NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

Rafael D. Melani; Henrique S. Seckler; Owen S. Skinner; Luis H. F. Do Vale; Adam D. Catherman; Pierre C. Havugimana; Marcelo Valle de Sousa; Gilberto B. Domont; Neil L. Kelleher; Philip D. Compton

doi:10.3791/53597

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Artigo de método

NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

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DOI:

10.3791/53597

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29 de fevereiro de 2016

Rafael D. Melani^*¹^,² , Henrique S. Seckler^*¹ , Owen S. Skinner¹ , Luis H. F. Do Vale¹^,³ , Adam D. Catherman¹ , Pierre C. Havugimana¹ , Marcelo Valle de Sousa³ , Gilberto B. Domont² , Neil L. Kelleher¹ , Philip D. Compton¹

¹Departments of Chemistry and Molecular Biosciences, Chemistry of Life Processes Institute, Proteomics Center of Excellence, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University, ²Institute of Chemistry, Proteomics Unit, Federal University of Rio de Janeiro, ³Department of Cell Biology, Brazilian Center for Protein Research, Laboratory of Biochemistry and Protein Chemistry, University of Brasilia

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como preparar e realizar eletroforese de aprisionamento de fração líquida eluída nativa clara (CN-GELFrEE), uma técnica de separação nativa para conjuntos biomoleculares não covalentes e proteínas de amostras heterogêneas que é compatível com várias técnicas de análise de proteínas a jusante.

Resumo

complexos de proteína executar uma variedade de funções celulares cruciais. Elucidando suas interações e dinâmica não-covalentes é fundamental para a compreensão do papel dos complexos em sistemas biológicos. Embora a caracterização direta de conjuntos biomoleculares tornou-se cada vez mais importante nos últimos anos, técnicas de fraccionamento nativas que são compatíveis com técnicas de análise a jusante, incluindo espectrometria de massa, são necessárias para expandir ainda mais esses estudos. No entanto, o campo não tem um alto rendimento, ampla gama de alta recuperação método de separação para os conjuntos de proteínas nativas. Aqui, apresentamos clara fração líquida eluída-gel eletroforese aprisionamento nativo (CN-GELFrEE), que é uma nova modalidade de separação para os conjuntos de proteínas não-covalentes. desempenho de separação CN-GELFrEE foi demonstrada por complexos de fraccionamento extraídos do coração mouse. As fracções foram recolhidas ao longo de 2 h e exibida bandas discretas que variam de ~ 30 a 500 kDa. A confoi observado padrão sistente de aumentar a largura de banda de peso molecular, cada um variando ~ 100 kDa. Além disso, subsequente reanálise das fracções nativas através de SDS-PAGE mostrou peso molecular desloca consistente com a desnaturação de complexos de proteínas. Portanto, NC-GELFrEE foi provado oferecem a possibilidade de realizar de alta resolução e de alta recuperação separações nativas em complexos de proteína a partir de uma grande gama de pesos moleculares, proporcionando fracções que são compatíveis com as análises de proteínas a jusante.

Introdução

A maioria dos processos biológicos que acontecem dentro de uma célula são pensados para ser levada a cabo por conjuntos de proteínas, em vez de proteínas individuais ^1. Por conseguinte, a fim de elucidar o papel biológico específico de uma subunidade de proteína numa célula é necessário para entender as suas interacções com outras proteínas estruturais ou ligandos em complexos de ^2. No entanto, estudando proteínas nativamente, mantendo suas interações e atividade não-covalentes, continua sendo um desafio. Uma das deficiências dos estudos proteína nativa é uma técnica de separação nativa adequado que seja compatível com as várias técnicas de an....