Tridimensional Tecnologia Biomimético: Novel Biorubber Cria Definido micro e macro-escala Arquitecturas em colágeno hidrogéis

Resumo

Uma técnica inovadora de biofabricação foi desenvolvida para projetar construções tridimensionais que se assemelham às características arquitetônicas, componentes e propriedades mecânicas do tecido in vivo. Esta técnica apresenta um material de sacrifício recém-desenvolvido, a borracha BSA, que transfere características espaciais detalhadas, reproduzindo as arquiteturas in vivo de uma ampla variedade de tecidos.

Resumo

andaimes tecido desempenham um papel crucial no processo de regeneração do tecido. O andaime ideal deve cumprir vários requisitos, como ter composição adequada, o módulo alvo e características arquitectónicas bem definidas. Biomateriais que recapitulam a arquitectura intrínseca no tecido in vivo são essenciais para o estudo de doenças, bem como para facilitar a regeneração de tecidos moles e perdeu mal formado. Uma técnica biofabrication novo foi desenvolvido, que combina estado da arte de imagem, a impressão tridimensional (3D), e a actividade enzimática selectiva para criar uma nova geração de biomateriais para pesquisa e aplicações clínicas. O material desenvolvido, borracha de Albumina de Soro Bovino, é de reacção injectada num molde que mantém características geométricas específicas. Este material sacrificial permite a transferência adequada de elementos arquitectónicos a um material de andaime natural. O protótipo consiste em um andaime de colágeno 3D com 4 e 3 canais mm que reprESENT uma arquitetura ramificada. Este artigo destaca o uso desta técnica biofabrication para a geração de construções naturais. Este protocolo utiliza um software assistida por computador (CAD) para a fabricação de um molde sólido que vai ser injectado com borracha reacção de BSA, seguido pela digestão enzimática da borracha, deixando a sua arquitectura interior do material de andaime.

Introdução

No campo da engenharia de tecidos a capacidade de fabricar andaimes tecido é vital. Um andaime tecido adequado tem uma estrutura 3D, é composto de materiais biocompatíveis, e imita em arquitectura do tecido vivo para facilitar o crescimento e remodelação dos tecidos e células. Este andaime deve permitir o transporte de nutrientes ea remoção de resíduos ^1-4. Um dos principais obstáculos para a produção destes suportes é a capacidade de recapitular características geométricas específicas para um material biocompatível. Diversas técnicas têm sido relatados biofabrication para controlar as características geométricas destes suportes, os exemplos são electrospinning ^5-8, solvente de fundição ^9, estereolitografia ^10, e 3D-impressão ^11, entre outros. Estas técnicas são insuficientes para proporcionar uma transferência relativamente fácil de características arquitectónicas internas e externas controláveis, são caros, são limitados pela sua resolução e capacidade de impressão ( por exemplo, medidor de bocal, restrição de materiais), ou exigir técnicas de pós-fabricação que exige um longo período de tempo para produzir scaffolds viáveis ^​​12.

Em muitos sistemas comerciais de fabrico, a criação de espaços vazios internos, canais e características é conseguido usando areia ou outros materiais removíveis ou sacrificiais adequados. A parte de metal ou plástico é formada em torno do molde de areia, e uma vez que é solidificado, a areia é removida. Em grande parte da mesma maneira, a próxima geração de biomateriais precisa o equivalente bioareia. Portanto, a borracha de BSA foi desenvolvido como um substituto para bioareia. A borracha é um material de BSA recém formulada que consiste em albumina de soro bovino reticulado com glutaraldeído. O objetivo final é recriar elementos arquitectónicos específicos em um andaime de colágeno biodegradável. As características do biorubber sacrificial que mantém uma fidelidade dimensional com o molde do tecido original são descritos.

várias combinações de concentrações de BSA e glutaraldeído foram testadas utilizando uma variedade de solventes. Este material foi criado pela reacção entre BSA e glutaraldeído. borracha BSA pode ser a reação injetada nas geometrias complexas dos moldes de tecido. BSA reticulado é lábil tripsina e facilmente digerido pela enzima em condições de pH e de temperatura moderadas. Por outro lado, tipo I colágeno intacta é muito resistente a digestão com tripsina. Esses recursos foram capitalizados para remover seletivamente a borracha BSA deixando o colágeno para trás. O presente trabalho consistiu em determinar os parâmetros ideais necessários para obter um molde lábil que pode oferecer características arquitectónicas específicas para um andaime biocompatível. As características específicas que foram avaliados incluíram mixability, a digestão enzimática, suporte de carga e capacidade de ser a reação injetado em um molde negativo. A combinação de 30% de BSA e 3% glutaraldeído preenche estes requisitos. Este protocolo prevê o necessorientações ary para criar estes scaffolds tridimensionais. O protótipo consiste de um andaime de colagénio que representa uma arquitectura ramificada com uma entrada e duas de saída do canal com diâmetros de 4- e 3 mm, respectivamente. Esta técnica tem o potencial para imitar macro e micro-ambientes do tecido de interesse. Esta tecnologia proporciona uma técnica viável para oferecer um instrutivo geométrica específica de um material biodegradável numa matéria relativamente fácil e atempada com alta fidelidade, a qual pode ser sintonizado para imitar in vivo a elasticidade do tecido e outras características do tecido de interesse.

Protocolo

1. Determinar a percentagem de sólidos no lote Collagen

1. Extrai-se a colagénio seguindo um procedimento publicado anteriormente ^13. Descongelar um mínimo de 20 ml de colagénio. Determinar a percentagem inicial de sólidos de colagénio do lote de modo a manipular a concentração de colagénio nos hidrogeles formados.
   1. Corte três pedaços de folha de alumínio (cerca de 6 x 6 cm) e moldar cada um como uma panela, utilizando o fundo de um copo de 25 ml. Grave o peso de cada panela.
   2. Adicionar uma pequena quantidade de colagénio para cada panela e registar o peso total da panela de alumínio e de colagénio. Adicionar 0,5-0,8 g de colagénio em cada recipiente de alumínio.
      Nota: Após este passo, há três recipientes de folha de alumínio e cada um deve ter uma pequena quantidade de colagénio. Certifique-se de registar o peso de cada recipiente de alumínio (total de 3) e o peso vazio do recipiente após a adição do colagénio.
   3. Calcule o peso do colagénio em cada bandeja usando o fepois fórmula:
      peso colágeno = Pan e peso colágeno - peso Pan
   4. Colocar os três cadinhos de alumínio que seguram o colagénio no forno a 100 ° C durante 24 h.
   5. Após 24 h, registar o peso de cada recipiente de alumínio e o colagénio desidratada.
   6. Calcule o peso do colagénio desidratada usando a seguinte equação:
      peso desidratado colágeno = Pan e peso colágeno desidratado - peso Pan
   7. Calcula-se a percentagem de sólidos para as três amostras para determinar a concentração de sólidos de colagénio utilizando a fórmula seguinte:
      
   8. Calcular o teor de sólidos de colagénio média do lote utilizando a percentagem de sólidos de colagénio para cada uma das três amostras.
      Nota: O colágeno que será usado é o que resta do colágeno hidratado. Nenhum dos colagénio desidratada irá ser utilizado.
   9. Depois de determinar a percentagem de colagénio sólido (Iconcentração de colágeno nitial) do lote, continuar a utilizar o colágeno hidratado restante. Usar um medidor de pH calibrado para ajustar o pH do lote de colagénio a 3.
      1. Adicionar pequenas quantidades (2-5 mL de cada vez), de 12 de ácido clorídrico (HCl). Manter em gelo em todos os momentos. Não adicionar o ácido clorídrico directamente para o colagénio - adicionar o ácido ao lado do tubo. Depois de adicionar o ácido, utilizar a espátula para empurrar o ácido para o colagénio rapidamente e agitar a mistura.
   10. Uma vez que se atinja um pH de 3, deixar que o colagénio sentar O / N a 4 ° C.

2. Preparação da borracha BSA

1. Preparar a solução de Albumina de Soro Bovino (BSA) seguindo o procedimento abaixo.
   1. Preparar a solução de 2x tampão fosfato salino (PBS). Adicionar dois comprimidos de PBS a 100 ml de água para fazer uma solução 0,02 M de PBS.
   2. Combinar BSA com 2x PBS para criar uma solução de BSA a 30% usando o procedimento abaixo.
      1. Por exemplo, para fazer uma BSA de 30% com 30 ml de 2x PBS, usar 12,9 g de BSA. Adicione 1/3 do 2x PBS (por exemplo, 10 ml) a um frasco com uma barra de agitação. Adicione 1/2 do BSA (por exemplo, BSA 6,45 g) ao balão e usando uma espátula, molhar o soluto seco.
      2. Repetir este processo de adição de PBS e, em seguida, BSA até que todo o soluto e solvente está no frasco. Usar uma espátula para molhar toda a soluto. Será parecido com uma mistura de um pouco de líquido e aglomerados. Deixe descansar por cerca de 30 min.
      3. Em seguida, ligue o agitador em um ciclo de baixa e certifique-se de que não existem aglomerados ao redor da barra de agitação. Ele deve levar 90 minutos para chegar tudo em solução ou pode ser deixada em agitação O / N a 4 ° C. Depois de o soluto é dissolvido todo, colocar a solução em uma seringa de 20 mL e tapada com um filtro de seringa de 0,20? M. Pressionar o êmbolo para expelir líquido através do filtro e recolher a solução esterilizada em um novo tubo. Armazenar a 4 ° C.
   3. Prepare 3% soluti glutaraldeídopor diluição em solução de glutaraldeído a 25% com PBS estéril filtrada 2x. Por exemplo, para 10 ml de solução de glutaraldeído a 3%, utilizar 2 ml de 25% de glutaraldeído e 8 ml de 2x PBS. Armazenar a 4 ° C.

3. Moldes Tratamento

Nota: O protótipo descrito neste documento usa um feito de aço inoxidável Y peça de molde. O molde contém um fluxo de entrada e dois canais de escoamento de 4 e 3 mm, respectivamente. Em primeiro lugar, moldes limpos, pulverizá-los com banha insaturado e esterilizá-los. Prepare os moldes de acordo com o procedimento descrito abaixo.

1. moldes de aço inoxidável limpo usando sonicator com uma frequência de 35 kHz. Coloque os moldes na sonicator e mergulhe-os com água e gelo. Manter os moldes frio em todos os momentos, enquanto o sonicator está em execução. Executar o sonicador durante 2 períodos de 90 min.
   1. Depois de cada período, usar uma agulha para se certificar de que não existe material no Luer Lock ou de aço inoxidável bconector de Rass. Use sabão e água para limpar toda a superfície de ambos os lados dos moldes. Verificar que não existe qualquer obstrução nos canais.
2. Coloque a moldes, parafusos e conector de bloqueio Luer num saco de autoclave e esterilizar-lo.
3. Encha a garrafa que atribui a um meio caminho pulverizador de ar com banha comercialmente disponível (agente de liberação de ácidos graxos misto). Recoloque a tampa com uma garrafa cap regular. Coloque-o em um saco de autoclave e esterilizar-lo.
   Nota: A banha é utilizado para facilitar a libertação do material que vai ser injectado reacção mais tarde (borracha de BSA). Não coloque a tampa do frasco do pulverizador na autoclave- ele pode danificar o selo interno.
4. Aqueça a banha de 45 segundos ou até que o seu claro e líquido em um forno de microondas. Feche a tampa do pulverizador de ar para a garrafa de banha. Ligar a tampa com o pulverizador. Fixe o pulverizador para a fonte de ar na bancada do laboratório. Abrir a válvula de ar, e abrir o bico do pulverizador até que começa a molhar a superfíciede uma toalha de papel.
5. Spray de banha perpendicular à superfície do molde até que a superfície está totalmente coberta. Depois de cada peça foi pulverizado, colocá-los em uma placa de Petri e selá-lo. Colocar os moldes a 4 ° C durante 2 h.
6. Avance para esterilizar os moldes por exposição da superfície a luz UV durante 30 min. Colocá-los de volta a 4 ° C até que estejam prontos para ser a reação injetada.

4. Injecção de Reacção da borracha BSA

Nota: Todos os materiais e solução deve ser manter o frio até à sua utilização para evitar a solidificação prematura da borracha BSA nos passos seguintes.

1. Prepare o distribuidor para a entrega da borracha BSA aos moldes de seguir estes passos.
   1. Esterilizar todos os componentes de mistura (dois S, anéis de tampa da seringa, a seringa dupla, misturar ponta, e 4: 1 dispensador) por expondo-os a luz UV durante 30 minutos na capa da reacção em cadeia da polimerase (PCR).
      Nota: Um capuz de PCR foi utilizado porque to procedimento envolve fixadores. Estes produtos químicos não pode ser utilizada na capa de cultura de células / tecido, devido ao risco de exposição e a toxicidade para as células. Qualquer outra capa que contém uma luz UV vai ser adequado.
   2. Coloque a tampa da ponta no suporte da solução.
   3. Realizar a mistura e injecção a uma proporção de 4: 1 de BSA: Glutaraldeído. Adicione o BSA 30% para a câmara de seringa dupla que irá entregar a maior quantidade de solução (Isso levará cerca de 4 ml para encher). Certifique-se de deixar espaço suficiente para colocar o anel de vedação, a fim de evitar a contaminação de transbordamento e da câmara adjacente.
   4. Adicionar solução de glutaraldeído a 3% para a outra câmara (vai demorar cerca de 1 ml para encher). Certifique-se de deixar espaço suficiente para colocar o anel de vedação para evitar a contaminação de transbordamento e da câmara adjacente.
   5. Coloque a seringa dupla no distribuidor. Incline a montagem vertical de modo que a tampa da seringa está no topo. Recoloque a tampa com a ponta de mistura.
   6. ScRew as duas peças do molde de aço inoxidável em conjunto.
   7. Coloque o conjunto dentro de um saco de autoclave.
   8. Para remover qualquer ar no distribuidor, segurá-la na posição vertical e rapidamente apertar a pega uma vez para libertar uma quantidade pequena do BSA misturado com o glutaraldeído. Em seguida, rapidamente anexar conector de bloqueio Luer do aço Y molde inoxidável para a ponta da seringa.
   9. Segure o molde de aço inoxidável Y com a mão esquerda e o distribuidor de mistura BSA-Glutaraldeído à direita. Alternativo corresponde a cada uma de escape esquerda e direita dos canais de escoamento, premindo o escape para os lados do saco de autoclave para garantir que os espaços vazios no interior são preenchidos com a solução. Em seguida, coloque os moldes horizontal e injetar novamente.
   10. Retire os moldes de dispensador e coloque em uma placa de Petri de 25 mm.
   11. Coloque Parafilm em torno do prato de Petri para evitar a desidratação da borracha.
   12. Coloque o molde no 4 ° C frigorífico O / N.

Nota: O colagénio deve ser mantido em gelo durante todo o tempo do processo.

1. Modificar a concentração de colágeno em função da percentagem de sólidos de colágeno.
   1. Adicione 10 ml de colagénio de 1,75%, ajustando a concentração de colagénio inicial com água fria.
   2. Utilizando um medidor de pH calibrado, ajustar o pH para 3 usando 12 N ácido clorídrico. Não adicionar o ácido clorídrico directamente para o colagénio adicionar o ácido ao lado do tubo. Depois de adicionar o ácido, utilizar a espátula para empurrar o ácido para o colagénio rapidamente e agitar a mistura.
   3. Pesar 4 g de colágeno em um tubo cônico separado.
   4. Centrifuga-se o colagénio para remover o ar, a 4 ° C e 9343 x g durante 20-30 minutos.
   5. UV esterilizar o capuz de cultura de células durante 30 min, e adicionar 14 ul de laminina para o colagénio de 4 ml. Isto irá resultar numa concentração final de 10 laminina ug / uL. Nota: A laminina s forneceintegridade tructural, adesão, e promove a várias respostas celulares.
   6. Vire a UV PCR luz por 20-30 minutos antes de usar a capa para a esterilização.
   7. Colocar a tampa de fecho Luer, para ligar a uma seringa de 20 ml, em etanol durante uma 2 horas. Em seguida, deixe-a secar e colocá-lo à luz UV.
   8. Gamma irradiar o colágeno por 8,6 min para chegar a 1.200 cGy.
      Nota: O tempo dependerá do decaimento da fonte de césio. Ajustar o tempo para atingir a mesma dosagem.

6.Casting colágeno em BSA Rubber

1. Para polimerizar o colagénio, utilizar a 8: 1: 1 (de colagénio: HEPES: MEM). O procedimento seguinte baseia-se numa 4 g inicial de colagénio acidificado (a partir do passo 5.1.8).
   1. Adicione uma solução 0,2 N de HEPES em água e ajustar o pH a 9 por adição de pequenas quantidades (1-5 ul) de solução 1-5 M de hidróxido de sódio (NaOH). Utilizando um medidor de pH calibrado, monitorar o pH da solução após cada adição. Armazenar a 4 ° C ou keep no gelo.
   2. Ligar a luz UV da capa de cultura de tecido por 20-30 min para esterilizar o capô.
   3. forceps autoclave, espátula, e bisturi para a esterilização.
   4. Misturar 1,5 ml de 0,2 N de HEPES (pH 9) e 1,5 ml de MEM de 10x utilizando o capuz de cultura de tecidos. Certifique-se de mantê-lo no gelo e vortex-lo por 5 segundos antes de usar. Armazenar a 4 ° C ou manter em gelo.
   5. Para esterilizar o capô PCR, ligar a luz UV por 30 min.
   6. Colocar uma placa de 12 poços e uma seringa de 20 ml em -20 ° C durante 10 minutos, ou até estar pronto para continuar. Nota: Mantenha todos os materiais fria até que esteja pronto para uso. O aumento da temperatura induz fibrilogénese prematura colagénio.
   7. Spray de todos os tubos e placas de poços que vão estar na capa com 70% de etanol e deixe-os secar para esterilização. Coloque uma seringa de 20 ml em gelo para arrefecer a uma utilização posterior.
   8. Na capa PCR, abrir os moldes de aço inoxidável para liberar a borracha BSA e usando um bisturi, cortar os canais de escape do BSA rmolde ubber.
   9. Sob a capa de PCR, abrir os tubos de colagénio estéreis e adicionar 1 ml de solução tampão HEPES-MEM (certificar-se de que antes de se extrair a solução de HEPES-MEM, que é bem misturado e não há depósitos sólidos).
   10. Utilizando a espátula esterilizada, homogeneiza-se a solução de colagénio e tampão.
   11. Feche e vortex-lo rapidamente para garantir um hidrogel bem misturado.
   12. Transfira para uma fria seringa de 20 ml.
   13. Com um lado, manter a borracha de BSA no interior do poço e, com a outra, dispensar metade da solução de colagénio de hidrogel para o fundo do poço.
   14. Usando a pinça estéreis, garantir que as extremidades de borracha de entrada e saída estão tocando as paredes do poço.
   15. Pour solução de colagénio no topo da borracha até que esteja completamente coberto.
   16. Assegure-se que a borracha BSA é suspenso no interior do colagénio e que não existem bolhas, especialmente perto das extremidades da borracha.
   17. Coloque a tampa e enrole em torno do Parafilmcircunferência do poço.
   18. Colocar na incubadora durante 1 h a 37 ° C. Mantenha a luz UV PCR diante.
2. Após a polimerização do colagénio, UV reticular o hidrogel através do procedimento seguinte.
   Nota: A reticulação do colagénio será feito utilizando um aparelho de reticulador de UV em que a quantidade de energia pode ser controlada.
   1. Ligue o reticulador de UV e usar o ajuste de energia para irradiar a câmara vazia com 630.000 μJ / cm ^2.
   2. Remover os geles da incubadora.
   3. Spray de mãos com etanol, e, no interior da câmara, remover a tampa tão rapidamente quanto possível.
   4. Feche a câmara e UV reticular os hidrogéis seleccionando a definição de energia e irradiação de 630.000 μJ / cm ^2.
   5. Após o ciclo de reticulação, desligar a luz UV na capa PCR
   6. Spray de mãos com etanol e abrir a câmara, rapidamente colocar a tampa de volta na placa bem. Mova a placa depara a capa de PCR.
   7. Utilizando a espátula estéril, suavemente soltar e remover o gel a partir do poço. Virar os géis sob a capa para reticular o fundo do hidrogel. Repita o passo 6.2.3 e 6.2.4.

7. Digestão Enzimática da borracha BSA

1. A fim de ter uma estrutura de suporte oca de colagénio, BSA remover borracha de uma forma que não afecta as dimensões incorporados no hidrogel. O procedimento é descrito a seguir.
   1. Ligar a luz UV durante 20-30 minutos para esterilizar o capuz de cultura de tecidos.
   2. Adicione 0,25% de solução de tripsina pH 7.8. Por exemplo, por 15 ml de água, adicionar 0,0376 g de tripsina em um tubo de 50 ml. Ajustar o pH para 7,8 por adição de pequenas quantidades (2-5 ul) de 1 M de NaCl. Coloque a solução numa seringa de 20 mL e tapada com um filtro de seringa de 0,20? M. Pressionar o êmbolo para expelir líquido através do filtro e recolher a solução estéril em um novo tubo.
   3. Ligar o banho de água e ajustar a temperatura a 30° C.
   4. Após 30 minutos, desligar a luz UV. Spray de etanol em todos os tubos e materiais que irão ser utilizados na capa.
   5. Transferir o hidrogel colágeno sob o capô e coloque no tubo cônico separado.
   6. Adicionar cerca de 3-5 ml (apenas o suficiente para cobrir os géis) de solução de tripsina a 0,25% com um pH de 7,8 a cada tubo.
   7. Selar os tubos com Parafilm e vortex levemente durante cerca de 1 min.
   8. Lugar no 30 ° C banho de água por 15-24 horas. Enquanto no banho de água, levemente vortex os geles com frequência até que a borracha de BSA foi digerido ou removido a partir do hidrogel.
      Nota: A fim de determinar se a borracha de BSA foi removida, quer a borracha é flutuante na solução de tripsina ou existem pedaços quebrados de deslocamento. Não deve haver áreas escuras visuais dentro do hidrogel.
2. Para assegurar que toda a borracha e BSA a tripsina foi removida a partir dos hidrogéis, lave-o, conforme descrito abaixo.
   1. Ligue o hoo PCRluz UV d por 20-30 min.
   2. Preparar a solução Mosconas. Combinar cloreto de potássio (KCl, 28,6 mM), _(NaHCO3, 11,9 mM), glicose (9,4 mM) e (NaH ₂ PO _4, 0,08 mM) em água. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 M ou solução 12 M de HCl. Coloque a solução numa seringa de 20 ml e usar um filtro de seringa de 0,20 uM para esterilizar a solução.
   3. Spray de tudo com etanol antes de colocá-los na capa e permitir que o etanol para secar.
   4. Abrir o tubo de transferência e 5-10 ml de solução estéril Mosconas para um novo tubo de 50 ml.
   5. Transferir o hidrogel de colagénio ao tubo cónico que contém a solução de enzima. Certifique-se de que o hidrogel é completamente coberto com a solução. Deixar o tubo com o agitador no frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
   6. Aspirar a solução Mosconas e repita o passo 7.2.5 duas vezes.
   7. Armazenar a 4 ° C.

Resultados

Os resultados demonstram que esta técnica biofabrication é eficiente na geração de suportes 3D que podem imitar o arranjo espacial visto no tecido in vivo. As características arquitectónicas são parâmetros vitais para a aplicação de engenharia de tecidos, que jogam um papel crucial na interação in vivo celular e funcionalidade do tecido.

A consistência e miscibilidade da borracha de BSA foi um parâmetro impor...

Discussão

Biofabrication é um campo altamente multidisciplinar, na qual biologia e engenharia princípios fundem para gerar materiais complexos que imitam tecido nativo. A fim de alcançar este objectivo, existe uma necessidade de desenvolver técnicas que utilizam a informação recolhida a partir de tecido in vivo, e traduzi-la em um andaime in vitro. Deste modo, uma plataforma pode ser manipulada que se assemelha de perto as propriedades arquitectónicos, funcionais, e mecânicas do tecido in vivo. O materi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colágeno tipo I			Colágeno extraído do couro de bezerro
Ácido clorídrico (HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Solução tampão de fosfato (comprimidos PBS)	MP Biomedical	U5378	1 comprimido por 100 ml faz 1x
PBS Albumium de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Glutaraldeído	Sigma -Aldrich	G5882	Campos
Banha	Tóxica	3090
Moldes			Fresados usando Máquina de Microlução
Kit de Aerógrafo	Central Pneumático	47791
Ponta de Mistura para seringa dupla	Medmix	ML2.5-16-LLM	Mixer, DN2,5X16, 4:1 marrom, med
Pequeno anel O para seringa dupla	Medmix	PPB-X05-04-02SM	Pistão B, 5 ml, 4:1, PE natural
Tampa de seringa dupla	Tampa Medmix	VLX002-SM	, 4:1/10:1, PE marrom, med
Anel de vedação grande para seringa dupla	Medmix	PPA-X05-04-02SM	Pistão A, 5 ml, 4:1
Seringa dupla	Medmix	SDL X05-04-50M	Seringa dupla, 5 ml, 4:1
Dispensador de seringa dupla	Medmix	DL05-0400M	, 5 ml, 4:1, med, simples
Laminim			3,6 mg/ml - extraído em laboratório USC
Seringa de 20 ml Luer Lock Tip	BD	302830
Luer Lock Caps	Fisher	JGTCBLLX
HEPES	Sigma -Aldrich	H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)	Life Technologies	1143-030
Tripsina	Life Technologies	27250-018
UV Crosslinker	XLE1000		UV Spectroline
(NaCl)	Fisher	S271-10	Mosconas
(KCl)	Sigma -Aldrich	P5405-250
o bicarbonato de sódio Mosconas (NaHCO < sub > 3 < / sub>)	Fisher	BP328-500	Para preparar a glicose Mosconas
	Sigma -Aldrich	G-8270	Para preparar Fosfato
de sódio Mosconas didásico (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S-7907	Para preparar o
filtro estéril Mosconas para seringas	Corning	431224