Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

Resumo

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digital duplex que pode ser utilizado para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E os marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminação fecal humana em geral e associada-em águas de recreio.

Resumo

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digitais duplex (EntHF183 dPCR) para a quantificação simultânea de Enterococcus spp. E o marcador HF183 fecal-associado humana. O EntHF183 duplex dPCR (referido como EntHF183 dPCR hereon) ensaio utiliza as mesmas sequências de Iniciador e Sonda como as suas congéneres PCR quantitativo (qPCR) individuais publicados. Da mesma forma, os mesmos procedimentos de filtragem de água e extração de DNA como realizados antes da qPCR são seguidos antes de executar dPCR. No entanto, o ensaio dPCR duplex tem várias vantagens sobre os ensaios de qPCR. Mais importante, o ensaio dPCR elimina a necessidade de execução de uma curva padrão e, por conseguinte, a polarização e variabilidade associada, por quantificação directa dos seus alvos. Além disso, embora a impressão duplex (isto é quantificação simultânea) Enterococcus e HF183 em qPCR muitas vezes leva a subestimação grave do alvo menos abundantes em uma amostra, dPCR fornece quantificação consistente de ambos os alvos, aguçarela quantificada individualmente ou simultaneamente na mesma reacção. O ensaio dPCR também é capaz de tolerar concentrações de inibidor de PCR que são uma a duas ordens de magnitude maior do que as toleradas por qPCR. Estas vantagens tornam o ensaio EntHF183 dPCR particularmente atraente porque fornece simultaneamente informações precisas e repetíveis em ambos contaminação geral e associada humano-fecal em águas ambientais, sem a necessidade de executar dois ensaios qPCR separadas. Apesar das suas vantagens sobre qPCR, o limite de quantificação do ensaio superior dPCR com instrumentação actualmente disponível é aproximadamente quatro ordens de grandeza menor do que a alcançável por qPCR. Por conseguinte, a diluição é necessário para a medição de concentrações elevadas de organismos alvo, tais como aqueles tipicamente observado após a derrames de esgoto.

Introdução

Os métodos quantitativos de PCR (qPCR) têm sido amplamente utilizados para a monitorização da qualidade da água de recreio e aplicações de monitorização de origem microbiana, porque eles são mais rápidos, mais flexível e específica em comparação com os métodos baseados em cultura tradicionais. Consequentemente, qPCR é recomendado para a obtenção de resultados de monitorização das águas rápidas para os indicadores fecais gerais, tais como Enterococcus spp. Nos critérios de qualidade revistos USEPA águas de recreio ^1. Muitos ensaios qPCR também têm sido desenvolvidos e validados para a identificação de fontes de contaminação fecal em águas ambientai....

Protocolo

1. Ensaio da preparação da mistura

1. Faça concentrações 100 mmol / L de ações para todos os iniciadores em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Nota: Sondas para os dois alvos são fluorescente etiquetado com diferentes fluoróforos ⁷ como indicados na Lista de materiais / equipamentos.
2. Prepare mistura principal misturando, por reacção planejado, 12 ul digital de mistura de PCR (2x de ações, ver Lista de materiais / equipamentos), 0,216 mL cada um para a frente e primer, 0,06 mL cada sonda fluorescente reversa e 5.016 mL de água liv....

Resultados

Um bom EntHF183 duplex dPCR execução deve resultar em número relativamente elevado de gotículas aceites (cerca de 10,000-17,000) e diferença relativamente grande (cerca de 5,000) entre os valores de fluorescência para gotas negativos e positivos ^7. Invulgarmente baixo número de gotículas provavelmente indica problemas no processo de geração de gotículas, e um limite de exclusão de 10.000 gotículas é sugerida com base em dados empíricos do sistema dPCR gotícul.......

Discussão

Existem algumas etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, a mistura das misturas de ensaio pode ser difícil, porque a mistura principal é mais viscoso do que misturas principais qPCR convencionais. vórtex simples pode levar a uma mistura insuficiente, o que conduz por sua vez à distribuição não uniforme de moldes de ADN nas misturas de ensaio e posteriormente nas gotículas. A técnica de mistura-por-pipetagem descrito no protocolo deve ser seguido para garantir a quantificação precisa dPCR. Em segundo lugar, é imp.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microtubos de baixa ligação	Costar	3207	Para armazenamento de reagentes, amostras/produção de misturas mestras
Água livre de nuclease	FisherSci	BP2484-50
TE Tampão de pH 8	FisherSci	BP2473-100
Placa de 96 poços Hardshell	BioRad	HSP-9601	Para mistura mestre inicial e inoculação de amostras
Filme	de vedação de alumínioBioRad	359-0133	Para selar a placa de amostra
Gerador de gotículas	BioRad	186-3002
Óleo de geração de gotículas	BioRad	186-3005
Cartucho	BioRad	186-4008
DG8 Suporte de cartucho	BioRad	186-3051
Junta	BioRad	186-3009
20 μ l pontas de pipeta	Rainin	GP-L10F	Para tansferring sample/master mix para cartidge
200 μ l pontas de pipeta	Rainin	GP-L200F	Para transferência de gotículas para a placa final Twin.Tec Placa
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	Para ciclagem térmica de gotículas finais e leitura
Folha de selagem térmica perfurável	BioRad	181-4040	Para selar a placa Twin.Tec antes do ciclo térmico
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 e C1000	Apenas o termociclador é necessário, sem óptica
Leitor de gotículas QX100	Óleo de	186-3001
	BioRad	186-3004
PCR de gotículas Supermix	BioRad	186-3024	ou seja a mistura de PCR digital no manuscrito
Software QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Para visualizar, analisar e exportar dados ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Fornecedor alternativo pode ser usado
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Fornecedor alternativo pode ser usado
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Fornecedor alternativo pode ser usado, mas o floróforo deve ser FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Fornecedor alternativo pode ser usado
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Fornecedor alternativo pode ser usado
Sonda HF183 (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Fornecedor alternativo pode ser usado, mas o floróforo deve ser HEX (se estiver usando VIC, a compensação matricial apropriada deve ser escolhida.
Controle positivo			Mistura de DNA genômico E. faecalis e plasmídeo padrão HF183 (encomendado ao IDT). Para métodos detalhados de cultura E. faecalis e sequências do plasmídeo HF183 ordenado, consulte Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Os padrões de ADN Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) também podem ser utilizados no controlo positivo em vez do ADN genómico E. faecalis preparado em laboratório.

leitor de gotículas BioRad