Artigo de método

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

DOI:

10.3791/53620

⸱

27 de janeiro de 2016

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos aqui um ensaio por acoplamento de identificação do DNA adenina metiltransferase (DamID) para sequenciamento de alta taxa de transferência (DamID-seq). Este método melhorado fornece uma resolução mais alta e uma maior gama dinâmica, e permite analisar os dados DamID-seq em conjunto com outros dados de sequenciação de alto rendimento tal como Chip-SEQ, ARN-SEQ, etc.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio de identificação da DNA adenina metiltransferase (DamID) é um método poderoso para detectar interações proteína-DNA localmente e em todo o genoma. É uma abordagem alternativa à imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Uma proteína de fusão expressa consistindo da proteína de interesse e da adenina metiltransferase do DNA de E. coli pode metilar a base adenina em motivos GATC próximos aos locais de interações proteína-DNA. Fragmentos de DNA metilados com adenina podem então ser especificamente amplificados e detectados. O ensaio DamID original detecta as localizações genômicas de fragmentos de DNA metilado por hibridização com microarrays de DNA, que é limitada pela disponibilidade de microarrays e pela densidade de sondas predeterminadas. Neste artigo, relatamos o protocolo detalhado de integração do sequenciamento de DNA de alto rendimento no DamID (DamID-seq). O grande número de leituras curtas geradas a partir do DamID-seq permite detectar e localizar interações proteína-DNA em todo o genoma com alta precisão e sensibilidade. Usamos o ensaio DamID-seq para estudar as interações genoma-lâmina nuclear (NL) em células de mamíferos e notamos que o DamID-seq fornece uma alta resolução e uma ampla faixa dinâmica na detecção de interações genoma-NL. A abordagem DamID-seq permite sondar associações NL dentro de estruturas gênicas e permite comparar mapas de interação genoma-NL com outros dados genômicos funcionais, como ChIP-seq e RNA-seq.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADN identificação adenina metiltransferase (DamID) 1,2 é um método para detectar interacções proteína-ADN in vivo e é uma abordagem alternativa para a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) 3. Ele usa uma quantidade relativamente baixa de células e não necessita de reticulação química de proteína com ADN ou um anticorpo altamente específico. O último é particularmente útil quando a proteína alvo é frouxamente ou indirectamente associada com o ADN. DamID tem sido utilizado com êxito para mapear locais de ligação de uma variedade de proteínas, incluindo as proteínas do envelope nuclear 4-10, proteínas de cromatina associada cromatina 11-13, enzimas modificadoras 14, factores de transcrição e co-factores 15-18 e maquinarias RNAi 19. O método é aplicável em vários organismos, incluindo S. 13 cerevisiae, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22, bem como de ratinho e células humanas linhas 6,8,10,23,24.

O desenvolvimento do ensaio DamID foi baseado na detecção específica de fragmentos de ADN metilado-adenina em células eucarióticas que não possuem adenina endógenos metilação 2. Uma proteína de fusão expressa, que consiste da proteína de ligação de ADN de interesse e E. coli ADN metiltransferase adenina (DAM), pode metilar a base de adenina nas sequências GATC que estão em proximidade espacial (mais significativamente dentro de 1 kb e até cerca de 5 kb) para os locais de ligação da proteína no genoma 2. Os fragmentos de ADN podem ser modificados especificamente amplificado e hibridado com microarrays para detectar os locais de ligação genómicos da proteína de interesse 1,25,26. Este método DamID original é limitada pela disponibilidade de microarranjos e a densidade de sondas predeterminados. Temos, portanto, integrada alto throughput sequenciação empara DamID 10 e designado como o método DamID-SEQ. O grande número de curto geradas a partir de leituras DamID-SEQ permite localização precisa de interacções proteína-ADN a nível genoma. Descobrimos que DamID-seq fornecida uma resolução maior e uma gama dinâmica mais ampla do que DamID por microarray para estudar lâmina genoma nuclear (NL) 10 associações. Este método permite uma melhor sondagem associações NL dentro das estruturas do gene 10 e facilita comparações com outros dados de seqüenciamento de alto rendimento, como ChIP-seq e RNA-seq.

O protocolo DamID-seq aqui descrito foi desenvolvido inicialmente para mapeamento do genoma-NL 10 associações. Geramos uma proteína de fusão amarrados mouse ou Lamin B1 humana para E. coli DNA metiltransferase adenina e testou o protocolo em 3T3 fibroblastos de rato embrionárias, C2C12 mioblastos rato 10 e IMR90 fibroblastos de pulmão fetal humano (dados não publicados). Neste protocolo, começamos com constructing vetores e expressando proteínas de fusão Dam-tethered por infecção lentivírus em células de mamíferos 24. A seguir, descrevemos os protocolos detalhados de amplificar fragmentos de DNA metilado-adenina e preparar bibliotecas de seqüenciamento que deveriam ser aplicável em outros organismos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Geração e Expressão de Proteínas de Fusão e Proteínas gratuito Dam

  1. O clone da proteína de interesse no vector DamID.
    1. Amplificar ADNc de proteína de interesse (POI), utilizando a ADN-polimerase de alta fidelidade desejado e iniciadores apropriados de acordo com o protocolo do fabricante. Determinar experimentalmente as condições de amplificação óptimas para garantir uma amplificação apropriada de inserções.
    2. Executar um gel de agarose e amplificado ADNc de purificar PI pelo kit de extracção de gel de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. O clone de ADNc de PI no vector pDONR201 usando BP clonase II de acordo com o protocolo do fabricante.
    4. Clonar o ADNc de PI a partir do vector dador no vector de destino pLGW-RFC1-V5-EcoDam ou o destino vector pLGW-EcoDam-V5-RFC1 27 usando LR clonase II de acordo com o protocolo do fabricante, dependendo da direcção desejada de fusão PI para o terminal N ou the C-terminal da E. coli ADN metiltransferase adenina (EcoDam) 27.
    5. Verifique por sequenciação de que o cDNA clonado tem uma seqüência correta e formas em-frame de fusão para EcoDam.
  2. Gerar stocks de lentivírus.
    1. Gerar stocks de lentivírus que expressam Dam-V5-POI e V5-Dam (a partir do vector pLGW-V5-EcoDam 27) utilizando sistemas de expressão de lentivírus. Use o procedimento de transfecção para a frente segundo o protocolo do fabricante.
      1. Use células 293T e lipofecção para gerar stocks lentivirais de acordo com o protocolo do fabricante para a transfecção.
      2. Incluem o passo de filtro de PVDF de 0,45 um.
  3. Infectar as células com lentivírus.
    1. O dia antes da infecção (dia 0), passar células aderentes cultivadas em meio de crescimento apropriado para este tipo de célula para uma placa de cultura de tecido de 6 poços utilizando o mesmo meio de crescimento sem a antibióticosalcançar 50% de confluência no dia da infecção. Células lugar em um 37 ° C incubadora.
    2. No dia da infecção (dia 1), retire 2 cryovials de ambos Dam-V5-PI e V5-Dam sobrenadantes de lentivírus de um freezer -80 ° C e coloque em um banho de 37 ° C água para descongelar.
      1. Remover o meio de crescimento a partir de células e substituir com 0,5 ml de meio de crescimento fresco, sem antibióticos.
      2. Adicionar 1 ml do lentivírus descongeladas a cada poço (2 poços com V5-Dam e 2 poços com Dam-V5-POI). Adicionar 1 ml de meio de crescimento sem os antibióticos para os restantes poços de 2-isso vai servir como um controlo negativo. Agite suavemente a placa de 6 poços para misturar e colocar de volta em um 37 ° C incubadora O / N.
    3. O dia após a infecção (dia 2), remova suspensões virais a partir de células e substituir com 2 ml de meio de crescimento sem antibióticos. Células lugar de volta em uma incubadora de 37 ° C durante 48 horas.
  4. Isolar gDNA.
    1. Meios aspirado de cada poço e decélulas tach usando 250 ul 0,05% tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 2 min.
    2. Lave as células da placa com 1 ml de meio de crescimento e células de cada cavidade de pipeta para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Peletizar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Lavar as células sedimentadas com 500 ul de PBS e centrifugar a 200 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
    4. Ressuspender as células peletizadas em 200 ul de PBS.
    5. Isolar ADNg pelo kit de sangue e de tecido de acordo com o protocolo do fabricante. Eluir ADNg em 200 ul de tampão AE e determinar a concentração medindo a OD 260 utilizando um espectrofotómetro.
      Nota: ADNg partir de células infectadas ou não infectadas simuladas pode ser isolado como controlos negativos. Precipitar ADNg para concentrações mais elevadas para o armazenamento a longo prazo.
      1. Adicionar 3 volumes de etanol a 100% e 0,1 volume de acetato de sódio 3M (pH 5,5), e misturar por inversão tubos 4-6 vezes.
      2. Armazenar a -20 ° CO / N.
      3. Centrifugar a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
      4. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Lavar peletes com 70% (volume / volume) de etanol e centrifuga-se a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
      5. Cuidadosamente remover etanol e permitir peletes secar ao ar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
      6. Dissolver ADNg em T 10 E 0,1 (pH 7,5) a cerca de 1 ug / uL. Piscina gDNA de cada amostra experimental ou o controlo negativo e medir a concentração. Armazenar a -20 ° C.

Fragmentos de DNA 2. Amplify Adenina-metilados

  1. Digest ADNg com Dpnl, que corta apenas GATCs metilado-adenina.
    1. Defina-se uma reacção em gelo com 2,5 ug ADNg, 1 ul de tampão 10x, 0,5 ul DpnI (20 U / ul) e encher com H 2 O para um volume total de 10 ul. Para cada amostra de ADNg, preparar três reacções - um sem Dpnl ("não Dpnl", substituir Dpnl com 0,5 ul de H2O) e dois wom DpnI ("com DpnI").
    2. Digest O / N a 37 ° C e Dpnl inactivar a 80 ° C durante 20 min.
  2. Ligadura adaptadores DamID.
    1. Prepare adaptadores DamID.
      1. Ressuspender cada um dos dois oligonucleótidos adaptadores DamID 24 em H 2 O para uma concentração final de 100 uM.
      2. Combine volumes iguais dos dois oligos adaptador DamID, misture e coloque em um tubo bem fechado. Selar o tubo com Parafilm, sentar-se em um rack e coloque em um copo cheio de água a 90 ° C. Manter o nível da água abaixo da tampa do tubo (para evitar a entrada de água no tubo), mas acima da superfície da mistura de oligo.
      3. Deixe a água fresca para RT de modo que o recozimento adaptadores lentamente.
      4. Alíquota os adaptadores recozidos (50 mm) e armazenar a -20 ° C.
    2. Configurar uma reacção em gelo. Em cada tubo de 2.1.2, adicionar 6,2 mL de H2O, 2 uL de tampão de ligação 10x, 0,8 ad 50 uL uM DamIDaptors (descongeladas em gelo) e 1 ul de DNA ligase de T4 (5 U / uL). O volume total é 20 jil. Em um dos dois "tubos" com DpnI, substitua com 1 ul de ligase H2O ("não-ligase") Note-se que cada amostra ADNg tem dois controlos negativos -. "Dpnl nenhuma" e "não-ligase".
    3. Ligadura O / N a 16 ° C e inactivar a ligase a 65 ° C durante 10 min.
  3. ADN digerido com DpnII para destruir os fragmentos que contêm GATCs não metilados.
    1. Configurar uma reacção em gelo. Em cada tubo de 2.2.3, adicionar 24 ul de H2O, 5 mL de tampão 10x e 1 ul DpnII DpnII (10 U / ul). O volume total é 50 jil.
    2. Digest a 37 ° C durante 2-3 horas e inactivar DpnII a 65 ° C durante 20 min.
  4. Amplificar fragmentos de ADN metilado-adenina.
    1. Configurar uma reação no gelo com 5 ul DpnII digerir a partir de 2.3.2, 5 μl tampão de PCR 10x, 5 jil 12,5 uM DamID iniciador de PCR de 24, 4 ul de dNTP 10 mM de misturar, 1 ul de polimerase 50x mistura e 22,5 jil de H2O O volume total é 50 jil.
    2. Executar a PCR como se segue: 68 ° C durante 10 min; 94 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 5 min, 68 ° C durante 15 min; 4 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 10 min; 17 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 2 min.
    3. Analise 5 ul produtos de PCR de cada reacção sobre um gel de agarose a 1%. Os produtos de PCR deve aparecer como uma mancha que varia de 0,2 para 2 kb (Figura 2). Os controles "não DpnI" e "não ligase" não deve ter nenhum ou menos claramente amplificação.
    4. Se o resultado do passo 2.4.3 é satisfatória, repetir os passos 2.4.1-2.4.3 com duas ou três reacções para a amostra experimental e uma reacção para cada um dos dois controlos negativos.
    5. Piscina e purificar produtos de PCR a partir da mesmaamostra experimental utilizando kits de purificação de PCR ou de fase sólida reversível Imobilização (SPRI) esferas de acordo com o protocolo do fabricante. Não purificar "não DpnI" ou controles "não ligase". Eluir DNA com tampão de EB.
    6. Medir a concentração de DNA medindo a OD purificada 260 utilizando um espectrofotómetro, que deve ser cerca de 0,1 mg / mL ou superior. Recolha um mínimo de 10 ug de ADN para cada amostra. Se estiver usando kits de purificação de PCR, purificar cada 50 ul produtos de PCR com uma coluna, eluir em 30 ul de tampão EB e reunir os eluatos.
  5. ADN digerido com DpnII para evitar que os iniciadores de PCR a partir de DamID sendo sequenciados.
    1. Defina-se uma reacção em gelo com 5 ug de ADN purificado a partir de 2.4.6, 5 ul de tampão 10x DpnII, 1 ul DpnII (10 U / ul) e encher com H 2 O para um volume total de 50 ul. Preparar dois ou três reacções para cada amostra.
    2. Digerir a 37 ° C durante 2-3 hre inactivar DpnII a 65 ° C durante 20 min.
    3. Piscina e purificar os fluidos de digestão a partir da mesma amostra com kits de purificação de PCR ou grânulos SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Eluir DNA com tampão de EB.
    4. Medir a concentração de ADN purificado, que deve ser cerca de 0,06 mg / mL ou superior. Recolha um mínimo de 6 ug de DNA de cada amostra. Se estiver usando kits de purificação de PCR, purificar cada 50 ul digerir com uma coluna, eluir em 30 ul de tampão EB e reunir os eluatos.

3. Preparação para a Biblioteca de alta capacidade Sequencing

  1. Fragmento de ADN
    1. Experimentalmente determinar o tempo de digestão apropriados para cada novo lote de ADNcd Fragmentase. À medida que a actividade da enzima pode diminuir ao longo do tempo, repetir o teste antes de executar uma nova experiência. Para guardar o DNA de 2.5.4 para a fragmentação actual, utilizam produtos de PCR purificados a partir de metilo ou 2.4.6 DNA extra de experime anteriornts nesta etapa.
      1. Configurar uma mistura principal com DNA 6 mg, 12 ul 10x tampão Fragmentase e encher com H 2 O para um volume total de 114 mL.
      2. Vortex do frasco estoque Fragmentase por 3 s, adicionar 6 ul na mistura principal e vortex a mistura principal por 3 s. O volume total é de 120 l.
      3. Alíquota de 20 ul da mistura principal para cada um dos 5 novos tubos. Incubar todas as 6 tubos a 37 ° C durante 5 a 55 min a um incremento de 10 minutos. Adicionar 5 uL de EDTA 0,5 M para parar a reacção.
      4. Analise 12,5 ul digerir (0,5 ug de ADN) de cada uma das reacções, bem como 0,5 ug de ADN digerido num gel de agarose (Figura 3). Determine o tempo mínimo (t 0.2kb) necessária para digerir a maioria da mancha de cerca de 0,2 kb. Selecione 6 durações de tempo entre 5 min e T 0.2kb (incluindo 5 min e T 0.2kb) com incrementos iguais para a fragmentação actual.
    2. Configure os Fragmen reaisção como descrito no 3.1.1.1-3.1.1.3. Incubar as reacções a 37 ° C, para as durações de tempo determinado em 3.1.1.4.
    3. Piscina 6 reacções e purificar as digestões com kits de purificação de PCR ou grânulos SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN em tampão 51 ul de EB. O eluato final é ~ 50 ul.
  2. Reparação termina do DNA fragmentado
    1. Defina-se uma reacção em gelo com o eluato de 3.1.3, 25 ul de H2O, 10 pi de tampão ligase 10x de ADN de T4 com ATP 10 mM, 4 ul de mistura de dNTP 10 mM, 5 jil de polimerase do DNA de T4 (3 U / ul) , 1 ul de ADN polimerase de Klenow (5 U / uL), e 5 ul de polinucleotídeo cinase de T4. O volume total é de 100 uL. Misturar bem com pipeta. Evite espuma e bolhas.
    2. Incubar a 20 ° C durante 30 min.
    3. Purifica-se o ADN com kits de purificação de PCR ou grânulos SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN em tampão 33 ul de EB. O eluato final é ~ 32 & #181; l.
  3. Adicionar saliências "A"
    1. Defina-se uma reacção em gelo com o eluato de 3.2.3, 5 ul de tampão Klenow 10x, 10 ul de dNTPs 1 mM, e 3 ul de Klenow (3 '→ 5' exo) (5 U / uL). O volume total é 50 jil. Misturar bem com pipeta. Evite espuma e bolhas.
    2. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
    3. Purifica-se o ADN com kits de purificação de PCR ou grânulos SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN em tampão 22 ul de EB. O eluato final é ~ 21 ul.
  4. Adaptadores de sequenciamento ligadura
    1. Prepare adaptadores de sequenciação 28.
      1. Ressuspender cada oligo adaptador a uma concentração de 100 ^ M em Tris 10 mM-Cl (pH 7,8), EDTA 0,1 mM (pH 8,0) e NaCl 50 mM.
      2. Misturar volumes iguais de o adaptador universal 28 e um adaptador indexada 28.
      3. Emparelhar as placas num termociclador com a seguinteprograma: 95 ° C durante 2 min; 140 ciclos durante 30 segundos a partir de 95 ° C e uma diminuição de 0,5 ° C a cada ciclo; manter a 4 ° C.
      4. Adaptadores de alíquotas e armazenar a -20 ° C.
    2. Configurar uma reacção em gelo com o fluido a partir de 3.3.3, 25 ul 2x tampão de ligação, 1,5 ul 50 mM recozidos adaptadores de seqüenciamento (descongeladas em gelo) do 3.4.1.4 e 2,5 ul DNA ligase de T4. Misturar bem com pipeta. Evite espuma e bolhas. Se seqüenciamento multiplex é desejada, use um adaptador indexada diferente para cada amostra.
    3. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Purifica-se o ADN com kits de purificação de PCR ou grânulos SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN em tampão 24 ul de EB. O eluato final é ~ 23 ul.
  5. Converter adaptadores em forma de Y para dsDNA para permitir determinar com precisão fragmento de DNA de tamanhos 28
    1. Configurar uma reacção em gelo com o fluido a partir de 3.4.4, 12,5 ul H2O, 1 ul 25 uM iniciador 1 28, 1 25 ul de 2 28 uM de iniciadores, 1,5 ul de dNTP 10 mM, 10 ul de tampão de PCR 5x e 1 ul de DNA polimerase (1 U / ul).
    2. Executar a PCR como se segue: 95 ° C durante 3 min; 5 ciclos de 98 ° C durante 15 seg, 63 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg; 72 ° C durante 1 min; 4 ° C em espera.
    3. Purifica-se o ADN com kits de purificação de PCR ou grânulos SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN em tampão 11 ul de EB. O eluato final é ~ 10 ul.
  6. Tamanho selecione a biblioteca
    1. Preparar um gel de agarose a 2% em tampão TAE 1X. Adicionar brometo de etídio (CUIDADO!) A uma concentração final de 500 ng / ml quando a solução de TAE-agarose fundida foi arrefecida para evitar a inalação de brometo de etídio. Certifique-se de ter pistas suficientes para todas as amostras, escada de DNA e pistas vazias.
    2. Adicionar corante 6x carregamento 8 ul a partir do eluato 3.5.3.
    3. Prepare a escada de ADN por mistura de 1 kb, mais escada de ADN (1,0 ug / uL), corante de carga de 6x e H2O numa proporção de 1: 1: 4.
    4. Carga 6 ul escada de DNA, as amostras a partir de 3.6.2 e outra escada de ADN 6 ul, cada um em uma pista separada e com pelo menos uma fila vazia a partir das amostras / escadas adjacentes.
    5. Submeter o gel a 120 V durante 60 min.
    6. Ver o gel num transiluminador de UV (minimizar o tempo de exposição ao UV). Usar óculos de protecção e uma viseira. Certifique-se de pelo menos uma das escadas de DNA correr bem com espaçamento adequado (o suficiente para extirpar 3 fatias de gel) entre 300 pb e 400 pb bandas. Espaçamento estreito aumenta as dificuldades de excisão múltiplas fatias de gel, enquanto o espaçamento de largura aumenta o volume de fatias de gel excisado.
    7. Use uma nova bisturi ou uma lâmina de barbear para cada pista. Excise três fatias finas de gel entre 300 e 400 pb a partir de cada pista (Figura 4) e colocá-los em cada um tubo de microcentrífuga. Mantenha o volume de cada gel spiolhos tão baixo quanto possível (<100 uL).
    8. Medir o volume de cada fatia de gel (gel de 1 ul pesa aproximadamente 1 mg), adicionar volumes de tampão QG 6x e incubar a 50 ° C.
    9. Vortex a mistura QG-gel cada 2-3 min, até que a fatia de gel foi completamente dissolvido. Adicionar volumes de gel 2x de isopropanol e misture.
    10. A partir desta etapa, siga o protocolo de kits de extração de gel. Elui-se o ADN em tampão 51 ul de EB. O eluato final é ~ 50 ul.
  7. Enriqueça fragmentos de DNA adaptador modificado seqüenciamento
    1. Otimizar o número de ciclos de PCR 29.
      1. Defina-se uma reacção em gelo com 1 ml de eluato 3.6.10, 1 ul 25 uM iniciador 1 28, 1 25 ul de 2 28 uM de iniciadores, 7 ul de H2O e 10 ul de SYBR Green Supermix. O volume total é 20 jil.
      2. Executar o qPCR como se segue: 95 ° C durante 3 min; 20 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 63 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, a placa de leitura.
      3. Analisar os dados utilizando um software de análise de qPCR e determinar o ciclo de Quantificação (Cq) ou o ciclo limiar (Ct) para cada amostra utilizando o protocolo do fabricante. Continue com as amostras que têm Cq / Ct ≤ 14. Use o máximo Cq (CQ 0) menos 1 (arredondado para o próximo inteiro para cima) como o número de ciclos PCR final (N PCR).
      4. Ajustar as quantidades de moldes de ADN de modo a que diferentes amostras será amplificado a quantidades aproximadamente iguais depois de executar o mesmo número de ciclos de PCR. Use 8 ul molde para a amostra com a mais elevada Cq (Cq 0), e calcular o volume do molde de outras amostras com a seguinte fórmula:
        Vol I = 8 x 1,8 cq i -Cq 0
    2. Configure reações de PCR em gelo com os volumes do modelo calculados a partir 3.7.1.4: 1 pi 25 um iniciador 1 28, 1 ul 25 um iniciador 2 28, 1.5uL dNTP 10 mM, 10 ul de tampão 5x, 1 ul de DNA polimerase (1 U / ul) e encher com H 2 O para um volume total de 50 ul.
    3. Executar a PCR como se segue: 95 ° C durante 45 seg; N ciclos de PCR (determinado em 3.7.1.3) de 98 ° C durante 15 seg, 63 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg; 72 ° C durante 1 min; 4 ° C em espera.
    4. Analise 5 ul produtos de PCR num gel de agarose a 2% (Figura 5A). Uma banda clara "única" indica que os fragmentos de ADN amplificados estão dentro de uma gama estreita de comprimento e de que a biblioteca de ADN pode ser sujeito a mais análises.
    5. Repetir uma reacção para amostras seleccionadas e reunir as bibliotecas de DNA amplificados a partir da mesma amostra.
    6. Purificar bibliotecas de DNA seleccionados para sequenciamento.
      1. Se dímeros primer / adaptador não são visíveis no 3.7.4, purificar bibliotecas de DNA com kits de purificação de PCR ou contas SPRI de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN em tampão 21 ul de EB. oeluato final é ~ 20 ul. Se serviço de sequenciação do usuário tem instruções específicas sobre o tampão de eluição, o volume final, etc., preparar amostras em conformidade.
      2. Se dímeros de iniciador / adaptador são claramente visíveis em 3.7.4, purificar bibliotecas como se segue.
        1. Carga de ADN a partir de 3.7.5 e escada de DNA em gel de agarose a 2% pré-moldado. As amostras podem ser purificados tal como descrito em 3.7.6.1 para reduzir o volume ou pode ser colocado em várias cavidades. Coloque o gel de agarose em um sistema de alimentação adequada. Deixar o gel correr durante 15 min.
        2. Usando um transilluminator disso, cortar a banda desejada com um bisturi limpo / navalha para cada amostra e colocar a fatia de gel em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
        3. Isolar o ADN utilizando kits de extracção de gel de acordo com o protocolo do fabricante, com duas modificações: incubar tampão mistura QG-gel num termo-misturador a 37 ° C e 1000 rpm durante 30 min, e adicionar volumes de gel 2x de isopropanol.
  8. Enviar bibliotecas de DNA purificado de uma academia de seqüenciamento. Siga todas as orientações facilidade.
    Nota: Uma análise da qualidade por um Bioanalyzer (Figura 5B) deve ser realizada antes da sequenciação, a fim de determinar a gama de dimensão exacta e a concentração de uma biblioteca de ADN.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verificou-se a proteína de fusão Dam-V5-LmnB1 para ser co-localizada com a proteína endógena lamina B por coloração de imunofluorescência (Figura 1).

A amplificação bem sucedida PCR de fragmentos de DNA metilado-adenina é um passo fundamental para DamID-seq. As amostras experimentais devem amplificar um esfregaço de 0,2 - 2 KB, enquanto que os controlos negativos (sem Dpnl, sem ligase ou sem molde de PCR) deve...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se as proteínas marcadas com Dam retêm as funções das proteínas endógenas deve ser examinado antes de um experimento DamID-seq. A localização subcelular das proteínas do envelope nuclear marcadas com Dam deve sempre ser determinada e comparada com a das proteínas endógenas. Para o estudo dos fatores de transcrição, sugere-se examinar se a proteína Dam-fusion pode resgatar as funções da proteína endógena na regulação da expressão gênica. Este teste funcional pode ser realizado em organismos nos quais mutantes knockout de ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Bas van Steensel por fornecer os vetores de expressão de mamíferos DamID. Agradecemos ao Centro de Análise do Genoma de Yale e ao Núcleo de Genômica do Centro de Células-Tronco de Yale pelos conselhos sobre a preparação de bibliotecas NGS e a implementação de sequenciamento de DNA de alto rendimento. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento inicial da Yale School of Medicine, um Scientist Development Grant da American Heart Association (12SDG11630031) e um Seed Grant da Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistemas de Expressão Lentiviral ViraPowerLife TechnologiesK4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 e K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme MixLife Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme MixLife Technologies11791-020
DNeasy Blood & Kit de Tecidos (250)QIAGEN69506 ou 69504   
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T célulasAmerican Type Culture CollectionCRL-11268
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenolLife Technologies25300-054
DMEM, glicose alta, piruvatoLife Technologies11995-065
Soro bovino fetalSigmaF4135
Trismarca não crítica
marca EDTAnão crítica
200 Prova EtOHmarca não crítica
Marca Isopropanolnão crítica
Marca de acetatonão crítica
DpnINew England BiolabsR0176fornecido com
adaptadores TamID "AdRt" e "AdRb"Sequências integradas de DNATechnologies disponíveis na ref. 24; sem fosforilação da extremidade 5 'ou 3' para evitar a autoligação.
T4 DNA LigaseRoche Life Science10481220001fornecido com tampão
DpnIINew England BiolabsR0543fornecido com tampão
DamID PCR primer "AdR_PCR"Sequências integradas de DNATechnologies disponíveis na ref. 24
Conjunto de soluções de desoxinucleotídeo (dNTP)New England BiolabsN0446100 mM cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP
Vantagem 2  Mistura de polimeraseClontech639201fornecida com tampão
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 µ g/µ l
Kit de purificação de PCR QIAquickQIAGEN28104 ou 28106
Kit de purificação de PCR MinEluteQIAGEN28004 ou 28006para um volume de eluição inferior a 30 µ l
Contas SPRI / Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880aplicam mistura extra e mais tempo de eluição se menos de 40 µ l tampão de eluição é usado
Tampão EBQIAGEN19086
NEBPróximo dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348fornecido com tampão
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BiolabsB0202
T4 DNA PolimeraseNew England BiolabsM0203
DNA Polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) NewEngland BiolabsM0210
T4 Polinuleotida QuinaseNew England BiolabsM0201
Klenow Fragment (3' → 5' exo-)New England BiolabsM0212fornecido com
adaptadores de sequenciamentointegradas de DNATechnologies disponíveis na ref. 28
Kit de ligação rápidaNew England BiolabsM2200utilizado no ponto 3.4.3; fornecido com tampão de reação de ligação rápida e primer de sequenciamento Quick T4 DNA Ligase
1 e 2de tecnologiasdisponíveis na ref. 28
KAPA HiFi PCR KitKapa BiosystemsKK2101 ou KK2102fornecido com KAPA HiFi DNA polimerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer e 10 mM dNTP mistura
agaroseSigma AldrichA4679
brometo deetídioSigma AldrichE1510-10ML10 mg/ml
QIAquick Kit de Extração de GelQIAGEN28704 ou 28706
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725121 ou 1725122
Espectrofotômetromarca não crítico
0,45 μ m Filtromarca não crítica
25 ml Seringemarca não crítica
10 cm Placasmarca não crítica
Placasmarca não crítica
Termociclador S1000Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch TermocicladorBio-Rad Laboratoriespara a marca do
misturadornão crítica
Aquecedor de bloco seco ou marca termomisturadornão crítica
Marca microcentrífuganão crítica
Sistema de eletroforese em gel com marca de fonte de alimentaçãonão crítica
Suportemagnéticopara purificação de DNA com grânulos SPRI; deve conter tubos de 1,5-2 ml; marca não crítica
transiluminadormarca não crítica
Sistema de eletroforese E-gelLife TechnologiesG6400, G6500, G6512ST
de sódio de tampão Sequências sequências de DNA integradas PVDF de cultura de tecidos de cultura de tecidos de 6 poços de vórtice qPCR UV

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21(2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591(2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028(2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399(2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178(2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046(2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110(2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452(2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Intera es da L mina NuclearSistema de Express o LentiviralFragmenta o de DNAEletroforese em GelAn lise por Bioanalyzer

Artigos relacionados