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Artigo de método

Peixe-zebra como um modelo para avaliar o potencial teratogênico de nitrito

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DOI:

10.3791/53615

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16 de fevereiro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

A exposição a teratógenos podem causar defeitos de nascimento. Os peixes-zebra são úteis para a determinação do potencial teratogénico de produtos químicos. Nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra, expondo embriões para vários teores de nitritos e também em diferentes tempos de exposição. Mostramos que os nitritos podem ser tóxicos e causar graves defeitos do desenvolvimento.

Resumo

Altos níveis de nitrato no ambiente pode resultar em defeitos congênitos ou abortos espontâneos em humanos. Presumivelmente, isto deve-se a conversão de nitrato em nitrito pelas bactérias intestinais e salivares. No entanto, em outros estudos de mamíferos, altos níveis de nitrito não causar defeitos de nascimento, embora possam levar a resultados reprodutivos pobres. Assim, o potencial teratogénico de nitrito não é clara. Seria útil dispor de um sistema de modelo animal vertebrado para avaliar facilmente efeitos teratogénicos de nitrito ou qualquer outro produto químico de interesse. Aqui, nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra (Danio rerio) para rastrear compostos para toxicidade e defeitos embrionárias. embriões de peixe-zebra são fertilizados externamente e ter um desenvolvimento rápido, o que os torna um bom modelo para estudos teratogênicos. Nós mostramos que o aumento do tempo de exposição ao nitrito afecta negativamente a sobrevivência. O aumento da concentração de nitrito também afecta adversamente a sobrevivência, enquanto que o nitrato não. Para tha embriõest sobreviver à exposição nitrito, vários defeitos podem ocorrer, incluindo pericárdio e gema de edema sac, nadar noninflation bexiga, e malformação craniofacial. Os nossos resultados indicam que o peixe-zebra é um sistema conveniente para estudar o potencial teratogénico de nitrito. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para testar outros produtos químicos para os seus efeitos sobre o desenvolvimento dos vertebrados precoce.

Introdução

Teratogénese é um processo que interrompe o desenvolvimento normal de um embrião ou feto por determinação de alterações funcionais e estruturais permanentes, retardamento do crescimento, ou aborto em casos graves 1. Ela pode ser causada por certos agentes naturais (teratógenos), os quais interferem com o desenvolvimento embrionário de várias maneiras 2. Durante o desenvolvimento fetal humano, teratogens comum, tais como a radiação, agentes infecciosos, metais tóxicos e químicos orgânicos foram relatados para causar defeitos de dobras epicanthic (a dobra de pele na pálpebra superior) e clinodactilia (dedo curvo ou pés) através de erros morfogenéticos 1.

Compreender o mecanismo molecular de teratogenesis é o primeiro passo para o desenvolvimento de tratamento e prevenção. Vários modelos de vertebrados, tais como o sapo com garras Africano (Xenopus laevis) e peixe-zebra (Danio rerio) têm sido utilizados para determinar as vias moleculares afectadas por TeratOgens. Estudos anteriores têm usado peixe-zebra como um modelo para a epidemiologia, toxicologia e teratogenesis 3-7. Scholz et ai. considerada peixe-zebra como um "padrão ouro" para a avaliação da toxicidade ambiental. Isto é devido, em parte, para a transparência do embrião do peixe-zebra, o que permite aos investigadores visualizar o defeito de desenvolvimento, uma vez que ocorre 8. Aproximadamente 70% dos genes humanos ortólogos tem no peixe-zebra, fazendo com que um modelo de peixe-zebra vertebrado desejável para o estudo de defeitos humanos 9.

Alguns estudos epidemiológicos têm sugerido que o nitrato e nitrito, comumente presente em alimentos agrícolas e água, estão associados a defeitos de nascimento ou abortos espontâneos 10,11, enquanto outros estudos não suportam essa associação 12. Nitrato (NO3 -) e nitrito (NO 2 -) estão naturalmente presentes no solo e na água. Eles são uma fonte de nitrogênio para as plantas e são uma parte do nciclo itrogen 13. Alimentos como feijão verde, cenoura, abóbora, espinafre e beterraba de fazendas que usam fertilizantes ricos em nitrato de ter aumentado significativamente os níveis de nitrato e nitrito 7. Leite de vacas alimentadas com alimentos à base de nitrato altos e peixes em água de alta nitrato (principalmente de escoamento do solo 30) pode levar a seres humanos que consomem grandes quantidades de nitrato e nitrito 14. Nitratos e nitritos são também vulgarmente utilizados na conservação de alimentos, o que aumenta dramaticamente a quantidade ingerida pelo ser humano 12.

Níveis óptimos de nitrato e nitrito desempenham papéis fundamentais em processos fisiológicos como a homeostase vascular e função, neurotransmissão e mecanismos de defesa do hospedeiro imunológicos 13-15. No entanto, a exposição a altos níveis de nitrato e nitrito pode levar a efeitos adversos, especialmente em lactentes e crianças de 16. nitrato ingerido é ainda convertido em nitrito na cavidade oral e pela microflora no the trato gastrointestinal pela microflora intestinal 17.

Nitrato coloca crianças em um alto risco para a síndrome do bebê azul por oxidação da hemoglobina em metemoglobina, prejudicando a hemoglobina a partir do seu transporte de oxigénio capacidade 18. Isto resulta em que a cor azul da pele que se estende para os tecidos periféricos, em casos mais graves. Oxigenação inibido de tecidos resulta em outros sintomas, mais severamente levando a coma e morte 19,20. Sintomas semelhantes são observados em bebés e adultos em concentrações mais altas de nitrato de 21. Níveis elevados de metemoglobina em adultos devido a resultados de intoxicação de nitrito em cianose, dor de cabeça, distúrbios respiratórios 31, e morte se não for tratada devido a complicações relacionadas com a hipóxia tecidual vital 32,33.

Nitrato de ingerido em níveis mais elevados também pode resultar em várias complicações de saúde. diabetes infância, diarreia recorrente e infecções recorrentes do trato respiratórioem crianças têm sido relacionados com alta nitrato 11,17,22 ingestão. A exposição crônica a um elevado nível de nitrato está associado com a micção e hemorragia do baço. Exposição aguda a doses elevadas de nitratos pode levar a um largo espectro de condições médicas tais como dor abdominal, fraqueza muscular, sangue nas fezes e urina, desmaios, e da morte 11. A exposição pré-natal ao nitrato em níveis elevados tem sido associada a defeitos do tubo neural e músculo-esquelético 11.

Um relatório recente mostrou que o tratamento de embriões de peixe-zebra com nitrito levou a gema edema sac, malformações craniofaciais e axiais, e nadar bexiga noninflation 5. No presente estudo, nós demonstramos um método para o tratamento de embriões de peixes-zebra com nitrato e nitrito para determinar o seu potencial teratogénico. Os embriões foram expostos a nitrito em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. O etanol foi utilizado como um controlo positivo, uma vez que é um agente teratogénico estabelecido em 23. Our método mostraram que ambas as concentrações elevadas e longos tempos de exposição a nitrito eram prejudiciais à sobrevivência e resultou em vários fenótipos, variando de leve (edema) a graves defeitos de desenvolvimento (bruto). Portanto, o peixe-zebra é um modelo útil para explorar diretamente os potenciais efeitos teratogênicos de nitrato e nitrito em embriões para complementar os estudos epidemiológicos.

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Protocolo

Os procedimentos descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Indiana em Pensilvânia.

1. Os embriões de colheita

  1. Manter peixe-zebra a 28,5 ° C, pH 7, condutividade entre 500-1,500 uS, e um ciclo de luz / escuridão de 14 horas de luz e 10 horas escuro 24. Use estirpes do tipo selvagem, como a Turquia, AB ou TU / AB híbrido. Diferentes estirpes podem responder de forma diferente ao tratamento químico 25.
  2. Configure o peixe para o acasalamento na noite anterior ovos de colheita por adição de água sistema de peixe em um tanque de acasalamento. Adicione uma peixes machos e fêmeas no tanque e separar os dois peixes com um divisor. Cada par peixe vai produzir uma gama de 50-300 ovos. Para garantir que os ovos suficientes será produzido, criou 30 pares de peixes. Normalmente, cerca de 50% de pares de peixes em idade de acasalamento prime (6-9 meses de idade) vai produzir ovos, resultando até 200 ovos por par e um máximo de até 3, 000 ovos para esta experiência.
  3. Na manhã seguinte, após a luz acende, remova o divisor para iniciar o acasalamento. Verifique os tanques de acasalamento para os ovos a cada 15 minutos.
  4. Uma vez que os peixes põem ovos, colher todos os embriões utilizando um coador de chá e combiná-los em um recipiente grande com tampão E3 (NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl 0,33 2, 0,33 mM MgSO 4). Em 1,5 hpf, remover e descartar ovos não fertilizados com uma pipeta de transferência de plástico sob um microscópio de dissecação. Ovos não fertilizados são opacas, enquanto ovos fertilizados são transparentes 34.
  5. Transferir 50 embriões numa placa de Petri de 100 x 15 mm de vidro contendo 50 ml de tampão de E3 para cada condição de tratamento. Um total de 33 pratos são necessários 11 para as condições de tratamento e 3 repetições.

2. Os embriões Tratar

  1. Realizar tratamentos em 2 horas pós-fertilização (hpf) 35. Incubar os embriões / larvas a 28,5 ° C e examinar as larvas em 120 hpf. Realizar pelo least três repetições de cada condição de tratamento para análise estatística.
  2. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de etanol a 300 mM em tampão diluída E3. Cobrir as placas de Petri com Parafilm para minimizar a evaporação do etanol.
    1. Continue expondo os embriões em etanol durante 22 h. Em seguida, remover o etanol com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato várias vezes para lavar o etanol. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
  3. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de tampão de novo E3.
  4. Para placas de Petri de 9 (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de 1,000 mg / L de nitrito de sódio dissolvido em tampão de E3. Confirmar a concentração da solução de nitrito de antemão usando ummodificação da diazotação (USEPA Método 354.1) método espectrofotométrico 28.
    1. Continue expondo 3 pratos para 46 hr, 3 pratos para 70 horas e 3 pratos para 94 horas. Substitua a solução de nitrito com uma solução de nitrito acabado de fazer diariamente.
    2. Depois de cada tempo de exposição, remover o nitrito com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato várias vezes para lavar o nitrito. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
  5. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de 200 mg / L de nitrito de sódio. Repetir este com 400, 600, 800, e 1000 mg / L de nitrito de sódio.
    1. Continue expondo os embriões de nitrito por 70 h. Substitua a solução de nitrito com uma solução de nitrito acabado de fazer diariamente.
    2. Após o tempo de exposição, remover o nitrito com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato váriasvezes para lavar o nitrito. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
  6. Para 3 placas de Petri (cada um contendo 50 embriões) em 2 HPF, remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 50 ml de 1,000 mg / L de nitrato de sódio dissolvido em tampão de E3. Confirmar a concentração da solução de nitrato de estoque de antemão, utilizando uma modificação da redução de cádmio (Método USEPA 353.3) 28 método espectrofotométrico.
    1. Continue expondo os embriões em nitrato por 70 hr. Substitua a solução de nitrato com solução de nitrato acabado de fazer diariamente.
    2. Após o tempo de exposição, remover o nitrato com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite o prato várias vezes para lavar o nitrato. Remover este buffer E3 com uma pipeta de transferência e repita o passo de lavagem mais 2 vezes.
  7. Durante cada dia da exposição, contar o número de mortos embrião / larvas usando um microscópio estereoscópico. Sinais de morteincluem a falta de batimentos cardíacos e a circulação sanguínea, ou falta de motilidade após 1 min de observação. Remover mortos embriões / larvas com uma pipeta de transferência para reduzir a contaminação do tampão E3.
  8. Quando experimentos acabar a 120 hpf, sacrificar as larvas.
    1. Remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência. Em seguida, adicione 50 ml de 0,2% MS-222 (tamponada a pH 7) e esperar por 10 min.
    2. Remover o MS-222 com uma pipeta de transferência. Adicionar 50 ml de tampão E3 e agite para lavar a MS-222.
    3. Remover o tampão de E3 com uma pipeta de transferência e adicionar 20 ml de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as larvas. Agitar o prato várias vezes. Usar uma pipeta de transferência para transferir as larvas para um frasco de vidro, juntamente com PFA suficiente para encher o frasco. Armazenar os tubos no frigorífico durante a noite (O / N).
  9. Tirar fotos de larvas fixo usando um estereoscópio com uma câmera digital. Use 30X ampliação, ISO 200, e 200 tempo de exposição ms. Orientar as larvas de modo que a anterior à lepé e dorsal é para o início do campo.

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Resultados

A exposição ao etanol de 300 mM durante 22 horas não teve nenhum efeito sobre a sobrevivência (dados não apresentados), consistente com relatos anteriores 5,23,26. Isto é esperado, como o etanol é um agente teratogénico conhecido e serviu como um controlo positivo. Fenótipos observados incluíram edema pericárdico, noninflation bexiga natatória (Figura 1), defeitos craniofaciais, e atraso do desenvolvimento (dados não apresentados).

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Discussão

O método descrito aqui demonstra a utilidade do peixe-zebra na avaliação do potencial teratogênico de nitrito e nitrato. Em comparação com outros vertebrados, zebrafish têm vantagens que incluem alta fecundidade, fecundação externa, transparência óptica e rápido desenvolvimento. Os mutantes que carecem de pigmentação disponíveis (tais como o peixe-zebra) Casper 36 também ajudam a aumentar a visibilidade dos órgãos internos. Também é fácil de gerar peixes-zebra transgénicos com genes repórter para facilitar a ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

VK foi financiado por bolsas do Departamento de Biologia da IUP e da Escola de Pós-Graduação e Pesquisa (Desenvolvimento Profissional de Estudantes de Pós-Graduação). O CQD e o TWS foram apoiados pela Escola de Pós-Graduação e Pesquisa da IUP (Custos de Publicação do Corpo Docente/Despesas Incidentais de Pesquisa). Também agradecemos aos membros do laboratório Diep pela manutenção das instalações do peixe-zebra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri de vidro
E10521NitraVer
5 ReagentHach14034-46
ParafilmeFisher Scientific3-374-10
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
S6E estereomicroscópioLeica10446294
Nitrato de sódioFisher ScientificS343
Nitrito de sódioFisher ScientificS347
Pipetas de transferênciaLaboratório Produtos de VendasL320072
Frascos de vidroFisher Scientific03-338B
de vidro de Sigma-Aldrich E7023 KIMAX do álcool etílico Hach 26700-03 de DREL/2010 Sigma-Aldrich NitriVer 3 do nitrito

Referências

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