Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.
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Artigo de método
Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nanopartículas fotorresponsivas (NPs) têm recebido atenção considerável devido ao seu potencial em fornecer controle espacial, temporal e de dosagem sobre a liberação do medicamento. No entanto, a maioria das tecnologias relevantes ainda está em processo de desenvolvimento e não pode ser adquirida pelas clínicas. Aqui, descrevemos uma fabricação fácil desses NPs foto-responsivos com NPs de ouro e lipossomas termo-responsivos disponíveis comercialmente. A calceína é usada como um medicamento modelo para avaliar a eficiência de encapsulamento e o perfil cinético de liberação após estimulação de calor / luz. Finalmente, mostramos que essa liberação foto-desencadeada é devido à ruptura da membrana causada pela cavitação de microbolhas, que pode ser medida com hidrofone.
Introdução
A possibilidade de desencadear a liberação de drogas usando estímulos externos é uma forma atraente para entregar a droga em modas espaço-, temporal- e controlado-dosagem com especificidade maximizada e os efeitos adversos mínimos. Entre uma vasta gama de sistemas exógenos estímulos responsivos (luz, campo magnético, ultra-som, radiação de microondas), plataformas de luz disparado são atraentes, devido à sua não-invasivo, simplicidade e adaptabilidade nas clínicas. 1 Extensas pesquisas na última década tem proporcionado uma variedade de tecnologias de plataforma, como o ouro responsável near-infrared-luz (AU) nanocages revestido com polímeros inteligentes, 2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (PN) conjugados com drogas, 3 e nanovesículas porphysome auto-organizadas. 4 Entretanto , estas tecnologias estão ainda nas fases pré-clínicas de desenvolvimento, e requerem uma compreensão clara e optimização dos parâmetros relativos ao processo de iniciação e controlando a libertação do fármaco.
Um dos métodos mais simples e facilmente acessíveis para a preparação de um tal sistema é integrar Au NPs com lipossomas termicamente sensíveis 5,6, ambas as quais estão amplamente disponíveis no mercado e têm sido amplamente investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos mesmo. Apesar da limitação da activação de tecidos profundos de Au NPs no seu comprimento de onda plasmónico, quando comparado com nanoestruturas Au-do infravermelho próximo activado (por exemplo, nanocages), este sistema ainda é muito promissora quando usada em pequenos animais ou para entrega tópica em seres humanos. 7 Há alguns esforços iniciais em combinar Au NPs com lipossomas para a liberação de luz disparado. 8-11 Enquanto a maioria deles concentrar-se na novidade de materiais, questões de acessibilidade e escalabilidade precisam ser abordadas. Além disso, os relatórios sobre mecanismos de liberação usando estes nanocarriers ainda são limitados.
Aqui, a fabricação de foto-sensívellipossomas, simultaneamente carregadas com drogas hidrófilas e Au NPs foi descrito. A calceina é utilizado como um composto modelo para avaliar a eficiência da encapsulação e o perfil de libertação do sistema. Além disso, neste sistema, a luz absorvida por Au NPs dissipa para o microambiente envolvente sob a forma de calor, o que resulta em um aumento na temperatura local. Microbolhas de ar são gerados durante o aquecimento a laser e causar ruptura mecânica de lipossomas (Figura 1). O mecanismo da cavitação microbolhas é confirmado por medições de hidrofones.
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Protocolo
1. Preparação
- Limpos redondo de 100 ml, utilizando balões de fundo água régia (1 parte de ácido nítrico concentrado (HNO3) e 3 partes de ácido clorídrico concentrado (HCl)) e lava-se os frascos com água DI. Autoclave os frascos e secá-los num forno de ar quente a 100 ° C durante 15 min. Enrole e armazenar os frascos estéreis até à sua utilização.
- Esterilizar o conjunto de mini-extrusora de mão usando 70% de etanol.
- Ligue o evaporador rotativo e ajustar a temperatura do banho de água quente e a torre de arrefecimento a 37 ° C e 4 ° C, respectivamente.
- Preparar 60 mM de solução mãe de calceína através da dissolução de 374 mg de calceína em 10 ml de 0,1 mM de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Ajustar o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio M solução de 1 (NaOH).
2. Síntese de Lipossomas
- Remover os lípidos (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroxi- sn-glicero-3-phosphochoA linha (CPMP) e 1, 2-sn-glicero-distearoyl--3-phosphoethanol aminas N - [carboxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio) (DSPE-PEG2000)) a partir do congelador (-20 ° C) e descongelar-los até à TA.
- Pesar 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg DSPE-PEG2000. Dissolve-los em conjunto em 2 mL de clorofórmio.
- Transferir a solução de clorofórmio para o balão de fundo redondo esterilizadas e evapora-se o solvente, utilizando o evaporador rotativo, sob pressão reduzida, de modo a formar uma camada fina de lípidos, seca.
- Hidratar a camada de lípidos a 45 ° C com solução aquosa de 2 ml durante 30 minutos 1,95 ml contendo 60 mM de calceína preparado no passo 1.4 e 50 ul Au NPs (3,36 x 10 16 partículas / ml).
- Pré-aquecer o bloco de aquecimento a 45 ° C. Colocar um filtro de membrana de policarbonato de 200 nm entre os suportes de filtro e montar o conjunto de mini-extrusora. Verifique a potenciais fugas com água DI.
- Encha uma das seringas com 1 ml de solução de lipossomas a partir do passo 2.4 e EXTRUde a amostra fazendo passar a solução para a seringa na outra extremidade da montagem de mini-extrusor. Repetir 11 vezes.
- Executar os lipossomas sintetizados através de uma coluna de dessalinização PD-10 para remover os livres Au NPs, lípidos e calceína utilizando PBS como eluente, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Armazenar as amostras em tubos estéreis a 4 ° C e usar em 2 dias.
3. Calce�a lançamento de lipossomas com Aquecimento
- Calcular a molaridade lipídica da solução somando os molaridades de DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 na etapa 2.2. Dilui-se a solução de estoque de concentração de lípido de lipossoma 5 mM utilizando 0,1 mM de tampão PBS (pH 7,4). Transferir as amostras para um tubo de centrifugação (2 ml).
- Colocar o tubo num banho de água quente, e aumentar a temperatura, gradualmente, de 25 a 70 ° C. Aumentar a temperatura a uma taxa de 1 ° C / min aqui.
- Recolha alíquotas (10 ml) em diferentes pontos de temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C).
- Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína.
- Transferir 200 ul da solução lipossomal a cada poço em microplacas de 96 poços e medir a intensidade de fluorescência das amostras recolhidas utilizando um leitor de microplacas de fluorescência. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de calceína são 480 e 515 nm, respectivamente.
- Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada em cada ponto do tempo, utilizando a fórmula:
Ft é a intensidade de fluorescência da solução a um dado ponto de tempo. F F I e X são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente.
4. Calce�a Relocação de lipossomas com laser pulsado
- Transferir a solução de lipossoma 100 ul para uma cuvete de quartzo e introduzi-los num suporte de cuvete. Usar um laser de Nd pulsadas: YAG com uma duração de pulso de 6 ns a 532 nm de comprimento de onda como a fonte de luz. Utilize os seguintes parâmetros laser - Taxa de repetição: 1 Hz; Densidade de energia do laser: 1 mJ / cm 2; Diâmetro do feixe: 0,5 mm.
- Orientar o feixe laser colimado através da cuvete de tal modo que a luz passa através da solução de lipossomas e recolher alíquotas após vários impulsos.
- Adicionar 10 ul de 2% de Triton X-100 a 2 ml da solução lipossomal aliquota para digerir os lipossomas durante 10 min à RT e para conseguir a libertação completa de calceína.
- Considerando calceína é sensível à luz e pode ser branqueada durante o experimento de laser, pré-medir o efeito de branqueamento de laser pulsado em solução calceína para normalizar os dados de libertação de lipossomas.
- Especificamente, expor solução de calceína (60 mM) para wi laser pulsadoth frequência de 1 Hz por um número variável de pulso (0, 25, 50 e 100). Medir a intensidade de fluorescência da calceina com excitação e emissão de comprimentos de onda de 480 e 515 nm, respectivamente, antes e depois da exposição à radiação laser.
- Calcular a quantidade de branqueamento (intensidade de fluorescência da calceina antes intensidade do laser exposição / fluorescência da calceina depois o número de impulsos específica). Use este factor para normalizar os valores obtidos a partir de amostras de lipossomas, multiplicando a intensidade de fluorescência dos lipossomas com o factor.
- Medir a intensidade de fluorescência da amostra recolhida utilizando um leitor de microplacas de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 480 e 515 nm, respectivamente.
- Tomando a intensidade de fluorescência das amostras de Triton X-100 tratadas como 100% de libertação, calcular a percentagem de calceína libertada a cada número de pulsos, usando a fórmula:
Ft é a intensidade de fluorescência da solução a um determinado número de impulsos após a normalização. F F I e X são as intensidades de fluorescência normalizados iniciais e finais da solução respectivamente.
5. Medição dos impulsos de pressão
- Colocar 100 ml da amostra numa lâmina de microscópio e definir o foco do laser sobre a amostra.
- Imergir um hidrofone agulha (1 mm de diâmetro e 450 a sensibilidade NV / Pa) para dentro da solução.
Cuidado: A hidrofone não deve ser iluminada pela luz do laser para evitar o dano. - Irradiar a amostra com o laser pulsado com números variados de pulso (0-100) e energia de pulso (20-160 μJ / pulso).
- Registam-se os sinais de pressão utilizando um osciloscópio digital.
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Resultados
Os lipossomas foram preparados usando uma técnica de hidratação de película fina convencionais com DPPC, CPMP e DSPE-PEG2000 numa razão molar de 86: 10: 4 ou 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml 12 O tamanho de Au NPs é crítico para determinar a luz para aquecer a eficiência de conversão durante a experiência seguinte de excitação de laser. Quanto menor o tamanho de Au PN, maior é a eficiência de transdução. Assim 13 5 nm Au NPs, as amostras mais pequenas do fornecedor, foram ...
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Discussão
hidratação do filme fino é o método convencional para a preparação de lipossomas. Os solventes orgânicos (clorofórmio neste caso) foram primeiro utilizados para dissolver os lipidos e, em seguida, removido num evaporador rotativo a 37 ° C, para gerar uma película fina de lípidos no frasco. Este filme de lípido foi hidratada com a solução aquosa contendo 60 mM de calceína e 5 nm Au NPs. Durante o processo de hidratação, a temperatura foi mantida a cerca de 50 ° C e o frasco foi constantemente agitada por rotação do balão...
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Divulgações
Não há conflito de interesse são declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente financiado pelos Fundos de Pesquisa Acadêmica Tier-1 por Singapura Ministério da Educação (RG 64/12 para CX) e Instituto NTU-Northwestern da nanomedicina.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA) | 850355P | em pó, armazenar a -20 ° C |
| 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA) | 855675P | em pó, armazenar a -20 &graus; C |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA) | 880120P | Powder, Store at -20 ° C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 partículas nm, estabilizadas em 0,1 mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g 60 | mM, pH 7.4 (ajustado usando NaOH) |
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Água duplamente destilada | Sistema de purificação de água Millipore Milli-DI Triton | ||
| X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | Para interromper os lipossomas para calcular a encapsulação total |
| Rotavapor | Buchi (Suíça) | R 210 | Usado para preparação de Lipososme |
| Banho de aquecimento | Buchi (Suíça) | B 491 | Usado para preparação de Lipososme |
| Controlador de Vácuo | Buchi (Suíça) | V-850 | Usado para preparação de Lipososme |
| Bomba de Vácuo | Buchi (Suíça) | V-700 | Usado para preparação de Lipososme |
| Banho de recirculação com controlador de temperatura | Policiência | Usado para preparação de Lipososme | |
| Montagem de mini-extrusora com bloco de aquecimento | Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA) | 610000 | Usado para extrusão de lipossomas |
| Seringas, 1.000 μ l | Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA) | 610017 | Usado para extrusão de lipossomas |
| Membrana de filtro de policarbonato, 200 nm | Whatmann | 800281 | Usado para extrusão de lipossomas |
| Suporte de Filtro | Avanti Polar Lipids (Alabama, EUA) | 610014 | Usado para extrusão de lipossomas |
| PD 10 Coulumns de dessalinização, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Usado para purificar os lipossomas |
| Centrífuga | Centrífugas de Laboratório Sigma | 3K30 | Usadas para concentrar a solução lipossomal |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Usado para concentrar a solução lipossomal |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Usado para a determinação do tamanho do lipossomo e zetapotential | |
| UV-Visible Espectrofotômetro | Shimadzu | UV-2450 | Usado para medir a absorbância das amostras |
| Espectrofluorômetro Fluorescente | Dispositivos Moleculares | SpectraMax M5 | Usado para medir a emissão de fluorescência das amostras |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Potência máxima: 17 Mj; Largura: 406 Nsec; Usado para irradiação de amostras | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1 mm de diâmetro e sensibilidade de 450 nV/Pa, Faixa de frequência de trabalho adequada: 0.25-10 Mhz; Calibração: 50 mV/bar; Utilizado para medir os sinais acústicos |
| Osciloscópio Digital | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequência: 600 MHz; Taxa máxima de amostragem: 10 Gs/seg (em dois canais); Usado para registrar os sinais acústicos medidos |
Referências
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Reimpressões e permissões
