DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

Feinan Wu; Brennan G. Olson; Jie Yao

doi:10.3791/53620

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Artigo de método

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

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DOI:

10.3791/53620

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27 de janeiro de 2016

Feinan Wu¹ , Brennan G. Olson¹ , Jie Yao¹

¹Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um ensaio por acoplamento de identificação do DNA adenina metiltransferase (DamID) para sequenciamento de alta taxa de transferência (DamID-seq). Este método melhorado fornece uma resolução mais alta e uma maior gama dinâmica, e permite analisar os dados DamID-seq em conjunto com outros dados de sequenciação de alto rendimento tal como Chip-SEQ, ARN-SEQ, etc.

Resumo

O ensaio de identificação da DNA adenina metiltransferase (DamID) é um método poderoso para detectar interações proteína-DNA localmente e em todo o genoma. É uma abordagem alternativa à imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Uma proteína de fusão expressa consistindo da proteína de interesse e da adenina metiltransferase do DNA de E. coli pode metilar a base adenina em motivos GATC próximos aos locais de interações proteína-DNA. Fragmentos de DNA metilados com adenina podem então ser especificamente amplificados e detectados. O ensaio DamID original detecta as localizações genômicas de fragmentos de DNA metilado por hibridização com microarrays de DNA, que é limitada pela disponibilidade de microarrays e pela densidade de sondas predeterminadas. Neste artigo, relatamos o protocolo detalhado de integração do sequenciamento de DNA de alto rendimento no DamID (DamID-seq). O grande número de leituras curtas geradas a partir do DamID-seq permite detectar e localizar interações proteína-DNA em todo o genoma com alta precisão e sensibilidade. Usamos o ensaio DamID-seq para estudar as interações genoma-lâmina nuclear (NL) em células de mamíferos e notamos que o DamID-seq fornece uma alta resolução e uma ampla faixa dinâmica na detecção de interações genoma-NL. A abordagem DamID-seq permite sondar associações NL dentro de estruturas gênicas e permite comparar mapas de interação genoma-NL com outros dados genômicos funcionais, como ChIP-seq e RNA-seq.

Introdução

ADN identificação adenina metiltransferase (DamID) ^1,2 é um método para detectar interacções proteína-ADN in vivo e é uma abordagem alternativa para a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ^3. Ele usa uma quantidade relativamente baixa de células e não necessita de reticulação química de proteína com ADN ou um anticorpo altamente específico. O último é particularmente útil quando a proteína alvo é frouxamente ou indirectamente associada com o ADN. DamID tem sido utilizado com êxito para mapear locais de ligação de uma variedade de proteínas, incluindo as proteínas do envelope nuclear ^4-10, proteínas de cromatina associada crom....