Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.
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Artigo de método
Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade das células T CD4 para realizar as funções efectoras é dependente da migração rápida e eficiente destas células em tecidos periféricos inflamado por meio de um mecanismo como-ainda indefinida. A aplicação de microscopia multifotônica para o estudo do sistema imunitário proporciona uma ferramenta para medir a dinâmica das respostas imunitárias em tecidos intactos. Aqui apresentamos um protocolo para a não-invasivo imagiologia multiphoton intravital de células T CD4 na derme orelha de rato inflamadas. Utilização de uma plataforma de imagem personalizada e um cateter venoso permite a visualização dinâmica de células T CD4 + no interstício dérmica, com a capacidade para interrogar estas células em tempo real através da adição de anticorpos bloqueadores de componentes moleculares principais envolvidos na motilidade. Este sistema proporciona vantagens em relação a ambos os modelos in vitro e procedimentos de imagem cirurgicamente invasivos. Compreender os caminhos usados pelas células T CD4 para a mobilidade pode vir a fornecer informações sobre os basic função de células T CD4, assim como a patogénese de ambas as doenças auto-imunes e patologia de infecções crónicas.
Introdução
A função efetora das células T CD4 é criticamente dependente de sua capacidade de entrar e atravessar rapidamente uma ampla variedade de tecidos periféricos para pesquisar danos, localizar focos de infecção ou causar patologia por infecção crônica ou autoimunidade. Embora os processos de homing para locais inflamados1-4 e extravasamento5-7 da vasculatura para os tecidos tenham sido bem caracterizados, os fatores que impulsionam e regulam a motilidade intersticial das células T permanecem indefinidos. A migração de células T em ambientes 3D complexos tem sido estudada in vitro através do uso de matrizes artificiais8-10 ou disp....
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Rochester, e realizado em estrita conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e da Política do Serviço de Saúde Pública sobre a Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório administrada pelo National Institutes de Saúde, Gabinete de Laboratório animal Welfare.
1. Preparação de células efectoras T CD4
NOTA: TCR-transgénicos ratinhos DO11.10 BALB / c que reconhecem especificamente um péptido de ovalbumina de ovo de galinha (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Outros sistemas de TCR-transgénicos pode....
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Resultados
A capacidade para estudar as respostas imunes in situ, sem alterar o ambiente imunológico é essencial para estudar as interacções em tempo real das células T efectoras com um tecido inflamado. Imagem da derme da orelha intactas por este protocolo, apresentadas na Figura 1A e B, permite a visualização de células T efetoras fluorescente etiquetado transferidos no interstício dérmica. Isto permite tanto de alta resolução (Figura 1C)
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Discussão
Significado
Aqui apresentamos um protocolo completo para a visualização 4D, efetoras antígeno-específica células Th1 transferidos na derme orelha de rato intactas. Este método oferece vantagens em relação a algumas modalidades de imagem corrente para várias razões. Pela imagem da derme da orelha ventral, somos capazes de renunciar a depilação que é necessário para protocolos de imagem envolvendo outros locais da pele. Embora depilatórios são geralmente leves, que foram mostrados par.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Universidade de Rochester instalação Multiphoton Microscópio Núcleo de ajuda com imagens ao vivo. Financiado pelo NIH AI072690 e AI02851 para DJF; AI114036 para AG e AI089079 para MGO.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos BALB/c | Jackson Laboratories | 000651 | Os camundongos usados foram criados internamente |
| Camundongos DO11.10 | Jackson Laboratories | 003303 | Os camundongos usados foram criados internamente |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Soro |
| bezerro recém-nascido equivalente múltiplo (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Inativado por calor a 56 &graus; C por 30 minutos |
| Complemento de Cobaia | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 anticorpo | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Anticorpos derivados de este hibridoma |
| anti-MHC Classe II anticorpo | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Anticorpos derivados de este hibridoma |
| anti-CD24 anticorpo | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Anticorpos derivados de este hibridoma |
| anticorpo anti-Thy1.2 | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Anticorpos derivados de este hibridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Múltiplo Equivalente |
| EDTA | 15323591 | ||
| anticorpo anti-CD62L biotinilado (clone MEL-14) | BD | ||
| grânulos de separação magnética de estreptavidina | Miltenyi | 130-048-101 | |
| Coluna de Separação MACS LS | Miltenyi | 130-042-401 | |
| IL-2 humano recombinante | Peprotech | 200-02 | |
| camundongo recombinante IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| camundongo recombinante IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anticorpo anti-IFNg (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anticorpo anti-IL-4 (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamina | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoetanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| peptídeo ovalbumina | Biopeptídeo | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptídeo | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Inativado por calor a 56 &graus; C por 30 minutos |
| Placa de cultura de 24 poços | LPS | 3526 | Equivalente Múltiplo |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 seringas de insulina G1/2, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 seringas de insulina G1/2, 300μ l | BD | 309301 | |
| 27 seringas G1 / 2 TB, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 agulhas G1 / 2 | BD | 305106 | |
| PE-10 Adesivo | de | 427400 | |
| (Vetbond) | Placa de aquecimento 3M | 1469SB | |
| WPI | 61830 | ||
| Controlador de placa de aquecimento | WPI | ATC-2000 | |
| Gaymar | TP500 | Não está mais em produção, cobertor de água disponível equivalente mais recente | |
| Kent Scientific | TP3E | ||
| Vaporizador de isoflurano | LEI Medical | Isotec 4 | Não está mais em produção, isoflurano disponível equivalente mais recente |
| Henry Schein | Encomendado através do Veterinário tubos | ||
| de microcentrífuga | VWR | 20170-038 | Fita médica equivalente múltipla |
| Cone | |||
| Construído internamente, ver Fig 2 | |||
| Roboz | RS-6802 | Múltiplas | |
| lamínulas de vidro equivalentes | VWR | ||
| Graxa de alto vácuo de alta equivalência | Cotonetes Fisher | 146355D | |
| Toalhetes delicados | de | ||
| múltiplas equivalências | Microscópio vertical Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM com Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | chamada para cotação | |
| mesa óptica com controle de vibração | Newport | chamada para cotação | |
| 25x NA 1.05 objetiva de imersão em água para imagem multifotônica | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| aquecedor de objetiva | Bioptechs | PN 150815 | |
| cubo de filtro de detecção | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Cubo proprietário, pode ser aproximado a partir de filtros individuais/dicroicos |
| anti-integrina β 1 anticorpo (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Livre de azida, baixa endotoxina |
| anti-integrina β 3 (clone 2C9. G3) | eBioscience | 16-0611-82 | azida e com baixo teor de endotoxina |
| (70.000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
Referências
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
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Reimpressões e permissões
