Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

A função efetora das células T CD4 é criticamente dependente de sua capacidade de entrar e atravessar rapidamente uma ampla variedade de tecidos periféricos para pesquisar danos, localizar focos de infecção ou causar patologia por infecção crônica ou autoimunidade. Embora os processos de homing para locais inflamados^1-4 e extravasamento^5-7 da vasculatura para os tecidos tenham sido bem caracterizados, os fatores que impulsionam e regulam a motilidade intersticial das células T permanecem indefinidos. A migração de células T em ambientes 3D complexos tem sido estudada in vitro através do uso de matrizes artificiais^8-10 ou dispositivos microfluídicos^11,12, mas estes não conseguem recapitular o ambiente complexo e dinâmico de um sistema in vivo. Só recentemente, com o advento da imagem intravital multicolorida de alta resolução, tornou-se possível estudar o comportamento dinâmico das células imunes in situ, permitindo uma melhor compreensão das respostas imunes intactas.

Há mais de uma década, vários estudos influentes foram publicados que utilizaram pela primeira vez a microscopia multifotônica para abordar questões imunológicas. Os primeiros estudos se concentraram no comportamento das células imunes dentro de órgãos linfóides explantados^13-16, que logo foram seguidos por técnicas para obter imagens de linfonodos expostos em camundongos anestesiados¹⁷. A imagem permitiu novas observações fundamentais sobre os estágios de priming linfonodal das células T¹⁸, os mecanismos pelos quais as células T migram em órgãos linfóides secundários¹⁹, interações de células T com outras células imunes^20,21 e posicionamento dinâmico de células T dentro do linfonodo²². Embora muitos estudos iniciais tenham se concentrado na dinâmica dos linfonodos, a imagem intravital tem sido utilizada para visualizar a resposta imune em muitos tecidos periféricos, incluindo o cérebro^23-25, fígado²⁶, pulmão²⁷ e pele^28-30.

A derme da orelha do camundongo é particularmente bem posicionada para a realização de imagens, devido à espessura da pele da orelha, à relativa falta de pêlos e à facilidade com que pode ser isolada dos movimentos respiratórios³¹. De fato, a derme da orelha tem sido usada para visualizar o comportamento intersticial das células dendríticas^32,33, células T^28,29,34,35 e neutrófilos^36,37, e é um local bem estabelecido para estudar a inflamação dérmica. Cada vez mais, os procedimentos não invasivos vêm substituindo os preparos cirúrgicos da pele, incluindo os modelos de derme dividida^38,39, flanco^39,40 ou janela de retalho cutâneo dorsal^39,41, que podem induzir alterações no meio inflamatório local. O uso de células T CD4 efetoras antígeno-específicas transferidas, preparadas in vitro, permite o estudo de uma população homogênea de células no contexto de uma resposta inflamatória dérmica³⁰. Aqui descrevemos um procedimento de imagem não invasivo que permite a visualização de células T CD4 efetoras específicas do antígeno no interstício dérmico da orelha inflamada do camundongo e a capacidade de manipular essas células em tempo real, introduzindo anticorpos bloqueadores através de um cateter venoso. Mostramos que esse modelo é eficaz para rastrear o movimento das células T CD4 na derme e para consultar os mecanismos que governam essa motilidade.

Todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Rochester, e realizado em estrita conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e da Política do Serviço de Saúde Pública sobre a Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório administrada pelo National Institutes de Saúde, Gabinete de Laboratório animal Welfare.

1. Preparação de células efectoras T CD4

NOTA: TCR-transgénicos ratinhos DO11.10 BALB / c que reconhecem especificamente um péptido de ovalbumina de ovo de galinha (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Outros sistemas de TCR-transgénicos pode ser substituído, utilizando o péptido cognato apropriada em vez de POVA onde indicado.

1. Purificar células CD4 T naive
   1. Eutanásia uma fêmea DO11.10 ratinho BALB / c de 6-8 semanas de idade, por exposição a 2 L / min de CO ₂ até que o rato não apresenta sinais de movimento ou respiração durante 1 min, seguido por deslocamento cervical, ou de acordo com adiretrizes do comitê local Institutional Animal Care e Use. Pulverizar o mouse com uma solução de etanol a 70% e fazer uma incisão de aproximadamente 7 cm na pele do queixo do mouse para 2/3 do caminho para baixo do abdômen. Fazer incisões 2-3 cm de pele a partir da extremidade da incisão no abdómen para as patas traseiras. Tenha cuidado para não cortar o peritônio.
   2. Cuidadosamente separar a pele do peritoneu puxando suavemente com fórceps. Os nódulos linfáticos inguinais estão localizados sobre a pele perto da junção das patas traseiras com o corpo. Remover por agarrar e puxar com uma pinça e o lugar em 8 ml de HBSS suplementado com soro de vitelo recém-nascido 2% (NCS).
   3. Colher os gânglios axilares e linfáticos braquial do rato agarrando e puxando suavemente com uma pinça. Colocar no HBSS + 2% NCS com os nódulos linfáticos inguinais.
   4. Colher os linfonodos cervicais profundos e superficiais localizados no pescoço do rato com uma pinça e coloque no HBSS + 2% NCS com o otseus nódulos linfáticos.
   5. Delicadamente cortados em peritônio, tomando cuidado para não cortar os intestinos. Segure o ceco e cólon com uma pinça e expor os linfonodos mesentéricos que estão localizados apenas ao longo do cólon. Remova cuidadosamente os linfonodos mesentéricos com uma pinça e coloque com os outros gânglios linfáticos.
   6. Localize o baço na cavidade peritoneal e removê-lo com cuidado, segurando com uma pinça e cortar o tecido conjuntivo afastado com um par de tesouras cirúrgicas. Colocar o baço com os gânglios linfáticos.
   7. Prepara-se uma suspensão de células simples, vertendo os 2% + NCS HBSS contendo o baço e os nódulos linfáticos em uma peneira metálica colocada em uma placa de cultura de 60 x 15 mm. Suavemente triturar baço e nos nódulos linfáticos através do filtro de metal com o êmbolo de uma seringa de 10 ml em HBSS + a 2% NCS.
   8. Usando uma pipeta, mover a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 50 ml limpo. Lavar o filtro de metal e prato de cultura com um adicional de 10 ml de HBSS + 2% NCS, Lcantar uma pipeta, e colocar esta solução em 50 ml do mesmo tubo de centrífuga como a suspensão de células.
   9. Rodar as células a 600 xg durante 5 min para sedimentar as células e ressuspender em 10 ml de HBSS + 2% NCS por pipetagem suave. A menos que especificado de outra forma, todos centrifugação deve ser realizada a 600 xg durante 5 min.
   10. Diluir 10 uL da suspensão de células em 90 ul de 0,1% de azul de tripano em PBS por uma diluição de 1:10. Colocam-se 10 uL das células em azul de tripano num hemocitómetro pipetando a solução para dentro da ranhura na extremidade do hemocitómetro. Contar as células brancas do sangue na grade centro do hemocitômetro, ignorando eritrócitos que aparecem como um pouco menor, redondo, células vermelhas em tons e os / as células que morrem mortas azuis. Multiplicar o número de células contadas por 10 ^4, pelo factor de diluição (10), e por o volume das células (10 ml) para determinar o número total de células recolhidas no tubo de centrífuga de 50 ml.
   11. Para o enriquecimento em células T CD4 +, a centrifugarcélulas para sedimentar, e ressuspender as células em 2x10 ⁷ células / mL numa solução contendo cerca de 1 ug / mL de anti-CD8 (clone de 3.155), 1 ug / mL de anti-MHC Classe II (clone M5 / 114), e 1 ug / anticorpos ml anti-CD24 (clone J11d) em HBSS + 2% NCS com cuidado pipetando.
       NOTA: Os anticorpos utilizados neste passo são derivados internamente a partir de linhas celulares de hibridoma e as concentrações são aproximadas. A concentração eo volume destes anticorpos ideal para lise do complemento foram determinados empiricamente e irão variar entre laboratórios. Alternativamente, vários kits disponíveis comercialmente para a purificação de células T CD4 + naive e pode ser substituído para a lise do complemento e processo de purificação CD62L + representada aqui. Se estiver usando outro método para purificar as células CD4 T naive, este protocolo pode ser continuado a partir do passo 1.2.
   12. Incubar em gelo durante 30 min. No final desta incubação, descongelar rapidamente guiné complemento de porco, colocando num banho a 37 ° C de água bATH para cerca de 2 min. Adicionar 100 ul de complemento para cada 1 ml de células em solução de anticorpo por pipetagem do complemento directamente para a suspensão de células. Incubar as células em um banho de água a 37 ° C durante 30 min.
   13. Adicionar HBSS + 2% NCS para trazer as células para um volume total de 20 ml no tubo de centrifugação. Camada em 8 ml de RT meios de centrifugação de densidade (densidade 1,086 g / ml) por baixo das células. Imediatamente centrifugar as células a 1400 xg à temperatura ambiente durante 15 min, com o travão de centrífuga de fora.
   14. Coletar as células na interface usando um sorológicos células pipeta e transferir para um novo 50 ml tubo de centrífuga. Lavar as células, levando o volume no tubo de centrifugação de 50 ml com HBSS + NCS 2% e centrifugação.
   15. Ressuspender as células em tampão de MACS (PBS suplementado com 2% de NCS e EDTA 2 mM) por pipetagem suave e contam como anteriormente, no passo 1.1.10.
   16. Para o enriquecimento em células T CD4 + naive, ressuspender as células em 2x10 ⁷ células / mL em uma solução dede / mL de anticorpo anti-CD62L conjugado com biotina 2,5 ug em tampão MACS, com base no número contado no passo 1.1.16. Incubar durante 30 min em gelo.
   17. Lavam-se as células por adição de 10 ml de tampão de MACS, depois centrifugando as células. Ressuspender as células em 10 ⁷ células / 100 uL de tampão de MACS e adicionar grânulos de separação magnética conjugada com estreptavidina a uma diluição de 1:10 directamente para as células. Incubar em gelo durante 20 min.
   18. Lavam-se as células como anteriormente, no passo 1.1.17, e ressuspender as células em ⁸ 2x10 células / ml em tampão de MACS, em um volume mínimo de 500 ul.
   19. Colocar uma coluna de separação magnética no suporte do íman e lava-se a coluna, deixando 3 ml de tampão MACS fluir. Aplicar as células para a coluna com uma pipeta.
   20. Lava-se a coluna para remover as células não ligadas pela coluna magnética pipetando tampão 3 ml MACS na coluna e permitindo que o tampão MACS para fluir através de, e repetir 3 vezes. Elimine o escoamento fração.
   21. REMOVe a coluna do suporte magnético e mantenha sobre um novo 50 ml tubo de centrífuga. Pipetar 5 ml de tampão de MACS na coluna e usar o êmbolo fechado com o tampão da coluna para empurrar o MACS através da coluna para libertar as células ligadas da coluna e recolher o fluxo através do que contém as células T CD4 + naive enriquecido.
   22. Centrifugar as células e ressuspender em 10 ml de RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol (meio RPMI-10). Contar as células como anteriormente, no passo 1.1.10.
   23. Ajustar a concentração final das células T CD4 + naive a 6x10 ⁵ / ml em RPMI-10.
2. Purifica-se as APCs esplénicas com depleção de células T
   1. Euthanize um tipo selvagem ratinho BALB / c fêmea de 6-8 semanas de idade, como no passo 1.1.1.
   2. Pulverizar o rato com uma solução de etanol a 70% e expor o baço, fazendo uma incisão cerca de 3 cm sobre o lado esquerdo do abdome do raton. Cortar abrir a camada peritoneal e remover o baço, segurando-o delicadamente com uma pinça e corte-o para longe do tecido conectivo subjacente com uma tesoura cirúrgica.
   3. Colocar o baço em 8 ml de HBSS + NCS 2%.
   4. Prepara-se uma suspensão de células individuais por triturar o baço, lavar, e contar as células, como antes, em passos 1.1.7-1.1.10
   5. Depleção das células T por centrifugação das células a 600 xg durante 5 min para sedimentar, e voltar a suspender as células a 2x10 ⁷ em uma solução de cerca de 1 ug / mL de anticorpo anti-Thy1.2 (clone J1J) por pipetagem suave. Incubar as células em gelo durante 30 min.
      NOTA: Este anticorpo foi derivado em casa a partir de uma linha celular de hibridoma e a concentraton é aproximada. A concentração e volume deste anticorpo ideal para lise do complemento foi determinada empiricamente e irão variar entre laboratórios. Outros métodos para a purificação de APC a partir de esplenócitos pode ser substituído se desejado. células T naive e APCs devem ser preparados em cultoure do passo 1.3.
   6. Adicionar guiné complemento de porco, incubar e separar as células em um gradiente de centrifugação de densidade de meios como antes, em passos 1.1.13-1.1.14.
   7. Ressuspender as células em 10 ml de RPMI-10 e irradiam-se as APCs, colocando as células num tubo de centrífuga de 50 ml num irradiador gama para um período de tempo que vai expor as células a 25 Gy de radiação. Este período de tempo pode variar dependendo de o irradiador e terá de ser calculado de cada vez as células são irradiadas.
   8. Contar as células num hemocitómetro, como antes, no passo 1.1.10, e ajustar as células APC para uma concentração final de 2,4x10 ⁶ culas / ml em RPMI-10.
3. Estimular as células e diferenciação de células T CD4 para um fenotipo Th1 em uma cultura de 5 dias.
   NOTA: Apesar de que aqui apresentamos um protocolo para a preparação e imagem efetores Th1 gerados a partir de células CD4 T naive, este protocolo pode ser ajustado para diferenciar as células virgens de um fenótipo diferente, ou tO uso de outros tipos de células, tais como células T CD8. Condições para a primeira imunização e diferenciação terão de ser determinados empiricamente.
   1. Em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços, 500 ul de combinar as células T CD4 + naive e 500 ul das APCs irradiados em cada cavidade, para um total de 3x10 ⁵ células T e 1,2x10 ⁶ APCs por poço.
   2. Prepara-se uma solução em RPMI-10 contendo 2 uM de péptido cognato OVA, 20 U / ml de recombinante IL-2, 80 ug / ml de anti-IL-4 (clone 11B11) e 40 ng / ml de IL-12 recombinante e o filtro usando um 0,2 filtro de seringa uM. Adicionar 1 ml desta solução a cada poço de células, para um volume total de 2 ml em cada poço.
   3. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 3 dias.
   4. No dia 3, dividir as culturas por suavemente pipetando para ressuspender as células e movendo-se 1 ml de cada poço para um poço de cultura novo. Traga a cada poço num volume final de 2 ml por adição de 1 ml / poço de meio RPMI-10 + 20 U / ml de recombinante IL-2. </ Li>
   5. Retornar as placas ao incubador e permitir que as células se expanda até ao dia 5.

2. Transferência de células e indução da inflamação

NOTA: Para obter números de células óptimas para a criação de imagens, 5x10 ⁶ células Th1 fluorescentemente marcadas devem ser transferidos para cada rato num volume total de 200 ul de PBS. As células aqui são marcadas com o corante verde CFSE ou o corante perto CMTMR-vermelho, embora outros corantes de rastreador de célula pode ser usado. CFSE e células CMTMR-marcados podem ser co-transferido para permitir o rastreamento de duas populações efectoras CD4 distinta.

1. Etiqueta de células T efectoras com CFSE
   1. Colheita das células a partir das placas de cultura por pipetagem vigorosa das células em cada poço e transferir para um tubo de centrífuga estéril de 50 ml com uma pipeta. Contar as células como no passo 1.1.10, centrifugar e ressuspender as células em 10 ⁷ células / ml em PBS + 5% de NCS.
   2. Diluir mM solução 5 estoque CFSE 1: 100 emPBS. Adicionar 110 ul de solução CFSE por cada 1 mL de células por colocação de uma gota de solução de CFSE no lado do tubo e, em seguida, rapidamente o tubo de balanço para trás e para homogeneizar.
   3. Incubam-se as células durante 5 min à temperatura ambiente, em seguida extinguir a CFSE por adição de 5 ml de soro fetal de vitelo (FCS) directamente para o tubo de células. Levar o volume a 50 ml com PBS + 5% de NCS.
   4. Centrifugar as células e ressuspender o sedimento em 20 ml de PBS + 5% de NCS. Repita esse processo mais duas vezes para lavar as células 3 vezes no total. Contar as células num hemocitómetro, como antes, no passo 1.1.10, e ressuspender as células em PBS estéril a 2,5 x 10 ⁷ células / ml para transferência para ratinhos.
2. Etiqueta de células T efectoras com CMTMR
   1. Colher as células como acima no passo 2.1.1, em seguida, contar, de centrifugação e ressuspender as células em 10 ⁷ células / ml em RPMI-10.
   2. Adiciona-se 10 mM de solução stock de CMTMR directamente para as células para uma concentração final de 10 uM. th rapidamente pipetacélulas e para misturar completamente no CMTMR e evitar a precipitação do corante.
   3. Incubar 30 min num banho de água a 37 ° C. Lavar as células 3x em PBS + 5% de NCS, como antes, no passo 2.1.3-2.1.4. Contagem e ressuspender as células em PBS estéril a ⁷ 2,5x10 células / ml para a transferência para os ratos.
3. células T efectoras de transferência para ingénuo de 6-8 semanas de idade do sexo feminino BALB / c.
   1. Desenhe a suspensão de células (passo 2.1.4 ou 2.2.3) para uma seringa, tendo o cuidado de remover todas as bolhas, segurando a seringa da agulha lateral-up, gentilmente passando rapidamente do lado da seringa e movendo o êmbolo para cima e para baixo, se necessário .
   2. Coloque os ratos em uma gaiola limpa e calor suavemente sob uma lâmpada de calor até que a veia da cauda aparece vasodilatado. Posicione o mouse em um dispositivo de retenção e limpe a cauda com um algodão embebido em álcool. Lentamente injectar 200 ul da suspensão de células para dentro da veia lateral da cauda. Não deve haver resistência à injecção ou borbulhamento visível sob a pele.
4. Induzir a inflamação dérmica através da imunização com Adjuvante Completo de Freund (CFA)
   NOTA: Neste protocolo, a inflamação é induzida pela injeção intradérmica de CFA emulsionado com o antígeno seja cognato ou não-aparentado. Outros modelos inflamatórios pode ser substituído, embora o número de células necessárias para a transferência e a temporização de imagem terá de ser ajustado empiricamente.
   1. Prepara-se uma solução 200 uM de péptido OVA em PBS estéril num tubo de microcentrífuga. Pipetar um volume equivalente de CFA no topo da solução de péptido.
   2. Emulsionar a solução, chamando-o para uma seringa / 2 insulina 28 G1 e, em seguida, mergulhando a solução para dentro do tubo de microcentrífuga, em seguida, repetir esta ação cerca de 20 vezes. Quando totalmente emulsionado, o CFA e solução de peptídeo irá formar uma mistura grossa e opaca.
      NOTA: é essencial usar uma seringa de insulina com agulha fixo para formar a emulsão, como a emulsão vai ser perdida no espaço morto em um needl não fixae seringa.
   3. Teste a emulsão pela queda de uma pequena quantidade para água colocada numa placa de petri. A emulsão deve permanecer intacto e não se dispersam na água.
   4. Desenhe a emulsão para uma seringa G1 / 2 insulina 300 ul 28 e pressione bruscamente o êmbolo para remover grandes bolhas de ar.
   5. Imediatamente após a transferência de células T marcado fluorescentemente efectoras, anestesiar os ratos por injecção IP de 2,2,2-tribromoetanol a 240 mg / kg. Avaliar anestesia com uma pitada toe suave, administração de mais 2,2,2-tribromoethanol em incrementos de 1 mg, se necessário.
      NOTA: outros anestésicos aprovados pode ser substituído para o 2,2,2-tribromoethanol.
   6. Coloque um dedal no dedo indicador da mão esquerda e cuidadosamente agarrar a orelha do rato entre o polegar esquerdo e o dedo indicador com a orelha ventral para cima. Certifique-se de que não exerça pressão excessiva sobre a orelha, o que pode causar danos mecânicos à pele.
   7. Deslize a agulha contendo a CFA emulsion na derme, o lado bisel voltado para cima, e injectar lentamente 10 ml de emulsão para dentro do ouvido. Colocação da injecção deve estar no exterior 1/3 do pavilhão auricular, ligeiramente fora do centro para permitir a imagiologia óptima.
   8. Monitorar ratos até que o efeito da anestesia e os ratos são capazes de endireitar-se e são ambulatorial. camundongos imagem 3 dias após a imunização, dando tempo para a inflamação se desenvolver e as células T transferidas para o tráfego para a derme da orelha.
      NOTA: Os ratos não podem ser deixados sozinhos em qualquer momento enquanto sob anestesia.

3. Preparar o mouse for Imaging

1. Preparar um cateter
   1. Remova cuidadosamente a agulha de metal a partir de um / 2 tuberculina (TB) agulha de seringa 30 G1 com um alicate e limpe o excesso de cola, usando um escopo de dissecação para visualizar que a cola é completamente removido.
   2. Corte a ponta fora de uma outra agulha de seringa / 2 TB 30 G1, garantindo que a agulha restante é ainda patent por inspeção visual. Deslizamento uma peça de 18 cm de PE-10 tubagem médica para a agulha aparado, e colocar cuidadosamente a agulha de metal nua aproximadamente 5 mm para a outra extremidade do tubo, criando um cateter.
2. Lave o cateter através do preenchimento de uma seringa de 1 ml TB com PBS estéril, removendo quaisquer bolhas de ar. Suavemente colocar o cateter na ponta da seringa e empurrar suavemente PBS que o cateter para remover quaisquer bolhas no tubo.
   NOTA: quando empurrando o fluido através do cateter, é essencial para manter o cateter na seringa para evitar que a pressão do fluido que empurra o cateter de fora da seringa.
3. Coloque os ratos em uma gaiola limpa e calor suavemente sob uma lâmpada de calor até que a veia da cauda aparece vasodilatado. Anestesiar o rato com uma mistura de ar ambiente e o isoflurano (indução 5% e manutenção de 1-2%, a 2 L / min velocidade de fluxo), fornecido através do conjunto de nariz cónico que foi ligado ao vaporizador de isoflurano. Certifique-se de que o rato é anestesiado with uma pitada toe suave. Incrementalmente aumentar a taxa de fluxo de isoflurano de 0,1% se o movimento é observado. Cobrir os olhos com pomada oftálmica para evitar a secagem e lesão, enquanto o rato é anestesiado.
   NOTA: É essencial que os ratos nunca será deixado sem vigilância enquanto anestesiado. Ratos deve ser frequentemente monitorados para anestesia suficientes por pitada toe suave.
4. Imobilizar a cauda na base com um par de fórceps, e depois limpe a cauda com um algodão embebido em álcool. Deslize cuidadosamente o cateter na veia lateral da cauda e verificar a permeabilidade através empurrando suavemente o êmbolo da seringa. Não deve haver nenhuma resistência ao movimento e não borbulhamento visível de PBS sob a pele se for colocado de forma adequada. Apor o cateter à cauda através da aplicação de 1-2 gotas de adesivo de cianoacrilato para o tecido no local de injecção e deixar secar, cerca de 30 seg.
5. Cuidadosamente cortar o cabelo da parte de trás e nas laterais da orelha com um par de tesouras, tomando cuidado para não danificar o skno. Apare os bigodes bem. Com um cotonete de algodão, humedecer a superfície interior da orelha com PBS.
6. Gire o mouse e ouvido em um 24 x 50 mm deslizamento No. 1,5 tampa de vidro. Utilizando uma pinça, gentilmente achatar a orelha para a lamela, movendo o mouse se necessário para garantir que o ouvido fique nivelada com o vidro. Retire o excesso de PBS a partir da orelha borrando suavemente com um lenço de papel.
   NOTA: Certifique-se de não pressionar muito firmemente na orelha, como a pele fina pode ser facilmente danificados com a pressão excessiva.
7. Usando dois pares de pinças curvas, segure um de aproximadamente 20 mm de comprimento pedaço de fita de tecido longitudinalmente nos cantos superiores. Coloque a parte inferior da fita sobre a lamela na parte superior da orelha do rato e enrolar a fita ao longo do resto da orelha, que empurra o excesso de pêlo para fora do caminho com a pinça, se necessário, para fixar a orelha contra a lamela. Pressione suavemente na fita em torno da orelha com um cotonete seco para assegurar uma boa vedação, tomando cuidado para não pressionar no próprio ouvido.
8. Fixe a plataforma de imagem a uma temperatura de 37 ° C bloco de aquecimento com fita adesiva. Aplicar graxa de vácuo em cada lado da área da orelha da plataforma de imagem. Rodar o rato para colocar as lamelas sobre a plataforma de imagem, tendo o cuidado de alinhar a orelha no centro do feltro.
   NOTA: Evite ficar graxa de vácuo na fita, pois isso fará com que ele vem separado da lamela de vidro.
9. Encaixe o cone do nariz isoflurano no suporte na plataforma de imagem, garantindo que o cone do nariz é seguro e cobrindo completamente o nariz do mouse. Espalhe a graxa de vácuo sob a lamela com firmeza, mas com cuidado pressionando a lamela para a plataforma de imagem com um cotonete de algodão limpo e seco.
10. Apor a lamela para a plataforma com dois 20 milímetros pedaços de fita adesiva e dois mais pedaços de fita adesiva à volta da porção superior da plataforma. Se as bolhas de ar estão presentes entre a orelha e a lamela, que pode ser cuidadosamente removida por prensagem sobre a orelha de baixo with um pedaço de papel dobrado.
    NOTA: É essencial para não usar papel muito grosso ou para pressionar firmemente, pois isso pode causar tecido branqueamento e danos, o que complica resultados.
11. Mova o rato para o palco microscópio e proteger a plataforma com fita adesiva. Tubo de uma dupla camada de graxa de vácuo para a lamela ao redor da orelha para servir como um reservatório para a objectiva de imersão em água.
12. Enrole um cobertor térmico cheio de água ao redor do mouse através da plataforma de imagem. Encha o reservatório com 37 ° C de água destilada. Assegure-se que tudo o que é presa à fase com fita adesiva e que a seringa do cateter é facilmente acessível.

4. In vivo de imagens Time-lapse e Administração Intravenosa Antibody

NOTA: Este protocolo requer o uso de um microscópio equipado com um multifotônica Ti: Sa sistema de laser. O objectivo é usada uma lente de 25x com 1,05 NA, com um objecto afixadaaquecedor ive ajustado para 40 ° C. A temperatura óptima para este aquecedor foi determinada empiricamente como sendo a temperatura adequada para manter a derme da orelha, a 37 ° C, e pode necessitar de ser ajustada para uso em outros sistemas de imagens. O software de aquisição utilizado pode variar entre os instrumentos e ajustamentos ao Protocolo pode ter que ser feito para trabalhar em sistemas de forma diferente configurados. Certifique-se de que as imagens podem ser salvas em um formato que é compatível com qualquer software de análise desejada.

1. Localizar a derme através das oculares, posicionando o objectivo ao longo do centro da orelha e reduzir o objectivo apenas até que contacta com a superfície da água no reservatório. Usando uma fonte de luz externa, olhar através das oculares e continuar a baixar lentamente o objectivo até que a superfície da orelha entra em foco. Abaixe as cortinas internas e externas ao redor do palco microscópio.
2. Determinar as configurações de microscópio e localize uma área para imagens
   1. antes imaging, configurar o laser para excitação máxima e detecção dos fluoróforos desejadas ajustando o comprimento de onda do laser a 900 nm na janela do MP Laser Controller, a potência do laser no Cenário de Aquisição: Indicador de Laser e as voltagens PMT na janela Controle de Aquisição de Imagem .
      NOTA: Este procedimento usa um comprimento de onda de excitação de 900 nm com filtros para detectar geração de segundo harmônico (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), e CMTMR (575-630 nm). Outras configurações podem ser usadas para detectar diferentes fluoróforos como desejado.
   2. Defina o microscópio para 512 x 512 pixels de resolução, com um tempo de permanência de 2 ms / pixel no Cenário de Aquisição: Tamanho e modo Windows. Ativar um modo de imagens ao vivo para permitir a digitalização através do tecido para uma área para a imagem, clicando em "repeat XY". Idealmente, a área deve ser relativamente uniforme, sem bolhas de ar, e evitando áreas de folículos pilosos densas.
      NOTA: A emulsão CFA é autofluorescente brilhantemente no verde e necanais AR-vermelho e deve ser evitado. Um campo óptima pode ser encontrado a cerca de 3 mm a partir da borda da emulsão. Aproximadamente 10 - 100 células podem ser rastreados em uma única imagem. Se muitas células estão presentes, software de monitoramento geralmente irá encontrar erros na tentativa de separar as células em locais próximos, levando a faixas de células encurtados e / ou imprecisas.
   3. Uma vez que um campo de imagem apropriada tenha sido localizado, determinam a região de Z que irá ser trabalhada pela localização da célula "mais alto" na derme, definindo o Z-position para 0, clicando no botão "Set 0", e rolagem para baixo na Z direcção para medir a extensão da profundidade da célula. Uma profundidade de imagem de 35-75 mm é típico. Definir as posições iniciais e finais na definição da Aquisição: Janela Microscópio. Ajuste o instrumento voltagens PMT e potência do laser na janela "brilhante Z" para otimizar a visualização das células ao longo da profundidade do campo de imagem.
      NOTA: Evite levantar a laspoder er acima de 25 mW na amostra, níveis de potência tão elevadas pode causar danos causados ​​pelo calor e ferimentos estéril para a derme. O nível de potência máxima adequada para cada microscópio variará e terá de ser medido. Note-se que o aumento da potência do laser ou voltagens PMT com profundidade de tecido não permite a comparação quantitativa de brilho da imagem em diferentes profundidades em análise pós-aquisição.
   4. Verifique a "profundidade" e os botões "Time" abaixo do botão "Scan" na janela de Controle de Aquisição de Imagens. Definir um filtro de Kalman para digitalizar a imagem 3 vezes por linha na Aquisição de Imagem de controle: a janela Modo de filtro e ajustar a profundidade-slice Z na Aquisição Image: Indicador microscópio para que ele leva cerca de 1 min para capturar uma pilha completa, como observado na janela TimeView.
      NOTA: O intervalo entre as pilhas não deve demorar mais do que cerca de 1 min, como intervalos mais longos evitar o rastreamento de células rapidamente migrando. Dependendo the tipo de células que está sendo trabalhada, este intervalo pode necessitar de ser ajustado para permitir o acompanhamento celular adequada por software de análise. Z-fatias devem ser não mais do que 5 um. Geralmente 15-18 Z-fatias entre 2-5 mm de espessura são apropriados para um intervalo de imagem 1 min.
3. Capturar uma imagem de lapso de tempo pré-anticorpo
   1. Capturar uma imagem time-lapse 5 min da área para avaliar a estabilidade do tecido, definindo o número de repetições de "5" na definição de Aquisição: janela TimeScan e clicando no botão "Scan".
      NOTA: Tissue "deriva" pode ser causada por não permitir tempo suficiente para a orelha deve atingir o equilíbrio térmico, preparação orelha pobres, ou pode ser devido à deriva local em uma região da orelha. Se a imagem 5 min não é estável, uma nova imagem de região na derme. Se uma segunda imagem em uma nova região permanece instável, é melhor repetir cuidadosamente a preparação da orelha e de imagem a partir do passo 3.6 com um cov frescoerslip.
   2. Se o tecido é estável na imagem 5 min, recolher imagem de lapso de tempo de 30-45 min, definindo o número de repetições para entre 30 e 45 no Ambiente de Aquisição: janela TimeScan, o monitoramento para qualquer desvio tecido menor como a imagem é coletado. Salve o arquivo em um formato que é compatível com o software de análise a ser utilizado.
      NOTA: Neste ponto no protocolo, as etapas 4.2.2 - 4.3.2 pode ser repetido para a imagem vários locais na mesma orelha. Um único ratinho não devem ser mantidos anestesiados por mais de 4 horas, como a morte é mais provável de ocorrer.
4. Injetar anticorpos bloqueadores e capturar uma imagem pós-anticorpo.
   1. Desenhe a mistura de anticorpos em uma seringa de 1 ml TB e remover a agulha, certificando-se de remover todas as bolhas de ar. Pressione o êmbolo de modo a que a solução anticorpo forma uma "gota" no final da seringa.
   2. Levantar as cortinas de todo o palco e localizar o cateter. Remover o original PBS-Containing seringa a partir do cateter. Sem definir o cateter para baixo, coloque cuidadosamente a nova seringa contendo os anticorpos. Segurar a extremidade do cateter na seringa e injectar lentamente a mistura de anticorpo para dentro do cateter. Certifique-se de que não há resistência à injecção.
   3. Definir o cateter para baixo e abaixar as cortinas em torno do palco microscópio. Registar o tempo de injecção e imediatamente começar a recolha de uma nova sequência de imagens 20-40 min no mesmo local usando as mesmas definições instrumento como a imagem pré-anticorpo. Salve o arquivo em um formato apropriado para o software de análise a ser utilizado.
      NOTA: Entre imagens de lapso de tempo, observar o mouse para anestesia e respiração suficiente. Não é recomendado para a imagem mais de um campo após a administração de anticorpos, como pode haver taxas variáveis ​​de depuração do anticorpo.
5. Injectar dextrano fluorescente marcado para localizar os vasos sanguíneos, avaliar cateter permeabilidade, e medir ba permeabilidade dos vasos lood
   1. Preparar uma solução / ml 2 mg de dextrano fluorescente conjugada (70.000 MW) em 100 ul de PBS estéril e desenhar em uma seringa, remover quaisquer bolhas de ar.
   2. Usando a mesma técnica como no passo 4.4.1-4.4.2, colocar a seringa sobre o cateter e injectar a solução de dextrano por via intravenosa.
   3. Capturar uma única pilha em 1024 x 1024 pixels de resolução alterando a resolução na definição da Aquisição: Janela Mode, com as mesmas configurações PMT e laser como para as imagens de lapso de tempo. Para recolher a imagem, desmarque o botão "Time" abaixo do botão "Scan" e clicando no botão "Scan". Esta imagem 3D irá permitir que as células T de exclusão localizados na vasculatura e mostram que o cateter era patente e inserido correctamente. A difusão de dextrano fluorescente para fora dos vasos podem também ser utilizados para avaliar a permeabilidade vascular local.
      NOTA: Esta alta resolução (1024 x 1024) imagem estática é usado para prfins esentation e pode ser, adicionalmente, ser utilizado para a análise da arquitetura do tecido na mesma área que as imagens de lapso de tempo. Alternativamente, uma imagem de 512 x 512 podem ser tomadas, que podem ser mescladas com as imagens de lapso de tempo usando o software de análise de imagem. Tempo de imagem lapso de dextrano a administração pode também ser desejado, dependendo das necessidades individuais de laboratórios de investigação. Neste caso, a imagem deve ser configurado como nos passos 4.2.3-4.3.2.
6. Depois de imagem estiver concluída, remova cuidadosamente o mouse do âmbito do objectivo e desembrulhar o cobertor água. Retirar as lamelas da plataforma de imagem, cortando a fita de levantamento e suavemente o vidro até que ele se solte. Enquanto o mouse ainda está anestesiado, retire a orelha da lamela. Se isso é ser um procedimento terminal, eutanásia o mouse por deslocamento cervical. Se salvar este rato para geração de imagens repetidas, devolvê-lo a uma gaiola limpa separado de outros ratos e observar até que o mouse pode endireitar-se e éambulatorial. Uma vez recuperado da anestesia, o rato pode ser retornado para uma gaiola com outros animais.
7. Importe os arquivos de imagem em um programa de análise de imagem e realizar as correções desejadas. Prevenção de melhorias não-lineares e programas de redução de alisamento ou ruído automatizados e algoritmos é recomendado. Normalmente, as imagens só precisa de um menor fundo de correção, aumentando manualmente o ponto preto da imagem antes da análise. Analisar os dados de imagem usando um programa de rastreamento de células automatizado com correção manual, como na Overstreet, Gaylo et al ^30.
   NOTA: Há muitas suites de análise de imagem disponíveis, tanto proprietárias e de código aberto, que podem ser usados ​​para quantificar a dinâmica de células a partir das imagens multifotônica derivados deste protocolo. O método exacto de análise de imagem e os pacotes de software ideais para ser utilizado vai depender das necessidades individuais de laboratórios de investigação.

A capacidade para estudar as respostas imunes in situ, sem alterar o ambiente imunológico é essencial para estudar as interacções em tempo real das células T efectoras com um tecido inflamado. Imagem da derme da orelha intactas por este protocolo, apresentadas na Figura 1A e B, permite a visualização de células T efetoras fluorescente etiquetado transferidos no interstício dérmica. Isto permite tanto de alta resolução (Figura 1C) e lapso de tempo (Figura 1D, Filme 1) imagens de dinâmica de células T efetoras na derme inflamadas.

Figura 1. alta resolução e 4D imagiologia de células T efetoras no interstício dérmica intacta. (A) esboço Experimental. (B) Fotografia de uma prepar orelhaEd para a imagiologia com o local da emulsão (linha tracejada preta) e a área óptima para imagiologia (linha vermelha) indicado. Projeção (C) Maximal 3D de uma pilha de alta resolução mostrando CFSE marcado Th1 células (verde), segundo sinal harmónico de colágeno fibrilar (azul) e Texas Red-Dextran marcado vasculatura (vermelho). A seta branca indica um de vários folículos pilosos autofluorescentes. Barras de escala representam 50 mm (D) caminhos migratórios de células Th1 rastreados por 30 minutos na derme CFA-inflamados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo de imagem requer a utilização de uma plataforma de imagem especializado que foi construído em casa, bem como um nariz cónico adaptado para a administração de anestesia inalado enquanto imagiologia. A plataforma de imagem (Figura 2A-B) consiste óf uma placa de base de alumínio com uma secção central elevada. Esta seção levantada tem uma porção de inserção alinhada com acrílico sentiu para fornecer suporte para o ouvido sem comprimir e potencialmente danificar o tecido fino. A geometria da nossa configuração necessária a construção de um cone de protecção flexível e ajustável para proporcionar anestesia inalado durante o exame. Este cone de protecção, constituído por um tubo de microcentrífuga modificada ligada a uma secção 50 milímetros de tubo flexível (Figura 2C), está fixada no seu lugar com um suporte composto por tubos de microcentrífuga modificados (Figura 2D) e afixada à plataforma de imagem através de gancho e velcro . O uso de gancho e laço para fecho permite o reposicionamento do conjunto do cone do nariz de modo a que qualquer um dos ouvidos de um rato pode ser trabalhada, e podem ser optimamente posicionados para ratinhos individuais.

Figura 2. Equipamentos para imagiologia intravital. plataforma de imagem embutido personalizada no topo (A) e vista lateral (B). Nosecone para administração de isoflurano (C) e titular nosecone (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cateterização da veia da cauda permite um acesso contínuo à prática para administrar os anticorpos e outras moléculas pequenas que podem difundir para fora da vasculatura, ou moléculas fluorescentes maiores, tais como dextrano elevado peso molecular para identificar vasos sanguíneos. Após a administração de 100 ug de anti-β 1 e anti-integrina β três anticorpos bloqueadores através do cateter, prisão células previamente motilidade no interior da derme (Filme 2). Estas células têm uma velocidade média diminuiu após anticorpo administração (Figura 3A), bem como uma diminuição do índice de meandros, a relação entre o deslocamento total para o comprimento total da faixa (Figura 3B).

Figura 3. A administração de anti-β 1 e anti-β 3 anticorpos Th1 inibe a migração de células na pele inflamada-CFA. (A) Velocidade média de células Th1 antes e após a administração de 100 ug de anti-β 1 e anti-β 3 integrina anticorpos bloqueadores. (B) índice de Meandering de células Th1, antes e após o bloqueio de anticorpos. Cerca de 100 células rastreadas são a partir de imagens antes e após o bloqueio de anticorpos a partir de um único rato em uma experiência representativa. Estatísticas de Mann Whitney.es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Porque o cabelo não é removido da superfície da orelha, os artefactos de imagem do cabelo são comuns. A autofluorescência de folículos pilosos (Figura 4A) e sombreamento e autofluorescência de cabelo sobrejacente (Figura 4B) deve ser evitada sempre que possível, uma vez que podem obscurecer as células T e interferir com o software de análise de imagem automatizado. Do mesmo modo, as bolhas de ar aprisionadas entre a superfície da orelha e a lamela pode levar a artefactos de imagiologia (Figura 4C). A preparação adequada da orelha deve minimizar o número eo tamanho de todas as bolhas restantes.

Figura 4. Artefatos comuns de autofluorescência de cabelo e pobres pré orelhaparação. folículos pilosos (A) autofluorescente. (B) O cabelo autofluorescente e folículos pilosos (verde) e colágeno (branco) com sombras de cabelo sobrepostas, causando linhas escuras na imagem. (C) Artefato de uma bolha de ar, mostrando a borda dos deslocados, autofluorescentes epiderme queratinizadas (linha pontilhada). Barras de escala representam 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, a utilização de múltiplas fontes de calor pode conduzir a problemas com a estabilidade do tecido, devido à expansão e contracção térmicas. Configurações do termostato incorretos, por exemplo, pode levar a grandes oscilações durante o exame que pode tornar a interpretação dos resultados difíceis (Filme 3). É essencial para determinar as configurações ideais para qualquer sistema que fornece uma temperatura constante e maximiza a estabilidade. UltimatEly, uma câmara de imagem de temperatura controlada é a melhor maneira de remover a variabilidade de mudanças na temperatura.

Filme 1. células Th1 que migram na derme CFA-inflamadas (clique com o botão direito para baixar). Image 30 min time-lapse que mostra células Th1 (verde) que migram na rede de colágeno da derme (segunda geração harmônica, azul).

Filme 2. Th1 células prisão mediante o bloqueio de β 1 e b 3 integrinas (Botão direito do mouse para baixar). As células (verde) foram fotografadas durante 30 min antes da administração de anticorpos de bloqueio, e em seguida trabalhada durante mais 20 min no mesmo local.

Filme 3. Oscilações de uma placa de aquecimento mal controlada (clique com o botão direito para baixar). Imagem de lapso de tempo de 30 min de Th1 células (verde) e geração de segundo harmônico (azul). Após esta imagem foi recolhida, a placa de aquecimento utilizado foi encontrada para ter um termostato com defeito, causando oscilações na temperatura da plataforma de imagem e subsequente expansão e contracção térmica.

Os autores não têm nada a revelar.