável de potência do laser e um detector de sensibilidade ⁹ juntamente com a nossa técnica de imagem padronizada permite a quantificação confiável dos níveis de AF. É nosso objetivo que e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0,5% solução			Qualquer marca pode ser usada
solução			Qualquer marca pode ser usada
Referência fluorescente interna	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics